Abstract
mucin MUC4 og dens membran partner ErbB2 onkogene reseptoren er potensial samspill partnere i menneskelig bukspyttkjertelen svulst utvikling. Imidlertid er måten de fungerer fortsatt i stor grad ukjent. I dette arbeidet rettet vi identifisere de cellulære mekanismene og de intracellulære signalveier under kontroll av både ErbB2 og MUC4 i en human pankreas adenocarcinomatous cellelinje. Ved hjelp av co-immunoprecipitation og GST rullegardin, viser vi at MUC4 og ErbB2 samhandle i den menneskelige bukspyttkjertelen adenocarcinomatous cellelinje CAPAN-2
via
EGF domener av MUC4. Stabile cellekloner ble generert på som enten MUC4 eller ErbB2 ble slått ned (KD) av en shRNA tilnærming. Biologiske egenskapene til disse cellene ble deretter studert
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre resultater viser at ErbB2-KD-celler er mer apoptotiske og mindre proliferativ (redusert cyklin D1 og økt ekspresjon p27kip1) mens overførings- og invasive egenskaper ikke ble forandret. MUC4-KD kloner var mindre proliferativ med redusert cyclin D1 uttrykk, G1 cellesyklus arrest og endret ErbB2 /ErbB3 uttrykk. Deres migrasjon eiendommer ble redusert mens invasive egenskaper ble økt. Viktigere, inhibering av ErbB2 og MUC4 uttrykk påvirket ikke de samme signalveier (hemming av MUC4 ekspresjon påvirkes JNK-reaksjonsveien mens det av ErbB2 forandret MAPK-reaksjonsveien). Endelig ErbB2-KD og MUC4-KD celler viste nedsatt tumorvekst
in vivo
. Våre resultater viser at ErbB2 og MUC4, som samhandler fysisk, aktivere ulike intracellulære signalveier å regulere biologiske egenskaper CAPAN-2 kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Jonckheere N, Skrypek N, Merlin J, Dessein AF, Dumont P, Leteurtre E, et al. (2012) mucin MUC4 og dens Membran Partner ErbB2 Regulering biologiske egenskaper Menneskelig CAPAN-to kreft i bukspyttkjertelen celler
via
Ulike Signale Pathways. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10,1371 /journal.pone.0032232
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 12 august 2011; Godkjent: 24 januar 2012; Publisert: 29 februar 2012
Copyright: © 2012 Jonckheere et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr. Nicolas Jonckheere er en mottaker av et postdoktorstipend fra Institut National du Cancer (Inca) og Ligue Nationale contre le Cancer (LNCC). Nicolas Skrypek er en mottaker av en PhD fellesskap av Centre Hospitalier Régional Universitaire (CHRU) de Lille /region Nord-Pas-de-Calais. Dr Frédéric Frénois er en mottaker av et postdoktorstipend fra Fondation pour la Recherche MEDICALE (FRM). Johann Merlin er mottaker av en PhD fellesskap fra Université de Lille 2 og Région Nord-Pas-de-Calais. Dette arbeidet støttes av en bevilgning fra la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée Ligue 2010, IVS). Isabelle Van Seuningen er mottaker av en «Contrat Hospitalier de Recherche Translationnelle» /CHRT 2010, AVIESAN. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel Ductal adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største dødsårsaken av kreft i verden. Overlevelseskurven er ekstremt kort (6 måneder) og overlevelse på 5 år er svært lav (3%). Denne dramatiske utfallet er relatert til mangel på terapeutiske verktøy og tidlig diagnostiske markører som gjør kreft i bukspyttkjertelen den mest dødelige kreft. På tidspunktet for diagnose, mer enn 80% av PDAC allerede er metastatisk eller lokalt avansert og bare ca. 10 til 15% av pasientene anses berettiget for kirurgisk reseksjon. Bukspyttkjertelen kreftutvikling følger en metaplasi /dysplasi /kreft progresjon med PDAC utvikling fra ductal lesjon forløpere kalles bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin-1A /-1B /-2 /-3) hvor histologisk, cytologisk og genetiske endringer samle [1], [2 ]. Identifisering av nye molekylære mål, særlig de med endret uttrykk i tidlig Panin, og forklaring på de molekylære mekanismene bak sykdommen, vil utvilsomt gi utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for å stoppe /bremse tumorprogresjon.
