Abstract
Bakgrunn
KRAS
mutasjoner forekommer hos 35-45% av metastatisk kolorektal kreft (mCRC) og utelukker respons til EGFR-målrettet behandling med cetuximab eller panitumumab . Men mindre enn 20% av pasientene som viser villtype
KRAS
svulster oppnå objektiv respons. Endringer i andre effektorer nedstrøms av EGFR, slik som BRAF, og dereguleringen av PIK3CA /PTEN vei er uavhengig av hverandre er funnet å gi opphav til motstand. Vi presenterer en omfattende analyse av
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
mutasjoner, og PTEN uttrykk i mCRC pasienter behandlet med cetuximab eller panitumumab, med sikte på å klargjøre den relative bidraget fra disse molekylære endringer i motstand.
metodikk /hovedfunnene
Vi retrospektivt analysert objektiv tumorrespons, progresjonsfri (PFS) og total overlevelse (OS) sammen med mutasjonsstatus av
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA Hotell og uttrykk for PTEN i 132 svulster fra cetuximab eller panitumumab behandlet mCRC pasienter. Blant de 106 ikke-responderende pasienter, 74 (70%) hadde tumorer med minst en molekylær forandring i de fire markører. Sannsynligheten for responsen var 51% (22/43) hos pasienter med ingen endringer, 4% (2/47) blant pasienter med en endring, og 0% (0/24) for pasienter med ≥2 endringer (p 0.0001) . Følgelig PFS og OS ble stadig verre for pasienter med svulster husing ingen, en eller ≥2 molekylær endring (er) (p 0,001).
Konklusjon /Betydning
Når uttrykk for PTEN og mutasjoner av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
er samtidig påvises, opptil 70% av mCRC pasienter usannsynlig å svare på anti-EGFR terapi kan identifiseres. Vi foreslår å definere som «
firemannsrom negativ
«, den CRC mangler endringer i
KRAS
,
BRAF
, PTEN og
PIK3CA
. Omfattende molekylær disseksjon av EGFR signalveier bør vurderes å velge mCRC pasienter for cetuximab- eller panitumumabs-basert terapi
Citation. Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, Molinari F, De Dosso S , Saletti P, et al. (2009) Multi Determinanter Analyse av molekylær Endringer for å forutsi klinisk nytte av EGFR-målrettet monoklonale antistoffer i tykktarmskreft. PLoS ONE 4 (10): e7287. doi: 10,1371 /journal.pone.0007287
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 5 juni 2009; Godkjent: 02.09.2009; Publisert: 02.10.2009
Copyright: © 2009 SartoreBianchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra italiensk Association for Cancer Research (AIRC), italiensk Helsedepartementet, Regione Piemonte, italienske departementet for universitet og forskning, Association for International Cancer Research (AICR-UK), EU FP6 MCSCs kontrakt 037297, CRT Progetto Alfieri, Oncosuisse gir OCS-01921-08-2006 og OCS-02301-08-2008, Fondazione Ticinese per la Ricerca sul cancro (Tessin Foundation for Cancer Research), og OCGO (Oncologia Ca Granda Onlus) Fondazione. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje årsaken til kreft-dødsfall i den vestlige verden [1]. Til tross for forbedringer i den terapeutiske armamentarium for metastatisk CRC (mCRC), 5-års total overlevelse (OS) er fortsatt dårlig, med en median overlevelse på 18 til 21 måneder [2]. Andre medikamenter, så vel som ytterligere innsikt om mekanismene for motstand, er nødvendig for å forbedre klinisk resultat. Behandlingstilbud for mCRC dag inkluderer kimære IgG1 monoklonalt antistoff (MOAB) cetuximab og menneske IgG2 moAb panitumumab [3], [4]. Begge molekylene bindes til epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som fører til hemming av sin nedstrøms signalering, som gir et meningsfullt klinisk nytte. Objektiv responsrate uselekterte populasjoner av mCRC, men er begrenset til 8-12% for disse agentene når det brukes som monoterapi i første [5] og påfølgende behandlingslinjer [4], [6], [7].
