Abstract
Bakgrunn
Årsakene til sekundær kreft i barndommen kreft overlevende er i stor grad uklart. Eksponering av normale somatiske celler overfor stråling og /eller kjemoterapi kan skade DNA, og hvis ikke alle DNA-lesjoner er skikkelig festet, kan det hende at mis-reparasjon føre til patologiske konsekvenser. Det er sannsynlig å anta at genetiske forskjeller, dvs. i de samme veiene som er ansvarlige for cellesykluskontroll og DNA-reparasjon, spille en avgjørende rolle i utviklingen av sekundær kreft.
Metodikk /Funn
For å identifisere faktorer som kan påvirke mottakelighet for andre kreftdannelse, rekrutterte vi 20 personer som overlevde en barndom kreft og deretter utviklet en andre kreft samt 20 nøye matchet kontrollgruppe personer med barndommen kreft, men uten andre kreft. Ved antistoff mikromatriser, vist vi primære fibroblaster av pasienter som matcher for forskjeller i mengden av representative DNA reparasjon assosierte proteiner. Vi har funnet konstitutivt redusert nivå av RAD9A og en rekke andre DNA-reparasjons proteiner i to-kreftpasienter, sammenlignet med en-kreftpasienter. Den RAD9A proteinnivået øket i respons til DNA-skade, men i mindre grad i de to-kreftpasienter. Kvantifisering av mRNA uttrykk ved real-time RT PCR viste lavere
RAD9A
mRNA nivåer i både ubehandlet og 1 Gy y-bestrålte celler av to kreftpasienter.
Konklusjon /Betydning
Samlet våre resultater støtter ideen om at modulering av RAD9A og andre cellesyklus arrest og DNA reparasjon proteiner bidrar til risikoen for å utvikle en sekundær malignitet i barndommen kreftpasienter
Citation. Weis E, Schoen H, Victor A, Spix C, Ludwig M, Schneider-Raetzke B, et al. (2011) Redusert mRNA og protein uttrykk av Genomisk Vaktmester RAD9A i Primær Fibroblaster av Personer med Barndom og annen selvstendig kreft. PLoS ONE 6 (10): e25750. doi: 10,1371 /journal.pone.0025750
Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrike
mottatt: 1 juli 2011; Godkjent: 09.09.2011; Publisert: 03.10.2011
Copyright: © 2011 Weis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Stiftung Rheinland-Pfalz für Innovation (prosjekt nr. 698) og Fazit-Stiftung. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I de fleste tilfeller er kreft en multifaktoriell sykdom forårsaket av miljøfarer, usunn livsstil og /eller genetiske faktorer [1]. Fordi barn er vanligvis mindre utsatt for et ugunstig miljø eller livsstil enn voksne, genetiske faktorer vil trolig bli en viktigere [2]. Men har bare en liten andel (1-10%) av kreft hos en kjent genetisk etiologi [3]. Det er vel kjent at bestrålings og andre DNA-ødeleggende midler anvendt for behandling av kreft er i stand til å utløse dannelsen av leukemi og andre kreftformer [4], [5]. Stråling og /eller kjemoterapi utgjør risikofaktorer for utvikling av en andre malignitet, som ikke kan klassifiseres som ettergivelse av den primære tumor. Fordi relativt få barndommen kreft overlevende utvikle en sekundær malignitet [6], kan genetisk predisposisjon være involvert.
Celler er stadig utsatt for endogene og eksogene DNA-skadelige stoffer. Det er flere veier som overvåker og vedlikeholder genom integritet. Cellene har flere sjekkpunkter som forbigående forsinker cellecyklusprogresjonen å beregne ekstra tid for DNA-reparasjon eller indusere apoptose [7], [8]. Mutasjoner eller avvikende regulering av gener som styrer cellesyklus sjekkpunkter og DNA-reparasjon spille viktige roller i tumorigenesis [9], [10] og er førsteklasses kandidater når du søker etter gener moduler risikoen for sekundær kreft. Hvis terapi-indusert DNA skade er misrepaired, kan dette sette i gang andre svulstutvikling. Genetisk predisposisjon kan føre til økt kromosomal ustabilitet etter strålebehandling eller kjemoterapi, [5], [11], [12]. Bare i svært sjeldne tilfeller av andre barndom malignitet en genetisk ustabilitet syndrom som Fanconi anemi, ataksi teleangiectasia eller xeroderma pigmentosum har blitt diagnostisert [10]. I de fleste tilfeller årsakene underliggende utvikling av et sekund kreft er fortsatt ukjent.