I denne sammenheng , den membranbundne mucin MUC4, som uttrykkes så tidlig som i Panins-1A, mens det ikke kommer til uttrykk i de friske pankreas, og dens membran partner den onkogene reseptoren ErbB2, som ofte overuttrykt i bukspyttkjertelkreft, så vel som i PanINs, representerer lovende terapeutiske mål [3], [4], [5], [6].
MUC4-genet koder for en stor apomucin (930 kDa) som består av to subenheter MUC4α og MUC4β [7], [8] , [9], [10]. MUC4α er den ekstracellulære subenheten med en typisk hyperglykosylerte regionen. MUC4β er det transmembran subenhet som inneholder tre EGF-lignende domener (EGF3, EGF1 og EGF2 ligger fra C-terminus til N-enden) som er konservert hos mennesker og gnagere [4], [11]. Eksperimentelle bevis med rotte homologer av Muc4 og ErbB2 antyder at EGF-lignende domener spiller en rolle i reseptor-ligand interaksjoner, og er en regulator i signale relatert til vekst, motilitet eller differensiering av cellen [4], [12]. Fra disse dataene, Carraway og medarbeidere har foreslått Muc4 som en modulator av spredning /differensiering balanse [13], men på dette tidspunktet, slik foreslåtte mekanismen er ikke validert for menneskelig MUC4.
onkogen neu koder ErbB2 /HER2 type i transmembrane vekstfaktor-reseptor som hører til den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR /ErbB1) familie som omfatter ErbB3 og ErbB4. ErbB2-proteinet består av et ekstracellulært domene, et transmembrandomene og et intracellulært tyrosinkinasedomene. ErbB2 har ingen kjent ligand, og er beskrevet som en ko-reseptor som hetero dimerizes med andre ErbB-reseptorer [14]. ErbB2 er ofte overuttrykt i kreftformer, inkludert PDAC, hvor ErbB2 blir ofte forsterket.
Studier i humane celler forblir knappe og foreslå så langt en mulig rolle for MUC4 i de biologiske egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler [15], [ ,,,0],16]. Angå ErbB2, har bare en fersk studie i et annet bukspyttkjertelkreft cellemodell vist at ErbB2 kan være involvert i egenskapene for kreft i bukspyttkjertelen celler [17]. Tidligere arbeider i tykktarm og lunge-celler viste at MUC4 og ErbB2 kan virke som et funksjonelt kompleks og transdusere signaler intracellulært [18], [19]. Imidlertid er det fortsatt uklart om MUC4 og ErbB2 aktivere samme signalveien (e).
I dette arbeidet, foretok vi identifisere de intracellulære signalveier under kontroll av enten ErbB2 eller MUC4 i samme cellemodell av kreft i bukspyttkjertelen for å teste denne hypotesen. Vi viser at menneskelig MUC4 og ErbB2 trenger fysisk samhandle på kreft i bukspyttkjertelen celler og at hemming av uttrykk for hver membran partnere svekker ikke de samme signalveier (hemming av MUC4 uttrykk påvirker JNK veien mens det av ErbB2 endrer MAPK veien). ble observert ulike effekter på de biologiske egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som tyder på selvstendig virksomhet som disse to proteiner med en rolle i bukspyttkjertelen tumorvekst for ErbB2, mens MUC4 ser ut til å være involvert i både tumorvekst og spredning.