Vi og andre har tidligere vist at somatisk
KRAS
mutasjoner (en viktig effektor av EGFR initiert signalering) kan uavhengig svekke effekten av panitumumab eller cetuximab [8] – [10]. Dette førte USA og europeiske helsemyndigheter for å begrense bruken av disse midlene for pasienter med villtype
KRAS
mCRC bare [11] – [13]. Selv om denne avgjørelsen er ventet å forbedre den terapeutiske indeksen i denne valgte befolkningen, er objektiv responsrate fortsatt svært begrenset. Faktisk er det begrenset til 17% (
vs
0% i
KRAS
mutert) for panitumumab monoterapi [10], til 12,8% (vs 1,2% i
KRAS
mutert) for cetuximab monoterapi [14] og til 59-61% (
vs
36-33% i
KRAS
mutert) for cetuximab pluss enten irinotecan- eller oksaliplatinbasert kjemoterapi, henholdsvis [15], [16]. Disse funnene klart tyder på at andre faktorer, som for eksempel endringer i andre EGFR effektorer, inkludert medlemmer av RAS-MAPK eller PI3K trasé kunne drive motstand mot anti-EGFR terapi.
BRAF er hoved nedstrøms effektor av KRAS [ ,,,0],17], [18] og dets onkogene V600E mutasjon er gjensidig utelukkende med
KRAS
mutasjoner i CRC [19]. Vi og andre har nylig vist at V600E mutasjon kan også utelukke lydhørhet overfor panitumumab eller cetuximab i mCRC pasienter og cellulære modeller av CRC [20].
PIK3CA
genet er mutert i ca 20% av CRC [21].
PIK3CA
mutasjoner forekommer i de «hotspots» som ligger i ekson 9 (E542K, E545K) og ekson 20 (H1047R) er onkogene i CRC cellemodeller [22], [23].
PIK3CA
genet koder for en lipid kinase som regulerer, sammen med KRAS, signalveier nedstrøms av EGFR. PI3K initiert signale normalt inhiberes av PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti). Vi og andre har tidligere vist at tap av PTEN uttrykk, som forekommer hos 30% av sporadiske tilfeller er forbundet med mangel på respons på cetuximab [24], og at
PIK3CA /PTEN
deregulering kan være en biomarkør for motstand i
KRAS
vill type pasienter [25], [26] og cellulære modeller av CRC [27].
til sammen data fra retrospektive analyser viser at
BRAF
og
PIK3CA Twitter /PTEN endringer kunne representere flere verktøy for å velge mCRC pasienter for EGFR-målrettet behandling [20], [24] – [26]. Likevel,
KRAS
i klinisk setting fortsatt en klar identifisering av hvilke biomarkører bør benyttes sammen med å bli definert. Dette er fordi i disse retrospektive analyser: a) ulike determinanter ble evaluert i hver studie; og b) en overlappende blant noen av disse biomarkører kan forekomme i enkelte pasient. I denne studien, utførte vi den første omfattende mutasjonsanalyse av
KRAS, BRAF
, og
PIK3CA
, sammen med evalueringen av PTEN uttrykk i en kohort av 132 mCRC behandlede pasienter.
Resultater
Distribusjon og overlapping av molekylære endringer i enkelte svulster
Som vist i figur 1, analyse av svulster fra en kohort av 132 pasienter (for klinisk-patologiske funksjoner, se tabell 1) førte til identifisering av 104 molekylære forandringer. Vi har oppdaget 35
KRAS
mutasjoner (26,5%), 11
BRAF
mutasjoner (8,3%), 17
PIK3CA
mutasjoner (12,3%) og 41 (ut av 114 evaluerbare) tap av PTEN uttrykk (36,0%). Mutasjoner av
KRAS
skjedde i kodon 12 i 24 tilfeller (68,6%) og i kodon 13 i 10 tilfeller (28,6%); en dobbel punktmutasjon som involverer både kodoner ble detektert i ett tilfelle (2,9%).
PIK3CA
mutasjoner ble funnet enten i ekson 9 (4 tilfeller) eller i ekson 20 (13 tilfeller). De 11 mutasjoner av
BRAF
var alle V600E erstatninger.