For å teste hypotesen om at modulasjoner i uttrykket av cellesyklus kontroll og DNA-reparasjonsgener er forbundet med sekundær kreft, vi analyserte primære fibroblaster fra barndommen kreftpasienter med andre kreft (2c pasienter) og nøye matchet kontroller uten andre kreft (1c pasienter). Hud fibroblaster representerer en normal somatisk celletype. I motsetning til blod og EBV-transformerte lymfoblaster, som kan være lettere erholdt, primære fibroblaster utgjør en homogen cellepopulasjon med intakte cellesyklus og DNA-reparasjonssjekkpunkter. Så langt har det bare vært noen få studier på primære fibroblaster av kreftpasienter. Fibroblaster bryst og tyroideacancer ble funnet å ha defekte reparasjon og /eller cellesyklusregulering [13]. Unormal genuttrykk i somatiske celler i upåvirket foreldrene til retinoblastom pasienter er også i overensstemmelse med en arvelig predisposisjon for utvikling av kreft [14].
For å identifisere resistensfaktorer for andre kreftdannelse, vi skjermet ulike DNA-reparasjon forbundet gener for konstitutive protein expression forskjeller i 2C versus 1C pasienter. Den DNA-skade sjekkpunkt protein RAD9A ble nedregulert i både ubehandlet og bestrålt somatiske celler fra to-kreftpasienter, sammenlignet med en-kreftpasienter. Økte konstitutive og DNA-skader indusert nivåer av RAD9A protein og andre genomiske vaktmester kan bidra til å opprettholde genom stabilitet og hindre andre svulstutvikling etter stråling og kjemoterapi. RAD9A, som i enkelte papirer kalles hRAD9 eller rett og slett RAD9, er en interessant kandidat, fordi den fungerer i flere reaksjonsveier, inkludert DNA-reparasjon, cellesyklus kontrollpunkt kontroll og apoptose og dens unormal ekspresjon har vært knyttet til tumorgenese [15], [16 ].
Resultater
Rekruttering av pasienter
Tjue personer som overlevde en barndom kreft og deretter utviklet en andre kreft ble rekruttert fra den tyske kreft Registeret. I minst ett år må ha gått siden diagnose av andre kreft. Tjue matchet tilfeller som overlevde en barndom kreft og ikke utviklet en andre kreft ble tilfeldig valgt fra Registeret. De samsvarende kriteriene var samme kjønn, lik primære kreftdiagnose, lik alder ved første diagnose, og samtidig under observasjon. Fordi de primære svulster matchet en- og to-kreftpasienter ble diagnostisert i samme år, de behandlingsmetoder var stort sett identiske. Alle pasientene ble fulgt opp fra primærkreftdiagnose til den tiden da de ble rekruttert.
Pasientene måtte være i live og minst 18 år (myndig i Tyskland) for å gi sitt samtykke til hudbiopsi . Mindre enn 50% av de i kontakt med to kreftpasienter bestemte seg for å delta i studien. På grunn av disse inklusjonskriteriene, kunne vi bare rekruttere et begrenset antall to-kreftpasienter i hele Tyskland. Det er en viss skjevhet i fordelingen av primære og sekundære kreftformer. For eksempel, den hyppigste kombinasjonen av akutt myelogen leukemi etter akutt lymfoid leukemi har en meget ugunstig prognose og derfor ikke er representert. På den annen side, er sekundære skjoldbruskkjertelen carcinoma overrepresentert, fordi pasientene har en god prognose og når voksen alder.