Materialer og metoder
Etablering av ErbB2 og MUC4 KD cellelinjer
CAPAN-2 bukspyttkjertelkreft cellelinje (ATCC, HTB-80) ble dyrket som beskrevet tidligere [20]. ErbB2-KD-celler ble oppnådd etter stabil transfeksjon av CAPAN-2-celler med pGeneClip ™ puromycin vektor som koder for ErbB2 shRNA (SA Biosciences ™). Stabil transfeksjon av en mikrogram av ScaI fordøyd plasmid ble utført med Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) etter produsentens protokoll. Den tomme vektor ble brukt til å heve styrings kloner kalt Non Targeting (NT). Seleksjon ble utført ved anvendelse puromycine (0,1 ug /ml, InvivoGen, Limoges, Frankrike) og kloner ble isolert ved begrenset seriefortynning. MUC4-slås ned (KD) celler ble oppnådd ved retroviral infeksjon av CAPAN-2-celler med plasmid pRetroSuper (SA Biosciences ™) inneholdende en sekvens målrettet mot MUC4 (5′-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 «). Den tomme vektor ble brukt til å heve styrings kloner kalt
Mock
. Utvalg ble utført ved hjelp av G418 /geneticine (300 mikrogram /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike) og kloner ble isolert ved serie grensen fortynning.
Western blotting
cytosoliske, kjernekraft og totale cellulære ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i Van Seuningen
et al.
[21] og Jonckheere
et al.
[22], henholdsvis og holdt ved -80 ° C inntil bruk. Proteininnhold (2 mL av atom ekstrakter) ble målt i 96-brønners plater med bicinchoninic syre metode som beskrevet i produsentens instruksjoner (Pierce). Western blotting ble utført på nitrocellulosemembran (0,2 pm, Schleicher og Schuell) som tidligere beskrevet [23]. Membraner ble analysert med antistoffer mot ErbB-2 (klone Ab-1, fortynning 1/500), p27kip1 (fortynning 1/500) fra Lab Vision Neomarker, USA; fosfor-p42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (klone 20G11, fortynning 1/500), p42 /44MAPK (klone I37F5, fortynning 1/500), fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, fortynning 1 /500), SAPK /JNK (klone 56G8, 1/500), fosfor-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (klone D3F9, 1/1000), p38MAPK (# 9212, fortynning 1/1000), FAK (# 3285, fortynning 1 /1000), fosfor-Akt (Ser473) (klone D9E, 1/1000), Akt (klone C67E7, fortynning 1/1000), cyclin D1 (klone DCS6, fortynning 1/500), EGFR (# 2232, fortynning 1 /500), alle fra Cell Signaling Technology, USA; ErbB-3 (klon C-17, 1/500), ErbB-4 (klon C-18, fortynning 1/500), MMP2 (klon H-76, fortynning 1/500), MMP9 (klon 6-6b, fortynning 1/500), BCL-xL (klone H-5, fortynning 1/500), Bax (klone N-20, fortynning 1/500), MUC4 (8G7, fortynning 1/500) alle fra Santa Cruz Biotechnology, USA; MUC1 (M8, sjenerøs gave fra Dr D. Swallow, London), eller β-aktin (A5441, fortynning 1/5000) fra Sigma, Frankrike. Antistoffer ble fortynnet i Tris-buffret saltvann inneholdende 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk og Tween-20 (TBS-T), med unntak av MUC4 og β-aktin og inkubert over natten ved 4 ° C før behandling med immunfarging. Peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (Sigma) ble anvendt, og immunoreaktive bånd ble visualisert ved anvendelse West Pico chemoluminescent substrat (Perbio, Brebieres, Frankrike). Chemo-luminescens ble visualisert ved hjelp LAS4000 apparat (Fujifilm) og resultatene ble integrert ved hjelp av Gel analytiker Software® (Claravision). Dataene som presenteres er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Co-immunoprecipitation av MUC4-ErbB2 kompleks
150 ug CAPAN-2 cellulære ekstrakt ble inkubert over natten med 1,5 mikrogram av anti-ErbB2-antistoff (Rabbit polyklonale, Ab-1, Thermo Scientific). Protein A ble kovalent bundet til kryssbundne 4% agarose-perler (Sigma, Frankrike), ekvilibrert med 1 x bindingsbuffer (200 mM Tris-HCl pH 7,5 inneholdende 1 M NaCl, 20 mM EDTA og 2% NP40 (v /v)) og tilsatt til lysatet-antistoffblanding og inkubert på en roterende plattform i 2 timer ved 4 ° C. Perlene ble deretter vasket tre ganger med 1 x bindingsbuffer. Kanin IgG (Millipore) ble anvendt som en negativ kontroll. Vaskede kuler ble deretter blandet med 2 x SDS-gel lastebuffer før elektroforese på en 2% (w /v) agarosegel og immunblotting som beskrevet tidligere [23].
