Abstract
Behandling av multiresistent (MDR) kreft er en klinisk utfordring . Mange MDR celler som overuttrykker epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Vi utnytte dette uttrykk gjennom utvikling av EGFR-målrettet, polymerblanding nanocarriers for behandling av MDR kreft ved bruk av paclitaxel (en vanlig kjemoterapeutisk middel) og lonidamine (et eksperimentelt legemiddel, mitokondriell heksokinase 2-inhibitor). En orthotopic modell av MDR human brystkreft ble utviklet i nakne mus og brukes for å vurdere sikkerhet og effekt av nanopartikkel behandling. De effektparametre inkludert tumorvolummålinger fra dag 0 til og med 28 dager etter behandling, terminal tumorvektmålinger, tumor densitet og morfologi vurdering gjennom hematoxylin og eosin farging av skåret tumorer, og immunohistokjemi av tumorsnitt for MDR proteinmarkører (P-glykoprotein, hypoksi induserbar faktor, EGFR, Hexokinase to, og stamcellefaktor). Toksisitet ble vurdert ved å spore endringer i kroppsvekt fra dag 0 til 28 dager etter behandling, ved å måle plasmanivåer av leverenzymer ALT (Alaninaminotransferase) og LDH (laktat dehydrogenase), og av hvite blodlegemer og blodplater. I disse studiene viste dette nanocarrier systemet overlegen effekt i forhold til kombinasjonen (paclitaxel /lonidamine) medikament løsning og monoterapi behandlinger i nanopartikler og løsning form. Kombinasjonen nanopartikler var den eneste behandlingsgruppen at redusert tumorvolumet, opprettholde denne nedgangen til 28 dagers tidspunkt. I tillegg er behandling med EGFR-målrettet lonidamine /paclitaxel-nanopartikler redusert tumor tetthet og endres MDR-fenotypen av tumor xenografter. Disse EGFR-målrettet kombinasjon nanopartikler var betydelig mindre giftige enn løsnings behandlinger. På grunn av den fleksible utforming og enkel konjugering kjemi, kan dette nanocarrier system kan brukes som en plattform for utvikling av andre MDR-kreft terapi; bruk av dette systemet for EGFR-målrettet, kombinasjonen paklitaksel /lonidamine terapi er et forskudd på personlig medisin
Citation. Milane L, Duan Z, Amiji M (2011) Terapeutisk effekt og sikkerhet av Paclitaxel /Lonidamine Loaded EGFR-Målrettet Nanopartikler for behandling av multiresistent kreft. PLoS ONE 6 (9): e24075. doi: 10,1371 /journal.pone.0024075
Redaktør: Dimitris Fatouros, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, Hellas
mottatt: May 13, 2011; Godkjent: 01.08.2011; Publisert: 08.09.2011
Copyright: © 2011 Milane et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute, National Institutes of Health gjennom tilskudd R01 CA-119617 og R01 CA-119617S1 (Arra Supplement), og R21 CA-135594. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av multimedikamentresistent (MDR) kreft hindrer ofte klinisk behandling av kreft som det resulterer i ikke-responsiv sykdom som kan føre til metastase [1], [2]. MDR refererer til en tilstand av elastisitet mot strukturelt og /eller funksjonelt ubeslektede narkotika [1]. MDR er ofte ervervet gjennom eksponering for cytostatika men MDR kan også være iboende (medfødte) [1].
Hypoksi er en etablert microenvironmental seleksjonspress som kan resultere i MDR og motstand mot strålebehandling [3], [ ,,,0],4]. Under forhold med hypoksi og stress i cellene Hypoksi induserbar faktor alfa (HIF-1α) translocates fra cytoplasma til kjernen; HIF-α deretter komplekser med HIF-β, som danner en aktiv transkripsjonsfaktor [3], [4]. Denne aktive HIF komplekset er da i stand til å indusere transkripsjon ved å binde seg til Hypoksi Responsive Elements (HRE) «s på målgener; målgener inkluderer P-glykoprotein (P-gp), epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), og mange glykolytiske proteiner som Hexokinase 2 (HXK2) [3], [4]. Oksygen-uavhengige faktorer slik som cyklooksygenase-2 aktivitet, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), kan varmesjokkprotein 90, og fosfatidylinositol 3-kinase også stabilisere HIF [4], [5], [6].
