Abstract
Fytokjemikalier er en rik kilde til chemoprevention agenter, men deres effekter på moduler Wnt /β-catenin signalveien har vært stort sett uninvestigated. Abnormt aktiverte Wnt signalering kan resultere i unormal stabilisering av β-catenin, en nøkkel utløsende trinn i et bredt spektrum av kreftsykdommer. Her rapporterer vi modulering av lithium klorid-aktivert kanoniske Wnt /β-catenin signal av fytokjemikalier som har antioksidant, anti-inflammatorisk eller chemopreventive egenskaper. Forbindelsene ble først screenet med en livmorhalskreft-avledet stabil Wnt signal reporter HeLa-cellelinjen. Positive treff ble deretter evaluert for β-catenin degradering, undertrykkelse av β-catenin nukleær lokalisering og nedregulering av nedstrøms onkogene mål for Wnt /β-catenin pathway. Vår studie viser en roman degradering vei β-catenin protein i HeLa celler ved Avenanthramide 2p (en polyphenol) og Triptolide (en diterpene triepoxide), henholdsvis fra havre og en kinesisk medisinsk plante. Funnene nåværende Avenanthramide 2p som en potensiell chemopreventive kosttilskudd sammensatte som fortjener videre studier ved hjelp av
in vivo
modeller av kreft; de gir også et nytt perspektiv på virkningsmekanismen til Triptolide
Citation. Wang D, Wise ML, Li F, Dey M (2012) Phytochemicals dempe Aberrant Aktivering av β-catenin i kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e50508. doi: 10,1371 /journal.pone.0050508
Redaktør: Yuntao Wu, George Mason University, USA
mottatt: 08.09.2012; Godkjent: 22 oktober 2012; Publisert: 03.12.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Arbeidet er støttet av National Institutes of Health gi R00AT4245 (til MD), USDA /SD-AES stipend 328100/318000 (til MD), SDSU AES Fund 3AH203 (til FL) og NIH stipend AI076125 (til FL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
medlemmer av Wnt familien skilles vekstfaktorer spiller viktige roller under embryogenese ved å regulere spredning, migrasjon, vev polaritet, og organogenesen, og bidra til utvikling av urin-systemet. I den kanoniske Wnt veien, β-catenin fungerer som sentral komponent [1]. Bindingen av Wnt til sin reseptor (frizzled) og ko-reseptor low density lipoprotein (LRP5 /6) hemmer dannelse av proteinkomplekset som omfatter Axin, glykogensyntasekinase-3 (GSK-3), og den adenomatøs polypose coli ( APC). Denne hemmingen resulterer i akkumulering av β-catenin i cytoplasma som senere translocates til kjernen [2]. I kjernen β-catenin binder seg til T-celle-faktor (TCF) som fører til transkripsjon av wnt målgener [3]. Denne avvikende β-catenin signalering er blitt observert i en rekke humane kreftformer, inkludert et flertall av kolorektal kreft, omtrent halvparten av prostatakreft og en tredjedel av melanomer [4].
β-catenin akselererer også human papilloma virus type-16 mediert livmorhalskreftutvikling i transgene mus product: [
5
]
.
Intriguingly β-catenin er tenkt å påvirke metastatisk potensialet av tumorceller ved å påvirke kromatin remodeling [6], så vel som å modulere oksidativt stress respons i celler [7]. Derfor har dempning av konstitutiv aktivering av β-catenin signalveien blitt et attraktivt mål for anti-kreft-terapi og forebygging.
Naturlig forekommende forbindelser representerer attraktive kandidater for utvikling som kjemopreventive midler når de er støttet av kunnskapsbaserte funn og mekanistisk forskning. Spesielt diettmidler omgå behovet for ytterligere innføring av fremmede forbindelser inn i friske asymptomatiske individer. Diett midler er også generelt mindre toksiske, mer biotilgjengelighet, mer tilgjengelig og mindre kostbart sammenlignet med syntetiske midler. I de siste årene har flere laboratorier identifisert en rekke fytokjemikalier som har potensielt nyttige biologiske egenskaper; imidlertid, er bare noen få grupper direkte undersøkt muligheten av disse midlene til å forstyrre β-catenin-mediert signalisering Wnt [4]. I denne studien rapporterer vi modulering av lithium klorid (LiCl)-aktivert Wnt /β-catenin signal av fytokjemikalier med kjent antioksidant, anti-inflammatorisk og chemopreventive egenskaper. Det er foreslått at kronisk vedvarende inflammasjon er en utløsende faktor for en rekke humane krefttyper. Mens utrydding og /eller vaksinasjon er fornuftige strategier, kan slike tiltak ikke klarer å forebygge kreft i saker om vedvarende betennelse med vev omorganisering og epigenetiske forandringer. Fordi oppregulering av Wnt familie ligander og nedregulering av endogene Wnt hemmere oppstå under den tidlige fasen av kreftutvikling, til anti-inflammatorisk agenter med potensial hemme den kanoniske Wnt signalveien er kandidatmidler for chemoprevention [8].