Reduserte nivåer av DNA-reparasjon assosierte proteiner i celler med to-kreft pasienter
Customized antistoff mikromatriser (for eksempel, se figur 1) ble brukt for å sammenligne konstituerende uttrykk nivåer (uten induksjon av DNA-skade) av forskjellig DNA reparasjon assosierte proteiner i eksponentielt voksende primære fibroblaster fra barndommen kreftpasienter med og uten andre svulst, henholdsvis. De 19 undersøkte genene (tabell 1) ble valgt, fordi de er sentrale aktører i ulike DNA-reparasjons baner (dvs. DNA dobbel tråd pause reparasjon, nucleotide excision reparasjon, basen excision reparasjon og mismatch reparasjon), som deltar enten i signalisering av DNA-skade , sjekkpunkt kontroll og /eller DNA reparasjon. Mutasjoner i mange av disse genene er kjent for å disponere for utvikling av kreft.
Forskjellige mengder (ca. 1,5, 1,0 og 0,5 pg) av anti-RAD9A antistoff (2 ng /ul) er oppdaget i tre paralleller på nitrocellulose -belagte objektglass og inkubert med fluorescens-merkede kjerneproteinekstrakt av ubehandlede fibroblaster fra to-kreftpasient 2C-7 og den samsvarende ett-kreftpasient 1C-7, henholdsvis. Anti-ACTB fungerer som positiv og spotting buffer som negativ kontroll. Den målte 2C /1C RAD9A protein ratio er 0,5.
For hver matchet (2C vs. 1C) pasient par vi bestemt z forholdet mellom tre eksemplarer målinger av proteinnivåer (normalisert med log10 transformasjon og z-score). Seks av de 19 testede proteiner, som representerer forskjellige DNA-reparasjonsbaner, som hadde lavere nivåer i to-kreftpasienter (tabell 1). Boksplottene i figur 2 stede fordelingen av z forholdstall for BRCA1 (-1.36x; p = 0,017), DDIT3 (-1.27x; p = 0,011), MSH6 (-1.16x; p = 0,021), TP53 (-1,18 x; p = 0,003), RAD9A (-1.38x; p = 0,040), og RAD51 (-1.37x; p = 0,009). P-verdiene ble ikke korrigert for multippel testing og bør betraktes som utforskende. For å demonstrere påliteligheten av de antistoff mikromatriser, ble Western blot-analyse av RAD9A utført på et representativt matchende par. Den anti-RAD9A antistoff farget forventet 45 kDa band i atomproteinekstrakter, mens ingen eller bare et svakt bånd ble sett i cytoplasmatiske ekstrakter (Fig. 3). I samsvar med antistoffet microarray (fig. 1), Western blot viste en mindre mengde (60%) av RAD9A protein i 2C pasienten, sammenlignet med det samsvar 1C pasienten.
De relative uttrykk nivåer i fibroblaster av 2C versus 1C pasienter er -1.36x (p = 0,017) for BRCA1, -1.27x (p = 0,011) for DDIT3, -1.16x (p = 0,021) for MSH6, -1.18x (p = 0,003) for TP53, – 1.38x (p = 0,040) for RAD9A, og -1,37 (p = 0,009) for RAD51. Protein uttrykket ble målt ved antistoff mikromatriser (normalisert ved log10 transformasjon og z-score). Boksplott viser fordelingen av z forholdstall i matchet 2C vs 1C pasienter. Median er representert ved horisontale linjer. Bunnen av boksen indikerer 25
th persentil, toppen 75
th persentil. De T barer strekker seg fra boksene til på de fleste 1,5 ganger høyden av esken. Slengere er vist som åpne sirkler.
gel på venstre side viser Coomassieblå farging av kjernefysiske og cytoplasmatiske proteinekstrakter (30 mikrogram hver) fra ubehandlede fibroblaster med to-kreftpasient 2C-7 og matchet ett-kreftpasient 1C-7. Den tilsvarende gel på høyre side er farget med anti-RAD9A antistoff, som gjenkjenner et 45 kDa-kjerneprotein. Den beregnede 2C /1C RAD9A protein ratio er 0,6.