Konstruksjon av GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 fusjonsprotein
cDNA som koder for MUC4
EGF3 + 1 + 2 sekvensen ble forsterket av PCR ved hjelp av en FLAG epitop-merket versjon av MUC4β subenheten [16] heter MUC4F2-CF2 som mal og F_EGF3 (5′-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 «) og R_EGF1 (5′-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3») som primere. PCR-produktet koding MUC4
EGF3 + 1 + 2 ble fordøyd av
BamHI Hotell og
Smal Hotell og satt inn i pGEX-4T1 (GE Lifesciences). Den pGEX-4T1-GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2-konstruksjonen ble deretter transfektert i B834pLysS
E. coli product: (Novagen) ved hjelp av electroporation og
E. coli
ble dyrket i Luria Bertani medium (Invitrogen) til en OD
600 på 0,8. GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 fusjonsprotein-ekspresjon ble deretter indusert ved tilsetning av 1 mM av isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion) ved 15 ° C over natten. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 3800 x g ved 4 ° C, resuspendert i 60 ml lyseringsbuffer (1 x PBS, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% (v /v) Triton X /100) og lysert ved sonikering (Branson Sonifier 250). Etter sentrifugering (20 000 x g, 90 min, 4 ° C) ble supernatanten utvunnet, og GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 ble separert fra hel-celle-lysat ved bruk av glutation-agarosekuler (Qiagen). Etter vasking av perler med lyseringsbuffer, GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2-fusjonsprotein ble eluert med 40 mM redusert glutation i en 50 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer inneholdende 150 mM NaCl, 0,1% (v /v) Triton X /100 og 1 mM DTT. Protein renhet ble bestemt ved Coomassie blå farging etter en 12% SDS-PAGE. Det rensede protein ble dialysert mot 1 x bindingsbuffer og lagret ved 4 ° C inntil bruk.
GST rullegardin
GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 ble lastet på likevekt glutation perler (Qiagen,) som beskrevet av produsenten. Etter natten over-binding ved 4 ° C i nærvær av det humane rekombinante ErbB2-proteinet (5 pg, R 5) med statistisk signifikans (P 0,05) ble sortert ved bruk av asymptotisk P-verdi beregning. Alle data er MIAME kompatibel. Rådata har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO, tiltredelse Nummer: GSE31322).
QRT-PCR
Total RNA fra kreft i bukspyttkjertelen celler ble utarbeidet etter den NucleoSpin® RNA II kit ( Macherey Nagel) etter produsentens protokoll. cDNA ble fremstilt som tidligere beskrevet [27]. PCR ble utført ved hjelp SsoFast ™ Evagreen Supermix kit følgende produsenten protokollen med CFX96 real time PCR system (Biorad). Primer informasjon er gitt i tabell S1.
Statistisk analyse
statistiske analysene ble utført ved hjelp av Graphpad Prism 4.0-programvaren (Graphpad programvare Inc., La Jolla, USA). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller i gjennomsnittet av to prøver ble analysert ved studentens
t
test eller enveis ANOVA test med valgt sammenligning bruker Tukey HSD post-hoc test med forskjellene mindre enn 0,05 anses vesentlig og ble merket med en *. ** Indikerer p 0,01, *** indikerer p 0,001. Forskjeller i beredskap ble analysert ved hjelp av khikvadrattest.