Mutasjoner av
KRAS Hotell og
BRAF
skjedde i et gjensidig utelukkende måte, mens et overlappende mønster ble observert blant andre endringer. De vanligste overlapp fingeravtrykk var PTEN tap og
KRAS
mutasjoner (co-forekommende hos 13 pasienter), og
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner (i 7 pasienter) (Figur 1)
Association of kliniske variabler og objektiv tumorrespons
Blant kliniske variabler (se tabell 1), ble bare kutan toksisitet assosiert med objektiv respons (Wald test. p = 0,002; retning av svar = 0-1-≥2). Andre kliniske variabler, inkludert kjønn, stedet for primærtumor (colon, sigmoid-rektum krysset, endetarm, andre nettsteder), og alder var ikke signifikant assosiert med objektiv tumorrespons (p = 0,491, 0,490 og 0,904, henholdsvis p-verdiene ble oppnådd ved Fishers eksakte test for området og kjønn og av Wald test for alder). Siden pasienter som er valgt i denne kohorten ble behandlet med blandede linjer med tidligere kjemoterapiregimer (selv om de aller fleste fikk 2-3 tidligere behandlingslinjer, se tabell 1), har vi også studert sammenhengen mellom antall tidligere kjemoterapi linjer og objektiv tumorrespons , viser at denne variabelen ikke utøve noen effekt (Wald test: p = 0,536)
Multivariate analyser av molekylære forandringer og objektiv respons
multivariatanalyse inkludert alle fire molekylære forandringer (justert med kutant. giftighet og antall tidligere kjemoterapi linjer) viste at kun
KRAS
mutasjoner og tap av PTEN ekspresjon var uavhengig assosiert med mangel på objektiv respons (p = 0,001 og mindre enn 0,001, respektivt) (tabell 2). Viktigere, bayesiansk informativ kriteriet ifølge Schwarz antydet at en modell inkludert
KRAS
mutasjoner og tap av PTEN uttrykk var samlet den beste strategien for å identifisere ikke-responsive pasienter i vår kohort.
multivariate analyser av molekylære forandringer og overlevelse
multivariat Cox analyse for OS bekreftet at rollen
KRAS
mutasjoner og tap av PTEN var betydelig i overdragelse verre klinisk utfall (HR = 1,72, p = 0,043 og HR = 0,54, p = 0,012, henholdsvis), med også
BRAF
mutasjoner utøve en skadelig border effekt (HR = 2,31, p = 0,093). Som for PFS, bare
KRAS
mutasjoner ble assosiert med redusert overlevelse (HR = 1,65, p = 0,033), mens ingen av de andre molekylære endringer ble demonstrert til selvstendig påvirke kliniske utfall (tabell 3).
Multivariate analyser av molekylære forandringer og klinisk utfall hos pasienter med villtype
KRAS
mCRC
Vår kohorten består av retrospektive saker, og på grunn av dette, også
KRAS
muterte pasienter ble inkludert i analysen. Etter vedtak i helseforetakene om å begrense bruken av cetuximab og panitumumab til villtype
KRAS
mCRC [11] – [13], [28], har denne undergruppen oppnådd ytterste relevans. Følgelig har vi fokusert vår analyse på effekten av
BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner og tap av PTEN i de resterende 96 villtype
KRAS
pasienter. Ved multivariat analyse, tap av PTEN bekreftet en signifikant sammenheng med manglende respons (p 0,001), mens
BRAF Hotell og
PIK3CA
ikke var signifikant (p = 0,265, 0,075, henholdsvis) ( Tabell 4).
Survival analyser vist i tabell 5 viser at
BRAF
mutasjoner (HR = 3,75, p = 0,015) og tap av PTEN (HR = 0,43, p = 0,009 ), men ikke
PIK3CA
mutasjoner (HR = 1,20, p = 0,672), var signifikant assosiert med redusert OS, mens ingen av disse endringene var signifikant assosiert med PFS.