P-gp er et trans narkotika efflukspumpen av ATP-bindende kassett (ABC) transporter familien; P-gp-ekspresjon i kreft er assosiert med MDR og dårlig prognose [2]. EGFR-ekspresjon i enkelte typer kreft er også forbundet med aggressiv sykdom [7]. Over ekspresjon av EGFR fører til reseptor-gruppering i cellemembranen som gjør en celle hyper-sensitive til EGFR substrater; Dette hjelpemidler overlevelse av MDR-celler, spesielt hypoksiske tumor områder som kan være fjernt fra en kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer [7]
En annen overlevelse fordel for kreftceller er å skaffe seg energi gjennom glykolyse.; enten anaerob (Pasteur Effect) eller aerobic (den Warburg Effect) [8]. Mange glykolytiske proteiner, slik som heksokinase 2 er HIF målene [3], [4], [9]. Hexokinase katalyserer første trinn i glykolysen; heksokinase 2 isoformen er direkte forbundet med mitokondrier og er overuttrykt i mange typer kreft [4], [10], [11]. Mitokondrie sammenslutning av heksokinaseløsning 2 hindrer binding av pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem proteiner gjennom romlig hemming av mitokondrie permeabilitet overgangen pore kompleks; Dette hjelper også celleoverlevelse som det hindrer cytokrom c meldingen og den påfølgende apoptotiske kaskade [10]
Den aktuelle stoffet levering system rettet mot MDR kreftceller aktivt gjennom EGFR bindende.; overflaten av nanocarriers har blitt modifisert med en EGFR-spesifikt peptid. Dette systemet behandler MDR kreft ved hjelp av en kombinasjon av paclitaxel og lonidamine. Paclitaxel (PTX) er en vanlig kjemoterapeutisk middel som hyper-stabiliserer mikrotubuli, hindrer celledeling; PTX er et ikke-spesifikt middel og er forbundet med høy resttoksisitet. Lonidamine (LON) (1 – [(2,4-diklorfenyl) metyl] -1 H-indazol-3-karboksylsyre) er en heksokinase 2 inhibitor som er blitt vist å indusere apoptose og behandle MDR i forskjellige kreftcellelinjer [12] , [13], [14]. I USA ble det kliniske fase II-studier med LON som en behandling for benign prostatahyperplasi suspendert på grunn av forbundet levertoksisitet [15], [16]. Dette stoffet leveringssystem som mål å forbedre effektiviteten og redusere giftigheten av PTX og LON gjennom bruk av kombinasjonsbehandling og aktiv målretting.
Denne studien undersøker terapeutisk effekt og sikkerhet av EGFR målrettede nanopartikler (NPS) lastet med PTX og LON. Disse polymer-blandings nanocarriers ble evaluert i en ortotopisk modell av MDR brystkreft. Tumorstørrelse og vekst progresjon ble brukt for å bedømme effektiviteten av behandlingen. Sikkerheten /toksisitet av denne behandlingen ble bestemt ved å måle endringen i kroppsvekt, plasmanivåer av leverenzymer ALT (Alaninaminotransferase) og LDH (laktat dehydrogenase), og hvite blodceller og blodplater. For ytterligere å karakterisere effekten av denne terapi, H E farging av tumorsnitt fra hver gruppe ble sammenlignet. Dessuten ble Immunhistokjemi (IHC) av tumor seksjoner for ekspresjon av P-gp, HIF-1α, EGFR, HXK2, CD-31, og stamcellefaktor (SCF) brukes til å vurdere MDR karakter av tumorer etter behandling. Som vist i skjemaet i figur 1, resulterte behandling med EGFR-målrettet NPS lastet med PTX og LON redusert tumorvolum og redusert ekspresjon av hypoksisk og MDR-assosierte proteiner i ortotopisk brystkreftmodell.
nakne mus med ortotopiske, multilegemiddelresistent bryst tumorxenotransplantater ble behandlet med EGFR-målrettet, polymer blanding nanopartikler lastet med paclitaxel og lonidamine. Denne nanopartikkel formuleringen er internalisert via EGFR reseptor; behandling fører til en kaskade av cellulære forandringer, og en reduksjon i tumorvolumet. Som bestemt ved immunohistokjemi av tumorxenografter, redusert nanopartikkel behandling ekspresjonen av hypoksisk og MDR-markører (EGFR, epidermal vekstfaktor-reseptor; HIF, hypoksi induserbar faktor; HXK2, heksokinase 2; Pgp, P-glykoprotein, SCF, stamcellefaktor).
