Abstract
Selv om målretting av kreftceller ved hjelp av narkotika levere nanocarriers holder løftet for å bedre terapeutisk middel spesifisitet, strategi maksimere ligandaffinitet for reseptorer overuttrykt på kreftceller er suboptimal. For å bestemme designprinsipper som maksimerer nanocarrier spesifisitet for kreftceller, vi har studert en generkinetikk basert teoretisk modell av nanocarriers med en eller flere ligander som spesifikt binder disse overuttrykt reseptorer. Vi viser at kinetikk som ligger til systemet spiller en viktig rolle i å bestemme spesifisitet og faktisk kan utnyttes for å oppnå størrelsesordener forbedring av spesifisiteten. I motsetning til den nåværende trenden av terapeutisk design, viser vi at disse spesifisitet økninger kan vanligvis oppnås ved en kombinasjon av lave priser av endocytose og nanocarriers med flere lav-affinitetsligander. Disse resultatene er stort sett robuste over endocytose mekanismer og narkotika-levering protokoller, noe som tyder på behovet for et paradigmeskifte i reseptor-målrettet levering av legemidler design
Citation. Tsekouras K, Goncharenko jeg, Colvin ME, Huang KC, Gopinathan A (2013) design av Høy spesifisitet Nanocarriers ved å utnytte ikke-likevekt Effects in Cancer Cell målretting. PLoS ONE 8 (6): e65623. doi: 10,1371 /journal.pone.0065623
Redaktør: Bing Xu, Brandeis University, USA
mottatt: 08.01.2013; Akseptert: 25. april 2013, Publisert: 26 juni 2013
Copyright: © 2013 Tsekouras et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenner støtte fra National Science Foundation tilskudd EF-1038697. AG erkjenner også støtte fra en James S. McDonnell Foundation Award, en University of California Institute for Mexico og stipend i USA (UC MEXUS), og en George E. Brown, Jr. Award. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sikker skade på friskt vev forårsaket av terapeutisk middel handlingen fortsatt et stort problem for kreftterapi, behandling begrensende effekt og anvendelighet, og til slutt går på bekostning av pasientens overlevelse. Spesifisitet kan økes via terapeutisk middel inneholdende nanocarriers utstyrt med ligander som binder reseptorer selektivt overuttrykt i kreftceller [1] – [3]. Selv om denne tilnærmingen holder løftet, med en rekke legemidler på markedet [4] og pågående forskning med fokus på nanocarrier-ligand-konjugater og på å identifisere levedyktige reseptorer [5] – [8], forekomsten av bivirkninger i nanocarrier behandlede pasienter restene en begrensende faktor. Den rasjonelle utformingen av flerverdige nanocarriers for optimal spesifisitet presenterer derfor en spennende og viktig utfordring
Flere nyere teoretiske og eksperimentelle studier [9] -. [15] har blitt motivert av relevansen av flerverdige ligand-reseptor bindende for begge nanocarrier utforming og biologiske prosesser som immunsystemets funksjon. I sammenheng med høy spesifisitet cancercellestyring har det vist seg at flerverdige nanocarriers som er utstyrt med en lav-affinitetsligander kan oppnå langt høyere dekning på celler med noe høyere reseptor-tettheter mindre enn likevektsbetingelser [3], [16]. Det er imidlertid antallet nanocarriers internalisert som er av terapeutisk betydning og ikke bare antallet i kontakt med celleoverflaten under idealiserte betingelser for likevekt. Vi forventer da at spesifisiteten vil bli styrt av de ulike tidsskalaer assosiert med endocytose, ligand-reseptor binding /uforpliktende, og metoden for levering av legemidler. Selv når man tar i betraktning enkel lineær respons i nærheten av likevekt, er det blitt funnet at størrelsen av den endocytose hastighet angir den maksimale spesifisitet [3], som peker til den kritiske betydningen av kinetikk. Faktisk, finner vi at både størrelsen av endocytose hastighet og dets funksjonelle avhengighet av antallet bundne ligander, som er styrt av den molekylære mekanisme av endocytose, har betydelige virkninger på spesifisitet.