Effect av antall molekylære forandringer ved klinisk resultat
i lys av forekomsten av flere molekylære forandringer i den samme tumor, undersøkte vi vår kohort av skille pasienter i henhold til den faktiske antall molekylære abnormaliteter i den samme tumor, altså ingen
vs
en
vs
≥2 endringer. Fordi den molekylære status av en markør mellom PTEN,
PIK3CA Hotell og
BRAF
ble ikke bestemt i 18 svulster, bestemte vi oss for å utføre denne analysen i de resterende 114 pasienter.
sannsynlighet for respons var 51,1% (22/43) hos pasienter med ingen endringer, 4,2% (2/47) med en endring, og 0% (0/24) med ≥2 endringer, og disse forskjellen var statistisk signifikant (p 0,0001 ved Fishers eksakte test). Figur 2 viser fordelingen av antall mutasjoner i kullet og respons på EGFR-målrettet terapi i henhold til antallet av molekylære abnormaliteter innenfor individuelle tumorprøver. Den ødeleggende effekt av samler forandringer ble også bekreftet av den logistisk modell, som viser at, i gjennomsnitt, en enhetlig økning i antallet av endring (er), ville bety en reduksjon i de sjanser for responsen med 96% (odds-ratio = 0,04; p 0,00001). Tatt sammen, disse funnene at en nødvendig, men ikke tilstrekkelig betingelse for å nå målet reaksjon er å ha ikke mer enn en av de fire molekylære forandringer. Tilsvarende overlevelse analyser viste at pasienter som viste forskjellige PFS og OS, avhengig av antallet av molekylære endringer i deres tumorer. Figur 3 og 4 viser at PFS og OS var stadig verre for ingen, en eller ≥2 molekylære endringer (p = 0,0002 for både PFS og OS, logrank test). De parvise tester justert for multiple sammenligninger dokumentert at en dårligere klinisk resultat ble observert hos pasienter med svulster som bærer ≥2 endringer
vs
1 (p = 0,0198 og 0,0213 for PFS og OS, henholdsvis) og ≥2
vs
ingen (p = 0,0002 for både PFS og OS), men ikke for pasienter med en endring
vs
ingen (p = 0,3852 og 0,3807 for PFS og OS, henholdsvis). Median PFS var 2,8 måneder (5,0, 2,8 og 1,7 for pasienter husing ingen, en eller ≥2 endringer, henholdsvis); median OS var 9,4 måneder (14,6, 9,3 og 7,3 for pasienter som hadde ingen, en eller ≥2 endringer, henholdsvis).
Data fra kohort av pasienter med kjent molekyl status for alle fire markører.
data~~POS=TRUNC fra kohort av pasienter med kjent molekyl status for alle fire merkene.
Diskusjoner
til tross for den nylige anbefaling av ASCO [28] og av helsemyndighetene i Europa [11], [12] og USA [13] for
KRAS
testing som et diagnostisk forutsetning for EGFR-målrettet cetuximab- eller panitumumabs basert terapi for mCRC, svarprosenten til enten av disse stoffene er begrenset til mindre enn 20% i villtype
KRAS
pasienter [10], [14]. Nyere data tyder på at
BRAF
eller
PIK3CA
mutasjoner kan bidra til ytterligere 20-30% av motstand [20], [25], [26]. I tillegg er også PTEN er blitt foreslått som en selvstendig prediktiv faktor av cetuximab effekt [24], [25], [27]. Den relative og totale bidrag av hver av disse molekylære forandringer i klinisk beslutningstaking er fortsatt uklar. Videre hvorvidt og i hvilken grad forekomsten av flere molekylære endringer påvirker klinisk respons og pasientenes overlevelse er i dag ukjent.