Resultater
partikler Karakterisering
utformingen Målet med dette nanocarrier systemet var aktivt målrette MDR celler ved binding til EGFR reseptor og deretter levere PTX og LON til stedet av en svulst. For å oppnå merkbar lasteeffektivitet for begge medikamenter (ca. ≥70%) PCL (Polykaprolakton) ble anvendt som den primære bestanddel nanopartikkel (formulering optimalisering er beskrevet i vår tidligere publiserte arbeidet [17]). For å oppnå aktiv rettet mot en PLGA-PEG-Peptide konstruksjonen ble syntetisert og innlemmet i PCL (Polykaprolakton) NPs. Både en PLGA-PEG og en PLGA-PEG-peptid konstruere ble innlemmet i formuleringen for å oppnå overflatemodifisering med PEG og peptidet. PLGA at konstruksjonen samvirker med PCL kjernen av partiklene, hjelpe til lonidamine og paclitaxel innkapsling mens PEG og EGFR-spesifikt peptid stikker ut fra partikkeloverflaten muliggjør aktiv målretting og beskyttelse av det retikuloendoteliale system. Den komplette syntese og karakterisering av dette system er beskrevet i vårt annet arbeid [17]; NMR ble anvendt for å vurdere podeprosessen, ble ESCA benyttet for å bekrefte tilstedeværelsen av peptidet på overflaten av NPS, medikament innkapsling og frigjøringskinetikk ble kvantifisert over tid, og EGFR målet ble kvantifisert i et panel bestående av ni cellelinjer med forskjellige nivåer av EGFR uttrykk. Som avbildet i figur 2, SEM av NPS bekreftet nanometerskala av partiklene som i gjennomsnitt mellom 120 -160 nm.
nanometer-størrelse på nanocarriers ble bekreftet med en scanning elektronmikrograf av nanopartiklene. Målestokken er 2 mikrometer.
Effekt Analyse
MDA-MB-231 svulster etablert fra hypoksiske forbehandlede celler ble dyrket til 100 mm
3 størrelse og deretter mus ble behandlet med en av de følgende 8-behandlinger; (1) målrettet NPs lastet med PTX og LON, (2) SOL av PTX og LON, (3) målrettet NPs lastet med PTX, (4) PTX SOL, (5) målrettet NPs lastet med LON, (6) LON SOL, (7) tomme målrettede NPS (ingen medikament), og (8) saltvann. Behandling fortsatte i 28 dager. I løpet av denne tiden, ble tumorstørrelse og kroppsvekt overvåkes, og blod ble oppsamlet for å vurdere toksisiteten.
Fig 3.a viser tumorveksten i hver behandlingsgruppe fra dag 0 (dato for behandlingsstart) til dag 28. den tumorvekst for saltvann og kjøretøy (blank NP) behandlet gruppene er lik; mens behandling med LON SOL og LON NPs resulterte i litt redusert tumorvolumet. Behandling med PTX og SOL PTX NPS resulterte i en ytterligere reduksjon i tumorvolum. Behandling med kombinasjonen (LON og PTX) SOL faktisk undertrykt tumorvekst i 10 dager, noe som medførte at veksten gjenopptatt på et mye lavere rente. Dette er illustrert i fig 3.B sammen med kombinasjonen NP behandling. Kombinasjonen NPs var den eneste behandlingsgruppen som faktisk redusert tumorvolum, opprettholde denne reduksjonen inntil 28 dagers tidspunktet når tumorvolum nærmet den innledende tumorvolum.