De seks proteiner som viser konstituerende uttrykk forskjeller ble også kvantifisert i celler på 1 time og 4 timer etter en Gy γ-bestråling. For hver pasient, vi sammenlignet proteinnivået målt ved antistoff mikromatriser i behandlet kontra ubehandlede prøver. To proteiner, RAD9A og DDIT3, skilte seg i deres cellulære svar på DNA-skade mellom 2C og 1C pasienter. Boksplottene i figur 4 viser z forholdstall for RAD9A (etter normalisering med log10 transformasjon og z score) i 2C og 1C gruppen. I begge gruppene de RAD9A protein nivåer ble forhøyet etter DNA-skader. I en-kreft gruppen ble RAD9A overuttrykt mer enn dobbelt 1 time og 4 timer etter bestråling, i forhold til den konstitutive proteinnivået. I 2C gruppe, er mengden av protein RAD9A økt 1.76- og 1,63 ganger ved 1 time og 4 timer, henholdsvis, noe som tyder på en lavere induksjon (-1.44x, p = 0,012 ved 4 h) ved DNA-skade i barndommen med kreftpasienter en andre tumor. I likhet med RAD9A, er kodet av DNA-skade induserbar transkripsjon protein
DDIT3
ble også funnet å være økt hos bestrålte celler (Fig. 3). I 1C pasienter, ble proteinnivået forhøyet 1.40- og 1,96 ganger 1 time og 4 timer etter DNA-skade, sammenlignet med 1.26- og 1,95 ganger i 2C-gruppen. På en time etter bestråling var det en lavere induksjon (-1.13x, p = 0,019) i de to-kreft gruppe.
Differensial induksjon av RAD9A (venstre side) og DDIT (høyre side) på 1 time og 4 timer etter en Gy γ-bestråling i fibroblaster med to-kreftpasienter (grå bokser) og ett-kreftpasienter (stiplede bokser). Protein uttrykket ble målt ved antistoff mikromatriser (normalisert ved log10 transformasjon og z-score). Box plott viser fordelingen av z-forhold av behandlede sammenlignet med ubehandlede celler av samme pasientene. Median er representert ved horisontale linjer. Bunnen av boksen indikerer 25
th persentil, toppen 75
th persentil. De T barer strekker seg fra boksene til på de fleste 1,5 ganger høyden av esken. Slengere er vist som åpne sirkler. DNA-skadeinduserte økningen i 2C-gruppen er lavere enn det i den 1C gruppe for RAD9A ved 4 timer etter bestråling (-1.44x, p = 0,012) og for DDIT3 ved 1 time etter bestråling (-1.13x, p = 0,019 ).
Redusert RAD9A mRNA uttrykk nivåer i to-kreft pasienter
Fordi RAD9A protein ble mest dramatisk nedregulert i to kreftpasienter, fokuserte vi vår videre studier på dette cellesyklus sjekkpunkt og DNA reparasjon protein. Vi utførte kvantitative mRNA uttrykk analyser av real-time RT PCR både ubehandlede og bestrålte celler. Boksplottene i figur 5 stede fordelingen av uttrykk forholdstall på 20 matchet par av pasienter. De konstitutive
RAD9A
mRNA-nivåer (uten induksjon av DNA-skade) var signifikant lavere i to-kreftpasienter (-2.40x, p = 0,004), sammenlignet med en-kreftpasienter. Mellom-gruppe forskjeller ble også observert ved 1 time (-2.54x, p = 0,003), 4 h (-2.62x, p = 0,003), og 24 timer (-2.54x, p = 0,003) etter bestråling. Tre matchet par representere uteliggere eller ekstreme uteliggere i boksen diagrammer, noe som indikerer at relativ
RAD9A
uttrykk nivåer kan betydelig variere mellom pasienter og er ikke alltid redusert i to kreftpasienter. De (ekstrem) uteliggere representerer ulike kombinasjoner av primær og sekundær kreft.
RAD9A
mRNA nivåer i ubehandlet og bestrålt (1 t, 4 t og 24 timer etter en Gy) fibroblaster av to- kreftpasienter, sammenlignet med matchede en-kreftpasienter. mRNA ble kvantifisert ved sanntids RT-PCR (normalisert med den ΔΔCT fremgangsmåte og to endogene kontrollgener). Boksplott viser fordelingen av uttrykket forholdstall i matchet 2C vs. 1C pasienter. Median er representert ved horisontale linjer. Bunnen av boksen indikerer 25
th persentil, toppen 75
th persentil. De T barer strekker seg fra boksene til på de fleste 1,5 ganger høyden av esken. Slengere er vist som åpne sirkler, ekstreme rammer som trekanter. To-kreftpasienter viser redusert
RAD9A
mRNA-nivåer uten induksjon av DNA-skade (-2.40x, p = 0,004), samt ved 1 h (-2.54x, p = 0,003), 4 timer (-2,62 x, p = 0,003), og 24 timer (-2.54x, p = 0,003) etter bestråling.