EGFR
kopiere nummer vurdert av FISH har også blitt foreslått å være prediktive for klinisk utfall til EGFR-målrettede terapier [29] – [33]. Men
EGFR
FISH for mCRC gjennomgår inter-laboratoriet standardisering [30] og for å unngå innføring av konfunderende elementer vi valgt ikke å utføre denne analysen. Her utnyttes vi den omfattende molekylær analyse av EGFR nedstrøms effektorer å fastslå deres rolle i å forutsi respons /resistens mot cetuximab eller panitumumab i mCRC. Ved samtidig vurdering av fire molekylære forandringer, var vi i stand til å identifisere opptil 70% av ikke-responder pasienter, et resultat som aldri har blitt oppnådd før. Spesielt, bare tre pasienter med tumorer som bærer en enkelt endring var i undergruppen av respondere, (to pasienter med
KRAS
mutasjoner og en pasient med tap av PTEN uttrykk), mens ingen andre viste noen endring ( «quadruple negativ «svulster). Dette tyder på at tidligere rapportert utliggere dvs. svært uvanlig tilfeller av mCRC med
KRAS
mutasjoner responderer på terapi [9], [14], [29], [34] kan være pasienter som hadde kun ett av disse molekylære endringer, og dermed ikke samtidig dereguleringen både MAPK og PI3K trasé.
Våre data tyder på at én eller flere mutasjoner av
KRAS
,
BRAF
, eller
PIK3CA
ufordelaktig påvirke klinisk utfall til cetuximab- eller panitumumabs-basert terapi; bør imidlertid den mulighet at disse molekylære forandringer kan være negative prognostiske markører uavhengig av målrettet terapi tas i betraktning. Den RASCAL retrospektiv studie utført på 2721 CRC pasienter indikerte at tilstedeværelsen av
KRAS
mutasjoner er assosiert med en 26% økt risiko for dødelig utgang [35]. Imidlertid har motstridende data om samme emne nylig blitt publisert. I en fase III-studie rapportert av Karapetis et al. [14], klinisk nytte hos pasienter med villtype
KRAS
mCRC ble funnet i cetuximab behandlede pasienter, men ikke i kontroll pasienter behandlet med best supportive care eneste, og dermed indikerer at fordelen var ikke på grunn av en prognostisk effekt av
KRAS
. Videre Roth et al. [Proc Am Soc Clin Oncol Gastrointestinale Kreft Symposium 206, 2009; Abstr 288] testet den prognostiske verdien per stadium av
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner ved hjelp av CRC tumorprøver fra adjuvant PETACC3 rettssaken, og de fant ingen signifikant effekt på tilbakefall overlevelse for både mutasjoner verken i stadium II eller i fase III. Studier som vurderer effekten av andre molekylære forandringer i stedet for
KRAS
mutasjoner er begrenset. Som for prognostisk rolle
PIK3CA Hotell og
BRAF
, i en studie med 586 pasienter ved Barault et al., Redusert forekomst av 3-års overlevelse var assosiert med mutasjoner av minst ett gen blant
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA product: [36]. En fersk rapport fra Tol et al. funnet at tilstedeværelsen av BRAF V600E mutasjon var en negativ prognostisk markør i 516 pasienter med metastatisk kolorektalcancer behandlet med kapecitabin, oksaliplatin og bevacizumab baserte regimer [37]. Til slutt, Ogino et al. rapportert at i en serie av 450 pasienter med stadium I-III CRC som gjennomgikk kirurgi kurativ, tumor
PIK3CA
mutasjonen var assosiert med kortere cancer-spesifikk overlevelse. Slike negative effekten av
PIK3CA
mutasjon på prognosen var konsistent på tvers av de fleste lag av kliniske og tumor prediktorer for pasientens utfall. Interessant, denne negative effekten var i hovedsak begrenset til pasienter med
KRAS
villtype tumor [38]
I konklusjonen, dokumenterer vi at samtidig påvisning av
KRAS, BRAF Hotell og
PIK3CA