Videre likevekt -baserte studier kan ikke ta opp ulike medikament-levering protokoller, som disse skaper tidsavhengige nanocarrier tilgjengelighet og dermed utelukke eksistensen av en stabil tilstand. I alle fall er en stabil tilstand praktisk talt umulig å oppnå
in vivo
, der naturlige biologiske sykluser, Homeostase mekanismer, og det praktiske narkotika-administrasjonen forskrifter alle konspirerer mot den. Vi utforsker disse problemene med en tilnærming som undersøker de
kinetikk
av nanocarrier-ligand komplekser bindende til friske celler og kreftceller, slik som å angi legemiddel design strategier som maksimerer målretting spesifisitet. Vi viser at der finnes toppene i den spesifisitet som en funksjon av både affiniteten og antallet ligander, noe som tyder på at det foreligger optimale nanocarrier motiver med et stort antall meget svakt bindende individuelle ligander med ligand-receptor dissosiasjonskonstanter i mM rekkevidde. Vi viser videre at spesifisitet kan økes ved størrelsesordener ved å utnytte den kinetikken i systemet via rettet mot reseptorer som er langsomt gjennom endocytose bare i grupper og /eller ved en skjønnsom justering av tidsavhengigheten for medikamentavgivelse. Bemerkelsesverdig, optimal design regionen parameter plass viser liten variasjon selv blant signifikant forskjellige medikament-levering protokoller og endocytose mekanismer, og peker på at det finnes robuste designprinsipper.
Metoder
Vi konstruere en minimal kinetisk modell for endocytose av nanocarriers utstyrt med
N
ligander (fig. 1). Ligander uavhengig binde seg til og frigi fra individuelle reseptorer med priser, for friske celler, og for kreftceller, hvor er den faktoren som kreftceller overuttrykker reseptorer. Verdiene for disse satsene er avhengig av en rekke faktorer som for eksempel nanocarrier størrelse og ligand /reseptor-type, og som kan knyttes til standard kjemiske kinetiske konstanter ved å merke seg at og, der er den effektive reseptoren konsentrasjon i nærheten av en enkelt ligand (Fil S1), og det antas at det er et stort overskudd av mobile reseptorer. Derfor, der er dissosiasjonskonstanten og er ligand-reseptor-affinitet konstant. Uavhengighet av ligand binding, mens antatt for enkelhet, er en god tilnærming for mange flerverdige supramolekylære interaksjoner [17]. Nanocarriers inn i systemet med en inngangshastighet,, bestemmes av
for levering av legemidler protokollen
, som er den metoden der behandlingen er administrert og kinetikken første binding av nanocarriers til celleoverflaten. Vi undersøkte tre tilfeller: (i) den stabile tilstand som følge av en konstant tilførsel av nanocarriers, (ii) produktet av en enkelt høy konsentrasjon dose, og (iii) pretargeted levering hvori et ligandkompleks innføres først (i) og deretter etterfulgt senere av den aktive terapeutiske (i), som dokker med nanocarriers igjen i systemet. For denne siste protokollen, målte vi spesifisitet for et gitt
samling tidsvinduet
, hvor blir innstilt av fysiologiske tidsskalaer og tilsvarer tids utover som endocytose av aktiverte terapeutiske-nanocarrier komplekser er ubetydelig. Etter å feste til en celle, blir nanocarriers fjernes fra systemet dersom alle ligander frigi (vi ikke anser nanocarrier «resirkulering») eller hvis de går gjennom endocytose. Endocytose skjer med en hastighet, som avhengighet av antall bundne ligander vi kaller
endocytose profil
.
(A) Nanocarrier (gull) med to av fire ligander bundet på reseptorer (grønn) . (B) Mapping til en 1D random walk med konstant, sigmoidal, og lineære profiler dikterer priser av endocytose i hvert ligandbindende stat.