effekten av kombinasjonen nanopartikkel terapien ble bestemt ved måling av forandringer i tumorvolum fra 0-28 dager etter behandling og ved å måle terminal svulst vekt på 28 dager etter behandlingen. Dag 0 ble den første behandlingsdagen. Kroppsvekt ble anvendt som en parameter og toksisitet ble målt fra 0-28 dager etter behandling. For alle diagrammene representerer hvert datapunkt middelverdien ± SD med en
n
= 4. (A) Tumor volum. Mus ble behandlet med ett av åtte behandlinger via haleveneinjeksjon; saltvann (svarte sirkler), kjøretøy (tomme nanopartikler, grå firkanter), lonidamine løsning (LON Sol, grønne trekanter), lonidamine nanopartikler (LON NP, lilla inverterte trekanter); paclitaxel-løsning (PTX Sol, lyseblå diamanter), paklitaksel nanopartikler (PTX NP, oransje åpne sirkler), lonidamine og paclitaxel kombinasjonsløsning (LON + PTX Sol, mørk blå stjerne), og lonidamine og paclitaxel kombinasjonsnanopartikler (LON + PTX NP; lysegrønne stjerner). (B) Tumor volum (av kombinasjonsbehandling). For å klargjøre forskjellen mellom lonidamine og paclitaxel kombinasjonsbehandling i løsning form (LON + PTX Sol, åpne sirkler) i forhold til nanopartikkel behandling (LON + PTX NP; lukket sirkler), ble disse to gruppene tegnes separat her. (C) Tumorvekt. Terminalen tumorvekt (ved 28 dager etter behandlingen) ble plottet for hver behandlingsgruppe. Tallet over hver søyle representerer den gjennomsnittlige terminaltumorvolum (fra panel A). Stjernene rett over feil Linjene indikerer signifikans mellom saltvann og den angitte gruppen (* p 0,05, *** p 0,001). (D) Kroppsvekt. Kroppsvekt ble målt og plottet som prosent endring (i forhold til opprinnelige kroppsvekt) fra 0-28 dager etter behandlingen. Gruppene inkluderer; ingen tumor (svarte sirkler), saltvann (grå firkanter), kjøretøy (grønne trekanter), lonidamine løsning (LON Sol, lilla inverterte trekanter), lonidamine nanopartikler (LON NP, lyseblå diamanter), paclitaxel-løsning (PTX Sol, oransje åpne sirkler ); paclitaxel nanopartikler (mørkeblå åpne firkanter), lonidamine og paclitaxel kombinasjonsløsning (LON + PTX Sol, lys grønne åpne trekanter), og lonidamine og paclitaxel kombinasjonsnanopartikler (LON + PTX NP, rosa invertert åpne trekanter)
.
A To-veis ANOVA-testen ble benyttet for å analysere dataene; resultatene er presentert i tabell 1. Det var ingen betydning for enhver tid punkt mellom saltvann og bærerbehandlede grupper. Av denne grunn ble sammenligninger av hver gruppe med kjøretøyets behandlingsgruppen ikke er inkludert i tabell 1. Tabell 1 sammenligner behandlingsgrupper og viser den dag etter behandling som et bestemt nivå av betydning ble nådd. Mest spesielt mellom 4 og 12 dager, det er signifikant sammenheng mellom både kombinasjonen SOL gruppen og kombinasjonen NP gruppen sammenlignet med saltvann, LON SOL, LON NPS, PTX SOL, og PTX NP behandlinger. Det er også betydning mellom kombinasjonen SOL gruppen og kombinasjonen NP gruppe etter 10 dagers behandling.
De tumor vekter fra hver gruppe er vist i figur 3.C. Den midlere tumorvolum på dag 28 (offer) er indikert over søylen for hver gruppe. Tumorvektene samsvarer med de terminale tumorvolumdata. Kombinasjonsbehandling med EGFR-målrettet NPs var betydelig mer effektive for å redusere tumorvolum enn monoterapi behandling.
Sikkerhet og toksisitet Profiler
Den kroppsvekt av hver gruppe ble også overvåket gjennom hele behandlingsforløpet og er presentert i figur 3.d. Alle SOL grupper gikk en innledende fall i kroppsvekt, som forble lavere i løpet av behandlingen. Denne effekten var mest uttalt for kombinasjonen SOL. Gruppene behandlet med PTX NPs og med kombinasjonen NPs også gjennomgikk en innledende nedgang i kroppsvekt; Det var imidlertid en moderat gjenvinning av dette fallet mellom 7-10 dager etter behandling. Den innledende og vedvarende reduksjon av SOL-gruppene er mest sannsynlig på grunn av Cremophor EL-oppløsning. Nedgangen i kroppsvekt i forbindelse med kombinasjons NPS og PTX NPS er mest sannsynlig på grunn av cytotoksisitet av PTX.