mutasjoner og evaluering av tap av PTEN uttrykk i mCRC pasienter har bemerkelsesverdig kliniske implikasjoner ved å øke evnen til å forutsi utfallet til EGFR-målrettede terapier. I lys av naturen av vår pasient serien, er den mest pålitelige indikator på prediktiv verdi av biomarkør (e) objektiv tumorrespons. Tolkning av overlevelsesanalyser bør faktisk ta hensyn til en mulig begrensning på grunn av pasientene som ble behandlet med blandet forrige linje (r) av kjemoterapi, inkludert en 10% (13/132) av pasientene som ble behandlet med førstelinje cetuximab monoterapi. På den annen side, studiet av slike pasienter representerer en unik mulighet for å fastslå den prediktive verdi for en gitt biomarkør uten påvirkning av kjemoterapi, enten samtidig eller foregående, så vel som seleksjons som utøves av andre behandlinger. I lys av disse betraktningene, foreslår vi her en ny algoritme for å avgjøre klinisk bruk av EGFR-målrettede monoklonale antistoffer som er basert på objektive responsrater (figur 5 og 6). Denne romanen tilnærmingen fortjener validering i prospektive studier med cetuximab- eller panitumumabs-basert terapi mCRC tidligere å ha en innvirkning som klinisk praksis endring. Viktigere, har vi funnet at ca 20% av mCRC ikke-respondere ikke båtplass mutasjoner av
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
eller tap av PTEN uttrykk og vi foreslår å definere disse svulstene som «firedoble negative». Den manglende respons i firedoble negative pasienter kan skyldes flere grunner, inkludert men ikke begrenset til: a) den begrensede sensitivitet av aktuelle sekvenseringsmetoder i påvisning av punktmutasjoner i DNA ekstrahert fra FFPE-tumorer [39]; b) onkogene dereguleringen av de samme fire gener ved mekanisme andre da mutasjoner (for eksempel forsterkning som rapportert for
PIK3CA
); c) forekomsten av endringer i andre viktige elementer av EGFR-avhengige signalkaskade (så som for eksempel AKT eller MAPK); og d) nærværet av genetiske endringer i andre enn EGFR-tyrosinkinase-reseptorer, noe som gir en alternativ vei for overlevelse og /eller spredning. Ytterligere molekylære disseksjoner av EGFR-initiert onkogene signalkaskade sannsynligvis vil være nyttig for å bedre skreddersøm av EGFR målrettet terapi. Samlet våre resultater understreke betydningen av å bruke molekylærbaserte algoritmer for å skifte behandling av solide svulster inn i en epoke av personlig kreftmedisin.
Området merket med grått innenfor den stiplede linjen boksen beskriver hypotesen genereres i dette studie.
Vi foreslår å definere som «firedoble negative» den mCRCs mangler endringer i
KRAS
,
BRAF
, PTEN og
PIK3CA
.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Prøvene ble samlet inn i henhold til de etiske krav og forskrifter og innhente skriftlig samtykke som er godkjent av gjennomgangen styret i Ospedale Niguarda Ca «Granda, Milano, Italia og av Ospedale San Giovanni, Bellinzona, Sveits.
pasientgrupper og behandlingsregimer
Vi retrospektivt analysert 132 pasienter med EGFR-positive mCRC ved Ospedale Niguarda Ca «Granda (Milan, Italia), ved Oncogenomics Center, institutt for kreftforskning og behandling, (Candiolo, Italia), eller ved Institute of Pathology (Locarno, Sveits). Pasientene ga informert samtykke og ble behandlet med panitumumab- eller cetuximab-baserte regimer ved Ospedale Niguarda Ca «Granda eller ved Oncology Institute of Southern Sveits (Bellinzona, Sveits). Pasientene ble valgt basert på bevis for at behandlingsresultat kan tilskrives bare til administrasjon av panitumumab eller cetuximab. Pasientenes kliniske kjennetegn er rapportert i tabell 1. Med unntak av 13 pasienter som fikk cetuximab som frontline monoterapi [5], hadde de andre sviktet minst ett tidligere kjemoterapiregime. Twenty-tre (17,4%) fikk panitumumab monoterapi, femten (11,4%) pasienter cetuximab monoterapi, og nittifire (71,2%) cetuximab pluss irinotekanbasert kjemoterapi. For pasienter som progrediert på irinotekanbasert kjemoterapi, ble cetuximab administrert med irinotecan på samme dose og skjema som de var resistente. Behandlingen ble fortsatte til progressiv sykdom (PD) eller toksisitet forekom, som per standard kriterier [40].
Klinisk evaluering og tumorresponskriteriene
Klinisk respons ble vurdert hver 6-8 uker med radiologisk undersøkelse (CT eller MR) i henhold til RECIST kriterier. Objektiv tumorrespons ble klassifisert i partiell respons (PR), stabil sykdom (SD), og PD. Pasienter med SD- eller PD ble også definert som ikke-respondere. Respons på behandlingen ble også evaluert i ettertid av uavhengige radiologer.