Hver nanocarrier kan da bli representert av en 1D tilfeldig turgåer på den diskrete intervall mellom et absorberende barriere på 0 og et reflekterende barriere på
N
, med en hastighet på partikkel tap på hvert sted (fig. 1B). På tid, en rullator i posisjon
n
representerer en nanocarrier med
n
ligander bundet. Betegner sannsynligheten for at en nanocarrier har
n
ligander bundet på tidspunktet
t
som vi utledet mester ligninger for en nanocarrier festet til en frisk celle:
for, (en ) for, (2) for, (3) for en nanocarrier festet til en kreftcelle, i ligningene. 1-3 blir ganske enkelt erstattet med.
Dette system av stam ligninger kan støpt som vektoren ligning (4), hvor den delen av er, og elementene i matrisen er diktert av de aktuelle koeffisienter i stam ligningene . Eq. 4 kan da løses numerisk, med startbetingelser, for å fastslå egenvektorene og egenverdiene for ulike kombinasjoner av endocytose profiler, narkotika-levering protokoller, og verdiene av,,, og (for pretargeted levering av legemidler) samling tidsvinduer. For hver kombinasjon av legemiddel-levering protokoll og endocytose profilen vi bestemt spesifisitet, hvor og er tallet på nanocarriers endocytose av kreft og friske celler, henholdsvis. og kan beregnes som integralet over den relevante tidsvindu av den netto hastigheten på medikamentinternalisering,. Den faktor i ligningen for normaliserer for det økte antall reseptorer på kreftcellen. I tillegg til å bestemme den fullstendige numeriske løsninger for alle kombinasjoner, validert vi alle resultatene med Monte Carlo-simuleringer ved hjelp av Gillespie algoritme. Videre hentet vi en analytisk løsning for kombinasjonen av en konstant endocytose profil ved steady state i grensen som er enig med våre numeriske resultater (File S1).
Resultater
spesifisitet topper for høye tall av svakt bundet ligander
for å undersøke hvilken rolle kinetiske effekter på spesifisitet, må vi først undersøkt effekten av varierende endocytose profiler for en fast steady-state narkotika-levering protokollen. Vi er interessert i hvordan spesifisitet avhenger av følgende undergruppe av nanocarrier konstruksjonsparametre: liganden nummer og den ligand-reseptor affinitet konstant. Fig. 2A viser spesifisitet for en konstant endocytose profil, hvor. Det er et vel definert område av optimale konstruksjonsparametre, hvor spesifisiteten er vesentlig høyere enn omgivelsene. Lokalt optimale løsninger vises i en kontinuerlig kurve som strekker seg fra små topper på for store () til store topper på store for.
(A-C) Overflate kart spesifisitet under steady-state for levering av legemidler protokoll med konstant (A), lineær (B), og sigmoidal endocytose med (C). (D) Maksimal spesifisitet etter steady-state levering av legemidler og sigmoidal endocytose for ulike terskelverdier. I alle tilfeller, det totale antall ligander er, og.
Generelt for rimelige verdier av og (tabell 1), finner vi at spesifisitet topper globalt for høyt antall ligander og en dissosiasjon hastighet i størrelsesorden mm (fig. 2A). Dette kan forstås i form av den relative verdien av singelen ligand på og utenfor priser. Hvis, vil nanocarriers binde til både friske og kreftceller, mens hvis nanocarriers vil bindes til hverken celletype; både effekter redusere spesifisitet. Hvis, nanocarriers på friske celler forblir mer sannsynlig å frigi enn å binde en ligand; imidlertid, er hvis nærheten slik at, så nanocarriers på kreftceller vil være mer sannsynlig å binde enn for å frigi en ligand. Således, i dette regimet, ligandbinding velger for nanocarriers bundet til kreftceller, og de ønskede skjevhet øker når denne forhåndsvalgt populasjon trekkes inn i den neste ligand-bindende reaksjon. Derfor, i gjennomsnitt nanocarriers tilbringe mer tid bundet til kreftceller sammenlignet med friske celler, og dermed har en høyere sannsynlighet for å bli endocytose. For meget store, nanocarriers sterkt foretrekker å binde snarere enn frigi en ligand uavhengig av om de er bundet til friske eller kreftceller, noe som gir en meget høy sannsynlighet for at en nanocarrier er ikke-spesifikt endocytose. Denne sannsynligheten øker med antall ligander, som fører til spesifisitet og avtagende tendens til en (nedre grense) i den store grense. Spesifisitet på er identisk enhet, slik som øker, har en tendens til det maksimale for å tilnærming, med discreteness å sette den optimale på som går mot uendelig, et resultat som er bekreftet av våre analyser (File S1).