Resultater
MUC4 og ErbB2 fysisk samhandle i CAPAN-2 kreft i bukspyttkjertelen celler
Immunpresipitasjon av CAPAN-2 cellular ekstrakt med anti-ErbB2-antistoff ble utført før immunblotting med anti-MUC4 antistoff. MUC4 farging indikerer at MUC4 ko-immunopresipitert med ErbB2 i CAPAN-2-celler (figur 1A, spor 1). Spesifisiteten av vekselvirkningen ble bedømt ved bruk av irrelevante kanin IgG som ikke viste noe immunopresipitert bånd (felt 2). For å vise en direkte fysisk interaksjon mellom MUC4 og ErbB2, vi først utført et GST pull-down-analyse. For at vi gjorde en GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 fusjonsprotein som inneholder de tre EGF-lignende domener av MUC4. Vi forberedte deretter to affinitetskolonner bærer enten GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 fusjonsprotein eller GST alene som rekombinant humant ErbB2 ble lastet inn. Etter affinitetskromatografi, anti-ErbB2-immunoblot viste en ErbB2-spesifikt bånd for glutation perler kolonne som bærer GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 fusjonsprotein (figur 1B, spor 1). Ingen bånd ble observert for glutation kolonne lager GST alene (kolonne 2).
(A) Co-immunutfelling av 150 ug CAPAN-2 celleekstrakt med anti-ErbB2-antistoff (spor 1) eller kanin IgG ( kolonne 2). CAPAN-2 celleekstrakt alene (spor 3). (B) ErbB2 immunoblot av GST rullegardin av rekombinant humant ErbB2 protein med GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 glutation perler (spor 1) eller GST glutation perler (kolonne 2). Rekombinant ErbB2 alene (spor 3). (C)
In situ
nærhet ligand analysen på CAPAN-2 celler. MUC4 og ErbB2 komplekser (røde prikker) er angitt med en pil. Kjerner ble farget med DAPI. Kontrollforsøk ble utført i fravær av primært antistoff. (D) Immunofluorescens påvisning av MUC4 (rød) og ErbB2 (grønn) ved konfokal mikroskopi viste ko-lokalisering av de to proteiner (gule). (E) Uttrykk for MUC4 og ErbB2 i to representative kloner av MUC4-KD og ErbB2-KD celler og deres respektive kontroller (Mock og NT) ved Western blotting.
Samspill mellom MUC4 og ErbB2 var da bekreftet ved hjelp av en annen tilnærming som er
In situ
nærhet Rings analyser (PLA). Resultatene tyder på at MUC4 og ErbB2 danne et endogent kompleks i CAPAN-2 celler (røde prikker, piler, figur 1C). Endelig konfokalmikroskopi studier bekreftet samlokalisering av MUC4 og ErbB2 i CAPAN-2 celler (figur 1D). Til sammen disse resultatene indikerer at MUC4 og ErbB2 fysisk samhandle i CAPAN-2 kreft i bukspyttkjertelen celler
via
MUC4
EGF3 + 1 + 2 region som inneholder tre EGF-lignende domener. Vi foretok å identifisere de cellulære mekanismene og de intracellulære signalveier under kontroll av begge parter.
Produksjon og karakterisering av stabile ErbB2-KD og MUC4-KD cellulære kloner
De fem ErbB2- KD og syv MUC4-KD cellulære kloner viste henholdsvis nesten fullstendig eller total hemming av ErbB2 og MUC4 uttrykk sammenlignet med kontroll kloner (figur 1E). Western blot-analyse av et annet membran-bundet mucin som er viktig i kreft, MUC1, indikerte at inhibering av MUC4 drastisk nedsatt som i MUC1, mens hemming av ErbB2 ikke hadde noen effekt (figur S1). Når vi så på ekspresjon av de tre andre medlemmer av ErbB-reseptor-familien, inhibering av MUC4 eller ErbB2-ekspresjon førte til en sterk reduksjon av ErbB2 og ErbB3 (MUC4-KD) og av ErbB3 (ErbB2-KD), henholdsvis, mens ingen effekten ble oppdaget for ErbB1 og ErbB4 (figur S1).