Molecular analyserer
formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) tumorvev ble anmeldt for kvalitet og tumor innhold. En enkelt representativ blokk, fra enten den primære svulsten eller levermetastaser, avhengig av tilgjengelighet, inneholdende minst 70% av maligne celler, ble valgt for hvert enkelt tilfelle. Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp Mini kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Molekylære analyser ble utført på vevsprøve fra primærtumor brukes for første diagnose i 130 av 132 tilfeller. I to tilfeller ble utført bare analysen på metastaser (lever).
PTEN uttrykk
PTEN protein uttrykk ble evaluert av immunhistokjemi på 3 mikrometer FFPE- vevssnitt som rapportert [24] med noen modifikasjoner . Kort fortalt ble anti-PTEN AB4 (Thermo Fisher Scientific, CA, USA) med 1:200 fortynning og PTEN Ab2 (Neomarkers, Fremont, CA) med 1:50 fortynning brukes på Niguarda Hospital og ved Institutt for patologi av Locarno, henholdsvis. PTEN protein uttrykk ble hovedsakelig påvist i cytoplasma nivå, mens svært få tilfeller viste også atom positivitet. Svulster ble betraktet negativ, dvs. med tap av PTEN uttrykk, når fravær eller reduksjon av immunfarging ble observert i mer enn 50% av celler sammenlignet med den interne kontrollen (dvs. vaskulære endotelceller og nerver). Normal endometrium ble anvendt som ekstern positiv kontroll. Evalueringene ble utført av to uavhengige patologer uten kunnskap om kliniske data eller resultater av molekylære analyser.
mutasjonsanalyse av
KRAS
,
BRAF Hotell og
PIK3CA
i tumorprøver
Vi søkte på
KRAS plakater (ekson 2), for
BRAF plakater (ekson 15) og for
PIK3CA plakater (eksoner 9 og 20) mutasjoner.
KRAS
exon 2 omfatter kodon 12 og 13,
BRAF
ekson 15 omfatter kodon 600,
PIK3CA
ekson 9 omfatter kodon 542 og 545 og
PIK3CA
exon 20 inneholder kodonet 1047, hvor det store flertall av mutasjoner forekommer i disse genene [29]. Listen over primere som brukes for mutasjonsanalyse er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. Alle prøver ble underkastet automatisert sekvensering av ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle muterte tilfeller ble bekreftet to ganger med uavhengige PCR reaksjoner.
Statistiske analyser
Alle data ble analysert med egnede beskrivende statistiske metoder, etter å ha sjekket sine distribusjoner ved hjelp av Shapiro-Wilk test. Kryss tabuleringer av kvalitative variabler ble analysert med Fishers eksakte test, mens sammenligninger mellom kontinuerlige variabler ble utført med Student t eller Mann-Whitney U-tester. Logistisk regresjon med Wald test, og nøyaktig logistisk regresjon (håndteringen av enveis årsakssammenheng, som for eksempel det tilfellet hvor alle pasienter i en gruppe viser et positivt eller negativt resultat), med nøyaktig p-verdi (som sannsynligheten for å observere en mer ekstrem verdi med hensyn til tilstrekkelig statistikk for en gitt regresjon parameter) ble brukt for å vurdere univariat og multivariat analyse med binære endepunkt. Overlevelsen Analysen ble utført med Kaplan-Meier overlevende funksjon fulgt av logrank test, og med Cox modell; proporsjonal hazard antakelsen ble kontrollert ved hjelp av Schoenfeld restene. Statistisk signifikans ble antatt for p 0,05. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av Stata /SE 10.1 (den StataCorp, College Station, TX-USA).
Takk
Vi takker Salvatore Artale for klinisk behandling, Federico Pozzi for dataadministrasjon, Carlo Zanon og Silvia Benvenuti for sekvensanalyse og datahåndtering, og Roberta Schiavo for tilsyn av tumorprøver anskaffelser.