Fordi det har blitt rapportert at
RAD9A
uttrykk er avhengig av DNA metylering [17], vi bestemt metylering status for den antatte cis-regulatoriske region av bisulfit pyrosekvensering. I forhold til klassisk bisulfitt plasmid-sekvensering, kan bisulfitt pyrosekvensering bare analysere et begrenset antall CpG områder som ligger på det meste 30 til 50 bp 3 «fra sekvenseringsprimeren, men på den annen side kan det mye mer nøyaktig (± 2%) kvantifisere CpG metylering nivå. Den analyserte DNA-segment, som inneholder tre tilstøtende CpG-områder, ble funnet å være unmethylated i ubehandlede celler av både 2C og 1C pasienter. Utvalget av metylering verdier var 4-10%, som forventet for et transkripsjonelt aktivt gen. Det var ingen signifikant mellomgruppeforskjell metylering, noe som kan forklare den observerte ekspresjon forskjell. Fordi tettheten av denaturert CPGs framfor enkeltsider i en CpG island slå et gen på eller av [18], [19], den gjennomsnittlige metylering av noen CPGs kan vanligvis fungere som en representant epigenetisk markør for en gitt cis-regulatoriske region .
kromosom 11q13.1 inneholder
RAD9A
genet er ofte forsterket i en rekke humane tumorer [17]. For å utelukke
RAD9A
kopiere antall variasjoner mellom 2C og 1C pasienter, utførte vi høy oppløsning karyotype analyser med Affymetrix Genechip Genome Wide Menneskelig SNP rekke 6.0 samt kvantitativ real-time PCR. Begge metodene avdekket to eksemplarer av
RAD9A
genet i alle undersøkte pasienter.
Diskusjoner
I forhold til den enorme innsatsen til karakteriserer transcriptomes og proteom av kreftceller, er det relativt få studier som søker etter genuttrykk forskjeller i normale somatiske celler i kreftpasienter [13], [14]. For å teste hypotesen om at forskjeller i DNA-reparasjon av veier kan påvirke risiko for å utvikle en andre svulst etter behandling av kreft hos barn, har vi sammenlignet konstitutive nivåene av DNA-reparasjons-assosierte proteiner i primær-fibroblaster av passet to-kreft og en-kreftpasienter. Fordi vi ikke forvente dramatiske forskjeller, men heller subtile modulasjoner i DNA-reparasjon kapasitet i to kreftpasienter, har vi ikke utfører et genom-wide screen men testet bare et begrenset antall kjente DNA reparasjonsassosierte gener ved hjelp av svært følsom antistoff mikromatriser. Observasjonen om at 6 av 19 testede DNA repair-assosierte proteiner ble konstitutivt nedregulert i normale celler med to-kreftpasienter fremmer ideen om at DNA-reparasjonsveiene for to-kreftpasienter er mindre i stand til å håndtere DNA-skade enn de av en-kreftpasienter . For to proteiner viste vi også en lavere induksjons etter DNA-skader. Ett gen,
RAD9A
ble analysert nærmere. Begge konstitutiv mRNA-ekspresjon i eksponentielt voksende fibroblaster, så vel som DNA-skade indusert ekspresjon på forskjellige tidspunkter etter bestråling var lavere i to-kreftpasienter enn i en-kreftpasienter. I lys av dette, er RAD9A en god kandidat for en faktor som disponerer for andre kreft. Differensial
RAD9A
uttrykk ble ikke formidlet av DNA metylering eller kopiere nummeret variasjon.