Blodprøver ble også oppsamlet på dag 0, dag 14 og dag 28 av behandlings og ble analysert for nivåer av LDH og ALT samt hvite blodlegemer og trombocytter. Resultatene fra dag 14 blodanalyse er beskrevet i figur 4; for alle fire parametere, var det ingen signifikant sammenheng mellom noen av behandlingsgruppene ved dag 0. LDH (figur 4.a) blir ofte forhøyet i kreft og på grunn av skade på vev, som for eksempel; Det er en vanlig markør for sykdom og toksisitet. På dag 14 var det betydning mellom saltvann og gruppen behandlet med PTX SOL samt gruppen behandlet med kombinasjon SOL. Det var betydning mellom No Tumor gruppen og alle behandlingsgrupper ved dag 14 (p 0,01) og på dag 28 (p 0,05, figur S1). Dette er mest sannsynlig på grunn av veksten av svulsten selv, og ikke direkte knyttet til behandling gis til hver gruppe. En økning i ALT (figur 4.B) er ofte assosiert med leverskade. Ved dag 14 var det signifikant sammenheng mellom saltløsningsgruppen og alle SOL-grupper. Av betydning, på dette tidspunktet var det også betydning mellom kombinasjonen SOL og kombinasjonen NPs. Kombinasjon LON /PTX behandling med NPS resulterer i mindre levertoksisitet enn behandling med kombinasjonen SOL. Det var også betydning mellom No Tumor gruppen (og Vehicle gruppen) og alle SOL behandlingsgrupper på dag 14 (
p
0,01 for Nei Tumor sammenligning
p
0,05 for Vehicle sammenligning).
leverenzymer og blodverdier ble brukt for å vurdere toksisitet. For alle grafer, representerer hvert datapunkt gjennomsnitt ± SD med en
n
= 4. Den doble dolk representerer signifikans mellom No Tumor gruppen og alle andre grupper (‡
p
0,05 , ‡‡
p
0,01, ‡‡‡
p
0,0001). Seksjonen tegn representerer signifikans mellom den angitte gruppen og alle løsnings grupper (§
p
0,05, §§
p
0,01, §§§
p
0,0001). Stjernene rett over stolpene (ingen brak) representerer signifikans mellom denne gruppen og saltvann gruppen mens stjernene ovenfor parentes angir inter-gruppe betydning (*
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,0001). (A) Laktat dehydrogenase (LDH). (B) Alaninaminotransferase (ALT). (C) platetall. (D) hvite blodceller (WBC) teller.
En reduksjon i antall blodplater (figur 4.C) blir ofte assosiert med kjemoterapi toksisitet. Ved dag 14 var det signifikant sammenheng mellom den Ingen Tumor gruppe og alle SOL-grupper. På dette tidspunktet var det også betydning mellom saltvann (og bilen) gruppe og alle SOL grupper. Forhøyede antall hvite blodlegemer (figur 4.d) er tegn på vevsskade. I samsvar med de andre toksikologiske data, det er signifikant mellom saltvann og kjøretøy behandlet grupper og alle SOL behandlet grupper. Det er også signifikans mellom hver gruppe SOL, og den tilsvarende NP-gruppen. NP behandlinger er mindre giftig enn SOL medikamentell behandling. Det er signifikant sammenheng mellom No Tumor gruppen og alle andre grupper. Ettersom denne forskjell er tydelig i saltvann og kjøretøy grupper også, er det mest sannsynlig en indikasjon på vevskade assosiert med tumorutvikling i mus. Samlet indikerer blodanalyse som NP terapi er betydelig mindre giftig enn SOL medikamentell behandling.