rolle ErbB2 og MUC4 på celleproliferasjon og apoptose
MUC4-KD-celler viste en redusert spredning fra 48 h som ble opprettholdt ved 72 h og ble signifikant ved 96 h (44% mindre enn Mock celler, p 0,05). ErbB2-KD-celler var også mindre proliferativ med en signifikant reduksjon på 27% etter 96 h (p 0,05) (figur 2A). En sterk cellesyklusarrest i G1 fase (54,5% ± 0,13) ble observert i MUC4-KD-celler sammenlignet med celler Mock (37,4% ± 7,2, *, p = 0,016) (figur 2B). Videre er G2M fase var mye kortere i MUC4-KD-celler (20,9% ± 4,7) sammenlignet med Mock kontrollceller (39.6% ± 6.7, **, p = 0,0035) (total *, p = 0,0102). I ErbB2-KD-celler, en trend mot en cellesyklus arrest i G1 skjedde også at forble statistisk ikke signifikant (p = 0,119) (figur 2B). For å identifisere de mekanismene som er ansvarlige for denne forandring i proliferasjon, ble ekspresjon av cellesyklus markører evaluert ved Western blotting (figur 2C). Det er tydelig redusert spredning i MUC4-KD-celler ble forbundet med undertrykkelse av cyclin D1. I ErbB2-KD-celler ble redusert spredning assosiert med både økt uttrykk av p27
kip1 cellesyklus hemmer og reduksjon av cyclin D1 (figur 2D), noe som tyder på en mobil arrest i G1 /S spredning sjekkpunkt.
(A) celle~~POS=TRUNC veksten~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved celletelling ved 24, 48, 72 og 96 timer for CAPAN-2 MUC4-KD eller ErbB2-KD og deres respektive kontroller (Mock og NT). * = P 0,05 hjelp student
t
-test. (B) cellesyklus distribusjon profiler av MUC4-KD, ErbB2-KD og deres kontroll kloner (Mock og NT) ved flowcytometri etter inkubasjon med propidium iodure. Verdiene er uttrykt som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. * = P 0,05 hjelp Chi kvadrat test. ns = ikke signifikant. (C) Effekt av MUC4 eller ErbB2 lyddemping ble analysert på cellesyklus markør cyclin D1 og p27
kip1 av western blot. β-actin ble målt som en intern kontroll. (D) Bånd ble kvantifisert ved densitometri. Histogrammer av forholdet (cyclin D1 eller p27
kip1 /β-aktin) vises. (E)% av subG1 populasjon av MUC4-KD, ErbB2-KD og kontroller (Mock og NT, henholdsvis) ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri etter inkubasjon med propidium iodure (* = p 0,05). (F) Western blot ble utført for kløyvde caspase 3, Bcl
XL og Bax i MUC4-KD, ErbB2-KD og deres respektive kontroller (Mock og NT). β-aktin ble evaluert som en intern kontroll. (G) Migrasjons egenskaper MUC4-KD, ErbB2-KD og kontroll kloner (Mock og NT) ble evaluert ved hjelp Boyden kamre. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt vandrende celle nummer per synsfelt (*** = P 0,001, ns = ikke signifikant). (H)% av invasjon (invasive celler /trekkende celler) ble bestemt ved hjelp av Boyden kamre belagt med Matrigel®.
For å vurdere om MUC4 eller ErbB2 hemming kan også påvirke apoptose, måling av apoptotisk celle befolkning ( subG1 celler) ved flowcytometri ble utført (figur 2E). Resultatene viste en signifikant økning av subG1 populasjon (13,33% ± 2,1) i ErbB2-KD-celler sammenlignet med NT-kontroll kloner (6,2% ± 0,4) (*, p = 0,017). I MUC4-KD-celler, ble ingen forskjeller i subG1 cellepopulasjon observert i forhold til Mock kontroll kloner (ns, p = 0,19). Uttrykk av apoptotiske markører ved immunoblotting indikerte at Bax og Bcl
XL ble ikke endret i begge MUC4-KD og ErbB2-KD-celler, mens økning av spaltet caspase-3 ble observert i ErbB2-KD celler (figur 2F).