RAD9A
genet er evolusjonært svært konservert fra gjær til mannen, som er generelt ansett som en god indikator for funksjonell betydning. Det fungerer på flere baner inkludert basen excision, homolog rekombinasjon og mismatch reparasjon samt cellesyklus sjekkpunkt kontroll og apoptose. Mange av funksjonene synes å være mediert av atom RAD9A-HUS1-Rad1 proteinkompleks som ligner PCNA [15], [16]. Mus
Rad9
–
/
– og i mindre grad
Rad9
+ /
– knockout celler [20] og menneskelig RNAi knockdown celler med redusert
RAD9A
nivåer [21] er følsomme for ulike typer DNA-skader, viser genom instabilitet, DNA-reparasjon mangel og endrede cellesyklus sjekkpunkter. Embryonale dødelighet av musen
Rad9
–
/Anmeldelser – mutasjon indikerer at flere funksjoner av Rad9A er avgjørende for embryogenese og normal utvikling. Mus med målrettet
Rad9
–
/Anmeldelser – sletting i keratinocytter er svært utsatt for genotoxin-indusert hud svulstdannelse [22], [23].
Rad9
–
/Anmeldelser – keratinocytter vise et høyere antall spontane og genotoxin-indusert DNA pauser, avvikende cellesyklus distribusjon og en økt forekomst av apoptose. Dette er i overensstemmelse med det syn at RAD9A fungerer som en tumor suppressor på hud og annet vev ved å fremme DNA-reparasjon i skadede celler og stabilisering av genomet før tumorigenesis inntreffer. Det er interessant å merke seg at både nedregulering og oppregulering av
RAD9A
har vært forbundet med tumorigenesis.
RAD9A
overekspresjon er blitt observert i en rekke tumorer, inkludert bryst [17], lunge [24], skjoldbruskkjertel [25], og prostatakreft [26]. Dette tyder på at
RAD9A
kan også fungere som et onkogen, mest sannsynlig av avvikende trans av nedstrøms målgener. Generelt,
RAD9A
nivå korrelert med tumorstørrelse og /eller scene.
tilhører RAD9A
til en voksende gruppe av gener med doble roller i kreft. Avhengig av celletypen og vev miljø, kan det vise enten tumor-fremmende eller tumor-undertrykkende aktivitet [15]. Mekanismer som multifunksjonelle RAD9A protein fungerer som et onkogen og tumor suppressor, henholdsvis er i stor grad ukjent.
Fordi antall to-kreftpasienter blir 18 år eller eldre er relativt liten, kunne vi ikke begrense vår studerte pasientene til en spesifikk tumor enhet eller behandlingsprotokoll. Den største undergruppen av primære svulster var lymfoid leukemi (10 tilfeller). På grunn av deres god prognose, ble skjoldbruskkjertelen karsinom (6 tilfeller) overrepresentert som andre kreftformer. Strålebehandling er en viktig risikofaktor for thyroideakarsinom [27]. I lys av dette, er det fristende å spekulere i at det overflod av RAD9A protein kan modulere risikoen for stråling-indusert svulster. Fremtidige mer omfattende studier bør vurdere effekten av ulike behandlingsmetoder for kreft hos barn. Men som skissert ovenfor, rekruttere homogene pasientgrupper er ekstremt utfordrende. Vi fikk hud biopsier og blodprøver fra alle våre studert pasienter. Fordi mange pasienter ble transplantert benmarg, ble blodcellene ikke analysert. Fibroblastkulturer ble etablert en eller flere år etter andre kreftdiagnose /behandling, noe som gjør det usannsynlig at uttrykket forskjellene mellom to-kreft versus en-kreftpasienter er direkte eller indirekte påvirket av stråling eller kjemoterapi. Selv om det er rimelig å anta at dyrkede fibroblaster representerer situasjonen i normale celler i kroppen, vil det være ønskelig å også studere uncultured celler og /eller andre vev.
Antall analyserte pasienter som er forholdsvis liten. Ikke desto mindre tyder våre resultater at de konstitutive RAD9A proteinnivåer, så vel som graden av induksjon etter DNA-skade variere mellom to-kreft og en-barndommen kreftpasienter. Vi foreslår at RAD9A fungerer som tumor suppressor i hudfibroblaster og andre normale celler i kroppen, og således bidrar til å hindre andre kreft. Analyse av ulike normale celletyper i større pasientgrupper, for eksempel voksne kreftoverlevere er nødvendig for å støtte en rolle for RAD9A i DNA-skader indusert kreftutvikling.