Histologi
For å vurdere toksisitet, hematoxylin og eosin farging av tumor seksjoner fra hver behandlingsgruppe videre ble undersøkt ( Figur 5). Bilder av både svulsten omkretsen og svulsten kjernen ble kjøpt. Felles for alle tumorsnitt, er det tilfeldig utvalg av cellevekst. Hver tumor er en klar avgrensning av økt celletetthet på omkretsen av svulsten. Dette omkrets, er imidlertid ikke konsekvent mellom behandlingsgruppene. Den saltvann behandlede gruppen, gruppen behandlet med tomme NPs, og gruppen behandlet med LON SOL ser ut til å ha en mye tykkere svulst grense av celler. Dette vises litt redusert i LON NP behandlede gruppen, og mer markert redusert i gruppene behandlet med PTX SOL, PTX NPs, kombinasjon SOL, og kombinasjonen NPs. Kjernen tetthet ser ut til å følge et lignende mønster som omkretsen tetthet i behandlingsgruppene. Celletettheten i tumor kjerne deler av saltvann gruppen, blank NP gruppen, LON SOL gruppen, og LON NP gruppen synes mye høyere enn celletettheter av PTX SOL gruppen, PTX NP gruppe, kombinasjonen SOL gruppe , og kombinasjonen NP-gruppen. Den reduserte celletetthet på kombinasjonen NP-gruppen kan forklare den dramatiske reduksjon i den endelige tumorvekten. Disse reduksjonene i tetthet kan være et kjennetegn på effektiv behandling.
Tissue seksjoner ble farget med hematoksylin og eosin. Kjernen er farget med hematoksylin (blåaktig farge) mens andre cellefraksjoner er farget med eosin (rød og rosa farger)
IHC svulst avsnitt fra hver gruppe ble analysert for uttrykk følgende seks proteiner.; P-gp, HIF-1α, EGFR, CD-31, HXK2, og SCF (Figur 6-8). For hver seksjon, er F-aktin farget med phalloidin (rød), er kjerner farget med Hoechst 33342 (blå), og proteinet av interesse er merket med sekundære antistoffer som er Alexa Fluor® 488 konjugert (grønn).
Vevssnitt ble probet med primære antistoffer mot proteinet av interesse, og deretter merket med Alexa 488 Fluor® konjugerte sekundære antistoffer (grønn). F-aktin ble farget med Alexa Fluor® 568 phalloidin (rød) og kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå).
Tissue seksjoner ble undersøkt med primære antistoffer mot proteinet av interesse, deretter merket med Alexa Fluor® 488 konjugerte sekundære antistoffer (grønn). F-aktin ble farget med Alexa Fluor® 568 phalloidin (rød) og kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå).
Tissue seksjoner ble undersøkt med primære antistoffer mot proteinet av interesse, deretter merket med Alexa Fluor® 488 konjugerte sekundære antistoffer (grønn). F-aktin ble farget med Alexa Fluor® 568 phalloidin (rød) og kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå).
P-gp uttrykk (figur 6) var svært høy i saltvann gruppe, den tomme NP-gruppen, og i LON SOL gruppen. Det syntes å være en liten nedgang i LON NP gruppen, PTX SOL gruppen, PTX NP gruppe og kombinasjonen SOL gruppen. Det var en mer bemerkelsesverdig reduksjon i kombinasjon NP-gruppen. Det er mulig at en måned med behandling med kombinasjonsterapi begynner å reversere MDR når administrert som SOL (svak reduksjon av P-gp), men mer fullstendig reverserer MDR når den administreres som NP behandling (dramatisk reduksjon).
HIF -1α (figur 6) var meget høy i gruppen med saltløsning, blank NP behandlede gruppe, PTX SOL gruppe, og PTX NP gruppe. I disse seksjoner med høy ekspresjon, vises HIF-1α å være co-lokalisert med både den cytoplasmiske cellefraksjon (gul og grønn), og med cellekjernen (hvitt). LON SOL behandling og mer bemerkelsesverdig, redusert LON NP behandling HIF-1α uttrykk. Som LON hemmer heksokinase 2 (og den Warburg-effekten), vil denne reduksjon i HIF-1α uttrykket være på grunn av tilbakekoblingssløyfe mellom glycolitic og HIF veier. Det er en ytterligere reduksjon i HIF-1α uttrykk med den kombinasjonsbehandling. LON kan redusere Warburg effekt, reduserer aktiviteten av HIF reaksjonsveien, og sensibilisere tumor til virkningene av PTX, som fører til MDR reverseringen.