rolle MUC4 og ErbB2 i celle migrasjon /invasjon /vedheft
for å vurdere hvilken rolle MUC4 og ErbB2 i celle migrasjon /invasjon, eksperimenter ble utført i Boyden kamre uten eller med Matrigel® belegg, henholdsvis . Resultatene indikerte at ble det observert en signifikant lavere antall trekklegemer i MUC4-KD-celler (37,8 ± 1,5) sammenlignet med Mock celler (60,1 ± 3,3) (p≤0.001) mens ingen signifikant forskjell ble funnet i ErbB2-KD-celler (53,5 ± 8,8) sammenlignet med NT kontroll kloner (56,2 ± 6,3) (figur 2G). Når vi målte invasivitet, MUC4-KD-celler viste seg vesentlig mer invasive (41,8% ± 1,5, n = 7) enn celler som uttrykker MUC4 (mock) (19,5% ± 1,5, n = 5) (p = 0,029) (figur 2 H). ErbB2-KD kloner, på den annen side, var litt mindre invasiv (9,4% ± 1,15) enn celler som uttrykker ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), men denne reduksjonen var ikke signifikant (p = 0,09). Evnen til MUC4-KD og ErbB2-KD-celler til å følge på Matrigel® (laget av to komponenter av den pankreatiske ekstracellulære matriks collagen IV og laminin) eller kollagen I ble også undersøkt, men ingen signifikante forskjeller ble funnet for enten celler (ikke vist) .
rolle ErbB2 og MUC4 i intracellulære signal
virkningen av ErbB2 eller MUC4 på de store veiene som intracellulær signalering ble undersøkt ved Western blotting for: MAPKs (p42 /44, p38 og JNK ), Akt, og Focal Heft Kinase (FAK) (Figur 3 og Figur S2). Fosforylering av p42 /P44 MAPK ble fullstendig avskaffet i ErbB2-KD celler i forhold til NT kontroll kloner, indikerer fullstendig hemming av denne veien i etterkant ErbB2 demping. I MUC4-KD-celler sammenlignet med mock-kloner, konstitutiv p42 /P44 MAPK ble redusert mens fosforylerte p42 /44 økes noe som tyder på en aktivering av MAPK-reaksjonsveien er knyttet til MUC4 undertrykkelse.
(A) Western blot analyser ble utført på cytosolic ekstrakt av MUC4-KD, ErbB2-KD og kontroller (henholdsvis Mock og NT) for uttrykk av både fosforylerte og konstituerende former for p42 /P44, JNK og p38 MAPK. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. To representative kloner blir presentert. (B) Bånd ble kvantifisert ved densitometri. Histogrammer av forholdet (fosforylert /konstituerende form) for P42 /P44, JNK og p38 MAPK kinaser vises.
Når vi så på JNK-reaksjonsveien, ble det observert en total undertrykkelse av JNK fosforylering i MUC4 -KD kloner forhold til Mock kontroller som tyder på at MUC4 uttrykk dramatisk konsekvenser JNK pathway aktivitet. Ingen effekt på JNK-reaksjonsveien ble observert i ErbB2-KD kloner. p38 MAPK veien så ikke ut til å bli betydelig endret ved enten ErbB2 eller MUC4 lyddemping (figur 3). Tilsvarende, Akt og FAK-trasé ble ikke signifikant endret (figur S2).
Til sammen viser disse resultatene at tap av MUC4 og ErbB2 dramatisk svekker JNK og p42 /44 MAPK signalveiene, respektivt.
effekt av ErbB2 og MUC4 på tumor egenskaper
in vivo
for å bekrefte
in vitro
data av MUC4 og ErbB2 effekter på tumorcelleegenskaper, SC xenograft studiene ble utført . Resultatene tyder på at tumorvolumet var signifikant lavere i xenopodet mus med M4-2-1 eller M4-2-10 kloner ved dag 22 (figur 4A), hvor fravær av MUC4 ble bekreftet ved IHC (figur 4B). Reduksjon av ErbB2 uttrykk tidligere vist
in vitro
av Western blotting ble også bekreftet
in vivo
i MUC4-KD svulster ved IHC (figur 4B).