neste betraktes virkningen av å endre den funksjonelle form av endocytose-profilen. Fig. 2B og C viser spesifisitet for lineær endocytose profilen (5) og den sigmoide endocytose profilen (6) der er Heaviside trinnfunksjon og er den terskelverdi på hhv. Plasseringen av den globale optimale er ikke vesentlig påvirket av endringer i endocytose profil. Ved steady state spesifisitet-verdiene er like for konstant og lineær endocytose, sistnevnte som modellerer det scenario hvor hver ligand-reseptorbinding hendelse utløser en uavhengig signalkaskade som har en endelig sannsynlighet for å resultere i endocytose. I motsetning til sigmoidal endocytose, størrelsen av den optimale spesifisiteten blir betraktelig forbedret. For denne samarbeids endocytose krever flere bindende hendelser [18], er spesifisitet så forbedret fordi endocytose oppstår bare med nanocarriers i ligandbindende stater hvis relative hopetall viser den kumulative effekten av seleksjon på hvert trinn. For et fast antall ligander, fig. 2D viser at spesifisiteten øker sterkt ved størrelsesordener som verdien av terskel, som er nødvendig for å utløse endocytose øker. Denne effekten er en direkte konsekvens av spesifisiteten avhengig av kinetikken til bindings, uforpliktende, og endocytose. Disse resultatene indikerer at rettet mot reseptorer som går gjennom endocytose i et kooperativ mote kan gi betydelige forbedringer i spesifisitet.
Vi neste undersøkt effekten av varierende medikamentleverings protokoller for en fast konstant endocytose profil, igjen med fokus på hvordan spesifisitet avhenger av nanocarrier design parametere. Fig. 3A, B og C viser den spesifisitet som en funksjon av og til den stabile tilstanden, enkeltdose, og pretargeted medikament-levering protokoller, respektivt. Bemerkelsesverdig, på samme måte som i fig. 2, observerte vi en robust sett av lokalt optimale løsninger som forekommer i en kontinuerlig kurve som strekker seg fra for til store for. Det faktum at denne optimale regime ser ut til å være konservert på tvers av forskjellige protokoller antyder at generelt optimale legemiddeldesign, uavhengig administrasjonsprotokoll, er mulig. For pretargeted narkotika-levering protokoll for de samme forhold, kan man også oppnå svært store særegen bare gjennom et passende valg av samlingen tidsvindu: endringer i med en faktor på kan resultere i størrelsesordener forbedring i spesifisitet (Fig 3D.). Det bør også bemerkes at spesifisiteten er mye mer følsom for, og er bare svakt avhengig av.
(A-C) Spesifisitet for et konstant endocytose profil under steady-state (A), enkelt-dose (B), og pretargeted narkotika-levering protokoller (C). For pretargeted narkotika-levering protokollen, er samlingen tidsvinduet fra 200 til 300 sekunder. (D) Maksimal spesifisitet under pretargeted for levering av legemidler protokollen og konstant endocytose for ulike verdier av. I alle tilfeller og.