Det var et meget høyt nivå av EGFR (figur 7) ekspresjon i alle av vevet seksjoner; imidlertid kombinasjonen NP gruppen ut til å ha noe lavere nivå i forhold til de andre gruppene. Dette kan tyde på at aggressivitet og samlet karakter av svulsten har forvandlet. På den annen side, CD-31 (figur 7) ekspresjon var lav /ikke-påvisbare i alle tumorsnitt. CD-31 ble inkludert som en markør for angiogenese.
uttrykk for HXK2 (Figur 8) fulgte samme mønster som HIF-1α uttrykk. Det var et høyt nivå av uttrykk i saltvann behandlede gruppen, den tomme NP gruppen, PTX SOL gruppen, og PTX NP gruppe. Det var en nedgang i HXK2 uttrykk i LON SOL behandlede gruppen og en ytterligere nedgang i LON NP behandlede gruppen, kombinasjonen SOL gruppen, og kombinasjonen NP gruppe. LON NPs synes å ha mer av en effekt på HXK2 uttrykk enn LON SOL, og denne effekten ser ut til å bli styrket med kombinasjonsbehandling.
Den siste protein som ble undersøkt var SCF (Figur 8). Det var et moderat nivå av SCF-ekspresjon i saltvann behandlede gruppe; dette uttrykket dukket opp mer samlokalisert med F-aktin (gul) i det tomme NP behandlet gruppe; og dukket opp mer samlokalisert med cellekjerner (hvite) i LON SOL gruppen, PTX SOL gruppen, og PTX NP gruppe. Det viste seg å være både F-aktin og nukleinsyre samlokalisering i kombinasjonen SOL behandlede gruppen mens det var en markert nedgang i uttrykk i LON NP gruppe og en ytterligere nedgang i kombinasjonen NP behandlede gruppen.
Kollektivt , saltvann og tomme NP behandlede grupper har høyere uttrykk nivåer av P-gp, HIF-1α, EGFR, og HXK2 forhold til de andre behandlingsgruppene. Behandling med kombinasjons NPs resulterte i en reduksjon i uttrykket av P-gp, HIF-1α, EGFR, HXK2 og SCF i forhold til de andre gruppene. Selv om mindre bemerkelsesverdig, behandling med kombinasjonen SOL viste et lignende mønster. Dette indikerer at kombinasjonsbehandling gjør faktisk forvandle medfødt karakter av MDR svulster.
Diskusjoner
Den komplette
in vitro
karakterisering av dette stoffet leveringssystemet demonstrert den forbedrede effekten av kombinasjonen PTX /LON terapi, EGFR binding av NPs og vedvarende legemiddeldosering av systemet [17]. Vi utviklet en roman, orthotopic modell av MDR human brystkreft ved bruk av hypoksiske forbehandlede celler for å etablere tumorxenotransplantater i hårløse mus (innsendt for publisering og kort beskrevet i dette arbeidet). Ved hjelp av denne
in vivo
modell, evalueringer av denne EGFR-målrettet NP system demonstrert at disse partiklene hadde en overlegen farmakokinetisk profil (T
½, AUC
0-∞, AUMC
0- ∞, og MRT
0-∞) i forhold til en sammenlignbar ikke-målrettede NP system [18]. Den nåværende forskning viser at behandling med EGFR-målrettet LON /PTX NPS er mer effektiv enn kombinasjonsbehandling SOL (redusert tumorvolum og redusert tumorvekt). Den økede effekt av NP behandling kan skyldes den forbedrede permeabilitet og retensjon effekt og aktiv målretting. Selv om kombinasjonsterapi med medikament SOL var også effektiv i forhold til enkelt middel behandling, toksisiteten forbundet med SOL behandling var mye høyere sammenlignet med NP behandling. Kombinasjonen NPs resulterte i en mindre reduksjon i kroppsvekt og mer av en bedring i kroppsvekt, mindre LDH, mindre ALT, lavere antall hvite blodlegemer, og høyere trombocytter. Jo høyere toksisitet av SOL behandling i forhold til NPS er mest sannsynlig på grunn av virkningene av Cremophor EL. Betydningen mellom gruppen med saltløsning og den PTX SOL gruppen, så vel som kombinasjonen SOL gruppen er mest sannsynlig på grunn av en synergist kombinasjon av cytotoksisitet av PTX og toksisitet av Cremophor EL SOL. NP behandling er et tryggere alternativ til kombinasjonen narkotika SOL. Kvalitativ analyse viste at kombinasjonen NP behandlingen resulterte i en mer dramatisk reduksjon i tumor kjerne og omkretsen tetthet i forhold til kombinasjonen SOL. Denne endringen i tetthet kan være proporsjonal med den terapeutiske effekten.