Materialer og metoder
Pasientprøver
Den tyske Childhood Kreftregisteret har samlet nesten helt alle barnekreft i Tyskland siden 1980, gjennomfører en åpen ende oppfølging med vekt på andre svulster. Med hjelp av Registeret rekrutterte vi 20 personer som overlevde en barndom kreft og da, uten tilknytning til den første hendelsen, utviklet en ny kreft (2C pasienter) samt 20 nøye matchet personer [samme kjønn, samme primære kreft (ICCC klassifisering ), lik alder (± 1 år) ved første diagnose] som ikke utviklet en andre malignitet (1C pasienter). Genetisk veiledning ble tilbudt og informert skriftlig innhold ble innhentet fra alle pasienter som deltok i studien, som ble godkjent av etikkomiteen av Medical Association of Rheinland-Pfalz (nr 837.440.03 [4102]).
gjennomsnitts~~POS=TRUNC alderen~~POS=HEADCOMP ved diagnose av den første svulsten var 6,8 år (fra 0-14) i begge gruppene. Den primære svulster var akutt myeloid eller lymfoid leukemi (11 tilfeller), Hodgkin eller Burkitt lymfom (5 tilfeller) og andre solide tumorer (4 tilfeller). Gjennomsnittsalderen på andre diagnose i 2C gruppen var 16,7 år (fra 9-30). Den andre svulster var myelodysplastisk syndrom eller lymfom (7 tilfeller), skjoldbruskkjertelen carcinoma (6 tilfeller) og andre solide tumorer (7 tilfeller). Andre svulster ble bekreftet av erfarne kliniske onkologer å være noen tilbakefall eller alternative manifestasjoner av primær svulst.
Hud biopsier ble tatt tidligst ett år, vanligvis flere år etter andre kreftbehandling. Primær fibroblast-cellekulturer ble etablert fra hud biopsier og dyrket i minimalt essensielt medium med Earls salter (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), supplert med 10% føtalt bovint serum, vitaminer og antibiotika. Celler (uten DNA skade) ble høstet fra eksponentielt voksende subsammenflytende kulturer. For å indusere DNA-reparasjon, ble subsammenflytende kulturer utsatt for en Gy ioniserende stråling ved hjelp av en GammaCell 2000 (Cs137) irradiator. Prøver ble tatt 1 time, 4 timer og 24 timer etter bestråling. Cellene ble vasket to ganger med PBS og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Western blot og antistoff microarray
For kjerneproteinutvinnings celler ble resuspendert to ganger i 500 ul 10 mM HEPES , 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, pH 7,9 og inkubert på is i 10 min. Etter 10 s sentrifugering ved maksimal hastighet supernatanten ble kastet. Deretter ble pelleten ble resuspendert i 100 pl 20 mM HEPES, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 25% glycerol, pH 7,9 og homogenisert ved anvendelse av en sprøyte med kanyle. Etter inkubering på is i 30 min og sentrifugering i 30 minutter ved maksimal hastighet ved 4 ° C ble supernatanten inneholdende kjernefysiske ekstrakt skilles fra den cytoplasmiske pellet og lagret ved -80 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt i henhold til Bradford, ved hjelp av roti Quant (Roth, Karlsruhe, Tyskland).
For Western blot-analyse, 30 ug kjerneproteinekstrakt ble separert på en 8% SDS-PAGE-gel og så overført til en Hybond-P membran (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Membranen ble først blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk (NFDM) ble oppløst i Tris-bufret saltvann (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), 0,1% Tween 20 (TBST). Blottene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C med muse-monoklonalt anti-RAD9A antistoff, fortynnet 1:250 (2 ug /ml) i TBS med 5% NFDM. Etter vasking av blot tre ganger i 5 minutter med TBST, ble proteinene detektert med peroksidase-merket sekundært kanin anti-mus-antistoffer ved hjelp av BM Chemiluminescence Western blotting-sett (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Band intensiteter ble kvantifisert med en LAS-3000 (Fujifilm, Düsseldorf, Tyskland) selvlysende bilde analysator. Comassie blå flekker ble brukt til å justere signalintensitet til mengden protein.