Multiplikativ forbedring i spesifisitet med optimal kombinasjon av narkotika levering protokoll og endocytose profil
Våre resultater indikerer at spesifisiteten kan bli betydelig forbedret ved uavhengig tuning narkotika levering protokollen og endocytose profil via valget av mål reseptor type. Dette tyder på at veloverveide kombinasjoner av narkotika-levering protokoll og endocytose profil kombinert med passende designparametre kan gi ytterligere økning i spesifisitet. På fig. 4A, viser vi denne forbedringen i tilfelle av pretargeted medikamentavgivelse og sigmoidal endocytose, som vi har funnet en maksimal spesifisitet opp til ganger verdien av selektiviteten forventet fra overekspresjon faktoren alene og over 300 ganger spesifisitet for kombinasjonen av steady- state levering og konstant endocytose, som er den nærmeste etterligne til likevekt forhold. Effekten synes å være multiplikativ, med bare beskjedne () øker forventet på grunn av samvirke endocytose (fig. 2D) eller pretargeted levering (Fig. 3D) alene.
(A) Kombinasjonen av pretargeted medikament-leveringsprotokoll og sigmoidal endocytose viser høyest spesifisitet av alle kombinasjoner undersøkt. ,, Terskel på. (B) Maksimal spesifisitet på tvers av alle kombinasjoner. ,, For sigmoidal endocytose, og 200-300 sek for pretargeted narkotika-levering protokollen. Heltrukne linjer tilsvarer og. (C) Effekter av overekspresjon faktor på spesifisitet over narkotika-levering protokoller for konstant endocytose profil på,. Spesifisiteten stiger kraftig på. (D) Effekter av endocytose rate (normalisert ved) over narkotika-levering protokoller for konstant endocytose profil på,,.
Selv om den optimale regionen var stort sett er konsistent over protokoller eller endocytose profiler når en eller andre ble løst, ønsket vi å finne ut om dette forble tro for vilkårlige kombinasjoner. Fig. 4B viser de maksimale særegen for alle kombinasjoner av narkotika-levering protokoll og endocytose profil. Det er en klar gruppering av de optimale løsninger for alle kombinasjoner langs en region som strekker seg fra for store til store for lav. Mens vi forklarte den optimale for øvrig, den globale optimale for lav er av stor interesse. Som diskutert ovenfor, bør dette regimet omtrent tilsvarer situasjonen når en nanocarrier bundet med en ligand til en kreftcelle er marginalt større sannsynlighet for å binde en annen ligand. Dette betyr eller. Med asymptoten ved store vesen, kommer en på heuristisk regel, der er en konstant som er avhengig av, og. Fig. 4B viser to slike kurver med forskjellige verdier av for sammenligning.
Siden de optimale designløsninger og tilhørende særegen avhenge og viser vi de avhengigheter i fig. 4C og D over narkotika-levering protokoller for en fast konstant endocytose profil. Spesifisiteten stiger kraftig for en verdi av som er omtrent konstant over hele protokoller. Siden denne verdien av er bestemt av konstruksjonsparametere og valg av reseptoren (se Arkiv S1 for detaljer), en annen strategi for å oppnå høy spesifisitet, er å velge en reseptor for hvilken dens typiske overekspresjon faktor er like over denne verdien. Dette sikrer at eventuelle kreftceller med er rettet med høy spesifisitet. Faktisk var dette også identifisert som en mekanisme for super-selektivitet i likevekt studier [16]. Den kinetiske virkningene av stoffet levering protokollen påvirke betydelig selve selektivitet nær, med pretargeted protokollen har størst spesifisitet ekstrautstyr. Til slutt, observerte vi at spesifisiteten generelt avtar med økende endocytose hastighet (fig. 4D), som indikerer at reseptorene som blir resirkulert saktere er potensielt bedre mål. Denne spesielle avhengighet kan også oppstå i en helt annen sammenheng: akselerert etablering av morfogen gradienter i nærvær av nedbrytning, som kan beskrives med lignende ligninger [19]
Diskusjoner
I konklusjonen. vi har vist at spesifisitet topper oppstå som en funksjon av både affiniteten og antallet ligander, noe som tyder på at det foreligger optimale nanocarrier design. Overall, komplekser med individuell ligand i mM rekkevidde () og et stort antall ligander per operatør har designelementer som gir høy spesifisitet i våre simuleringer. Dette optimal region av design parameter plass er robust på tvers av narkotika-levering protokoller og endocytose mekanismer. Den nøyaktige spesifisitet peak størrelse og skarphet kan tilpasses gjennom nøye utvalg av parametere eller administrasjons strategier. Mulige strategier for å øke spesifisiteten inkludere rettet mot reseptorer som utløser endocytose bare hvis bundet i grupper og /eller har en lav samlet endocytose rente, og utnytte pretargeted levering av legemidler med lang ventetid.