Kvalitativ IHC analyse av protein ekspresjon viste også en mer markert nedgang i ekspresjon av Pgp, HIF-1α, EGFR, HXK2, og SCF etter behandling med kombinasjonen NPs. SCF ble inkludert i IHC-analyse for å undersøke om behandlingen hadde en effekt på ekspresjon av SCF og for å undersøke om SCF er faktisk en markør for MDR i denne tumormodellen. Det ser ut til at to sentrale begreper i kreftstamceller co-eksistere; det er kreft
initiere
stamceller som kommer som stamceller, men forvandles til kreft forårsaker celler og for det andre, det er kreft
avledet
stamceller som er kreftceller som utvikler stilk-lignende egenskaper, disse celler er bedre kjent som MDR-celler. I tråd med det konseptet at MDR-celler kan utvikle stamceller-lignende egenskaper og bli identifisert som kreft stamceller, har forskjellige studier vist at celle belastninger som hypoksi, som er effektiv i å fremkalle kreft aggresjon og MDR-fenotyper, også indusere stem-lignende egenskaper i kreftceller som for eksempel ekspresjonen av stamcellefaktor (SCF) [3], [4], [9], [19], [20]. Det kan være at svulstene blir mindre hypoksisk (LON NPs og kombinasjonen NPs), SCF synker også. Den differensielle ko-lokalisering av SCF kan tilbakeføres til sin rolle i mange forskjellige signally baner slik som c-kit reaksjonsvei; også det er en løselig og trans form av SCF. De forskjellige behandlinger kan endre forskjellige signally trasé dominert av en av de SCF-isoformer.
Samlet IHC vist at kombinasjonsbehandling NP synes å endre fenotypen av tumoren, redusere MDR karakter av xenotransplantater (Figur 1 ). Kollektivt, EGFR-målrettet NPs var mer effektive i behandling av MDR enn SOL og monoterapi behandlinger og mindre giftige enn de SOL behandlinger. Dette nanocarrier systemet er et springbrett på veien til personlig medisin.
Avslutt Merknader
Behandle MDR med en cocktail av kjemoterapeutika er et vanlig klinisk tilnærming. Imidlertid, som MDR er en dynamisk sykdomstilstand, er mange av de nåværende legemiddelkombinasjoner er uten virkning etter vedvarende bruk. Som sådan, det er en etterspørsel etter nye medikamentkombinasjoner for behandling av MDR. Det er også et klinisk behov for å redusere toksisiteten som er relatert til disse behandlingene som toksisitet krever ofte dosereduksjon og /eller en økning i doseringsintervall som kan bidra til utviklingen av ervervet MDR. Kombinasjon LON /PTX behandling med EGFR-målrettet NPs representerer en ny tilnærming for behandling av MDR kreft; denne fremgangsmåten løser det kliniske behov for nye medikamentkombinasjoner og gir en løsning på kjemoterapi forbundet toksisitet ved bruk av et nanocarrier system.
Materialer og metoder
Polymer og Peptide Bøyning
Dette nanocarrier systemet har blitt fullstendig karakterisert og beskrevet i våre andre verk [17], [18]. Peptidet GE11 ble anvendt for å oppnå aktiv målretting av EGF-reseptoren; Dette er en etablert EGFR-ligand med den følgende sekvens: YHWYGYTPQNVIGGGGC [21], [22]. Konjugering av GE11 til PLGA-PEG-konstruksjonen ble oppnådd ved anvendelse av maleimid /cystein linakge (PEG rest har en terminal maleimid mens peptidet har en terminal cystein). GE11 ble syntetisert ved Tufts University Kjerne Facility, Boston, MA. For å syntetisere både PLGA-PEG-peptid og PLGA-PEG-konstruksjoner, 50:50 poly (DL-lactide-
co
-glycolide) (PLGA) med en iboende viskositet på 0,15-0,25 (Durect Lactel® adsorberbare polymerer, Pelham, AL) ble anvendt; amin- poly (etylenglykol) PEG-maleimid (MW 2000; jenkem Technology, Allen, TX, USA) ble anvendt for PLGA-PEG-peptid-konstruksjonen, mens m-PEG-amin (MW 2000; LaysanBio, Arab, AL) ble benyttet for å syntetisere den PLGA-PEG-konstruksjonen.