Tilpassede antistoff mikromatriser for kvantifisering av 19 ulike DNA-reparasjon-assosierte proteiner (tabell 1) ble fremstilt ved å fange opp en dråpe, to dråper og /eller tre dråper, hver dråpe inneholder omtrent 0,5 pg antistoff i tre paralleller på nitrocellulose-belagt lysbilder (Oncyte, nitrocellulose 16 multi-pad sklier, Grace Bio-Labs, Bend, OR, USA), ved hjelp av en ikke-kontakt rekke spotter (sciFLEXARRAYER 3 , Scienion, Berlin, Tyskland). Antistoffer mot beta-aktin (ACTB) fungerte som positiv, småblødninger buffer som negativ kontroll. Platene ble lagret ved 4 ° C i tørr tilstand. Nukleære proteiner ble merket med et amin reaktivt fluor fargestoff, som danner en kovalent amidbinding mellom de primære aminer med proteiner. To mikrogram protein og 0,12 mL fluorescerende fargestoff (Dylight 649 NHS ester, Pierce, Rockford, USA) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur i mørket. Da overskudd av fluorescerende fargestoff ble inaktivert ved tilsetning av 100 mM glysin til reaksjonen. Før bruk, ble antistoff microarrays dekket med 16-pad FAST ramme hybridisering kamre (Whatman, Maidstone, UK). Uspesifikke bindingsseter ble blokkert i 1 time ved 4 ° C med 120 ul PBS inneholdende 4% NFDM per-undergruppen, etterfulgt av tre vaskinger med 120 ul PBS hver i 10 min. Merkede proteinprøver ble inkubert på deloppstillinger over natten ved 4 ° C. Deretter ble platene vasket to ganger i 15 minutter med PBS, 5% Tween 20, og to ganger i 15 minutter med HPLC-kvalitet vann. Til slutt ble lysbilder tørket i en speedvac og skannet med en høy oppløsning confocal scanner (Affymetrix radarantenne 428 TM, High Wycombe, UK). Lysbildene ble analysert ved hjelp av Spotfinder 3.1.1-programvaren (TM4, Dana Faber Cancer Institute, Boston, USA). Bakgrunn subtraksjon ble utført i henhold til formelen: flekk intensitet = midlere intensitet SP – (summen BKG – summen top25 BKG) /(antall pixelSP – antall piksler top25 BKG), hvor SP representerer et vilkårlig sted, BKG den tilsvarende bakgrunn og top25 BKG topp 25% av bakgrunnspiksel.
for statistisk analyse av microarray data vi utført log10 transformasjon, z-poengsummen og z ratio beregninger [28]. For mellom-gruppe sammenligninger vi brukte tegn prøven, og hvis det er mulig, Wilcoxon test (skjevhet [-1, + 1]) og boksplott som grafikk (PASW statistikk 18,0). Ingen justering for multiple tester ble utført. Analysene ble betraktet som utforskende, og p-verdiene for de tilsvarende tester er presentert for beskrivelses grunner. Resultatene av disse testene kan derfor ikke betraktes som signifikant på ethvert nivå.
Kvantitativ sanntids RT-PCR
Total RNA ble fremstilt fra behandlede og ubehandlede fibroblastkulturer ved hjelp av TRIzol-metoden (Invitrogen ). Ett mikrogram av RNA prøver ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ real-time RT PCR av
RAD9A
ble utført med en QuantiTect Primer analysen (Qiagen, Hilden, Tyskland) og et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-systemet (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Exon-spenner fremover (5′-GAGAAGACGGTGGAAAAATG-3 «) og revers (5′-GGAAGGACAGGTTGTGAGTC-3») primere ble utformet med Primer3, versjon 0.4.0 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/) program. Linearitet av amplifisering ble bekreftet ved qPCR standardkurve og sekvensanalyse.
RRN18S plakater (Qiagen, # QT00199367) og
TBP product: (# QT00000721) ble brukt som endogene kontroll gener. Alle reaksjoner ble utført i tre paralleller. Hver 25 ul reaksjonsvolum inneholdt 25 ng cDNA mal i 10 mL RNase-fritt PCR gradert vann, 2,5 mL 10x QuantiTect Primer analysen og 12,5 mL 2x QuantiTect SYBR Grønn PCR Master Mix (Qiagen). PCR ble utført i to trinn med en syklus på 95 ° C i 15 minutter (første trinn) og 40 sykluser ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s, og 72 ° C i 40 s (andre trinn).