Det bør bemerkes at økt spesifisitet kommer på bekostning av å ha en lavere samlet antall endocytose nanocarriers. Selv om vi antatt at doseringen kan økes etter behov, i klinisk praksis kan det være andre faktorer som for eksempel nyre evne til å tømme medikamentet fra kroppen som kan begrense evnen til å maksimere spesifisitet. For å ta opp generelle designprinsipper og strategier, valgte vi også å ignorere en rekke andre konkrete systemegenskaper, inkludert muligheten for at er tidsavhengig, interaksjoner mellom ligander, og detaljer om nanocarrier kompleks geometri (se Fil S1 for detaljer).
Totalt vårt arbeid utfyller likevekts studier som [16], ved å vise at det er mulig å designe svært høy spesifisitet komplekser for ikke-likevektsbetingelser. En bestemt fordel med vår tilnærming ved bruk av lav-affinitets flerverdige nanocarriers er at det reduserer behovet for høy spesifisitet ligander, som vanligvis er av høy molekylvekt (så som antistoff-fragmenter) og kan føre til legemidler som har dårlig biotilgjengelighet [20] . Det skal bemerkes at arbeidet ikke er fokusert på en enkelt biologisk system, men i stedet tar for en hel klasse av biologiske, kjemiske og bioteknologi problemer. Ved å fokusere på bare fysiske størrelser og ikke den spesifikke kjemiske, biologiske og kliniske funksjoner for hver mulig system, har vi utledet brede, generelle og overordnede designprinsipper. Våre resultater kan derfor potensielt brukes på prosesser som handel av noen svært spesifikke gjenkjenningsseter versus et større antall av mindre spesifikke områder; for eksempel, for å utforme en kolonne for å optimalt separate kjemikalier eller å konstruere DNA-sekvenser med en overrepresentasjon av visse antall av motiver. Det er også av interesse å merke seg at suksessive ligand-reseptor-bindende reaksjoner satt opp et multiplum reaksjonstrinn fremgangsmåte lignende kinetisk korrektur [21] som sterkt øker forholdsvis lav forspenning mot bindings på kreftceller. Således, etter hvert som antall trinn øker, kan spesifisiteten bli svært høy. Imidlertid, i motsetning til i kinetisk korrektur, energi blir ikke brukt til å forspenne hvert reaksjonstrinn, med den resulterende omkostningene er den totale reduksjon av nanocarrier endocytose sannsynlighet. Til slutt, gitt allestedsnærværelsen av flerverdige lav-affinitets interaksjoner og den iboende ikke-likevektsmiljø i biologi, er det mulig at naturen allerede utnytter mekanismen har vi diskutert for å oppnå betydelige forbedringer i spesifisitet i forhold til grensene diktert av likevekts.
Hjelpemiddel Informasjon
fil S1.
Inneholder støtteinformasjon på forutsetninger i vår modell om reseptoren tilgjengelighet og ligand gjensidig avhengighet, rente avhengigheter, definisjoner av og, og en analytisk løsning av master ligninger og fastsettelse av spesifisitet for tilfelle av steady state med konstant endocytose profil. Figur S1, Surface plott av spesifisitet som en funksjon av og som viser en rygg som strekker seg mot store verdier av (ut på siden). For fast og stor, spesifisitet som en funksjon av har en topp ved. Her og. Figur S2, Crossover verdi av overekspresjon faktor som en funksjon av affinitet, og antall ligander, (innfelt). for begge tomter, for hovedhandlingen og for nedfelling. Generelt har en tendens til kvalitativt følge oppførselen til spesifisitet for de samme parameterverdier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0065623.s001 product: (PDF)