Avenanthramides (Avns) er en gruppe av naturlig forekommende polyfenoler funnet unikt blant matplanter, i havre, en populær sunn frokostblanding [9], [10]. AVN 2p, 2f og 2c er tre hovedformer som har blitt intensivt studert og er vist å ha overlegen anti-irriterende og antioksidantegenskaper [11], [12], [13], [14]. Biotilgjengeligheten av Avns er etablert i dyr og mennesker [11], [15]. De tre AVN kongenere synes å bli tatt opp og fordelt på de vev differensielt. Den rangordnet plasmakonsentrasjon av Avn etter type er 2p 2f 2c [16]. Inhibering av
in vitro
koloncancer celleproliferasjon og NFKB aktivering i endotelceller ved disse forbindelser er blitt demonstrert [9], [17]. Her undersøkte vi potensialet
in vitro
antiproliferativ aktivitet og cellulære mekanismer for Avns i humane livmorhalskreftceller.
Phenethylisothiocyanate (PEITC) er et godt studert isothiocyanate, som forekommer naturlig i form av sin glucosinolate forløper, gluconasturtiin, i Brassicaceae familien av grønnsaker som kål, blomkål, brønnkarse og brokkoli. PEITC viste chemopreventive potensiale mot ulike kreftformer [18] og uten noen åpenbar toksisitet, selv når det gis i høye doser hos rotter og hunder som bestemmes av NOEL (no-observert-negativ-effekt-nivå) i legemiddelsikkerhetsstudier [19]. Vi rapporterte sin anti-inflammatorisk virkning og tilhørende cellulære mekanismene [20], [21]. Det foreslås også at PEITC kan undertrykke kreft metastasering [22]. Siden β-catenin er tenkt å påvirke metastatisk potensial av kreftceller [6], evaluert vi noen potensielle effekten av PEITC på β-catenin signalering.
Triptolide, en diterpene triepoxide, er en viktig aktiv komponent av ekstrakter avledet fra medisinsk plante
Tripterygium wilfordii
Hook F. Triptolide har flere farmakologiske aktiviteter, inkludert anti-inflammatorisk, immunmodulering, antiproliferative og pro-apoptotiske aktivitet [23], [24], [25]. Triptolide har vært mye brukt i årtusener gamle medisinske tradisjoner praktiseres i Kina for inflammatoriske og autoimmune sykdommer, og mer nylig for organtransplantasjon og svulster [26]. Triptolide kan indusere tumorcelle-apoptose direkte, så vel som å forbedre apoptose indusert av cytotoksiske midler så som TNF-α, og kjemoterapeutiske midler ved å inhibere NFKB aktivering. Nylig har de cellulære målene for Triptolide, for eksempel MAP-kinase-fosfatase-1, varmesjokkprotein, 5-lipoksygenase, RNA-polymerase og histon metyl-transferaser, var blitt demonstrert [23]. Men til vår beste kunnskap, dette godt studert og mye brukt forbindelsen har ikke blitt evaluert i β-catenin signalering. Derfor vi inkludert Triptolide i vår nåværende studie.
Ordnet målsetting for denne studien var å etablere mekanistiske innsikt i de valgte phytocompounds knyttet til Wnt /β-catenin signal som kan være relevant for et bredt spekter av kreft. Alle forsøk ble utført ved anvendelse av HeLa-celler av human opprinnelse livmorhalskreft (ATCC, Manassas, VA). HeLa celler er infisert med papilloma virus som bidrar til en vedvarende betennelsesreaksjon i cellene. Papilloma virus antas å være årsaksfaktorer for human cervical cancer. Den HeLa genom har vært bemerkelsesverdig stabil etter år med kontinuerlig dyrking; derfor kan de genetiske endringer detekterte har vært til stede i den primære tumor og reflektere arrangementer som er relevante for utviklingen av cervikale og andre former for kreft hos mennesker [27]. En stabil rapportørcellelinje som uttrykker ildflueluciferase under påvirkning av TCF-promoteren ble produsert og optimalisert for å kontrollere transkripsjonen aktivering av β-catenin /TCF-komplekset som reaksjon på inngrep med testforbindelsene. Oppfølgingsundersøkelser inkluderte virkninger av forbindelsene på celle-proliferasjon, cytosoliske β-catenin degradering, kjerne β-catenin lokalisering og nedstrøms ekspresjon av c-myc transkripsjonsfaktor. Myc proto-onkogenet koder for c-Myc transkripsjonsfaktor, mutasjon av hvilket bidrar til dannelsen av mange humane kreftformer. Som en av de viktigste nedstrøms målene for β-catenin-TCF kompleks, spiller c-myc en nøkkelrolle i endret cellulær metabolisme under tumorigenesis [28]. For alle forsøkene ble β-catenin stabilisering og kanonisk Wnt signal aktiveres med LiCl. GSK-3 er en kinase som fosforylerer β-catenin i cytoplasma resulterer i induksjon av den kanoniske Wnt signal [29]. LiCl aktiverer den kanoniske Wnt /β-catenin veien ved å hemme GSK-3 [30], [31], som er uavhengig av en hvilken som helst reseptor /ko-reseptor-aktivitet. FH535 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) er et lite molekyl hemmer av Wnt /β-catenin signal [32], [33]. FH535 ble brukt i alle forsøkene som en kjent Wnt-hemmer.
Materialer og metoder
Plasmider, kjemikalier, cellelinjer og antistoffer
Plasmider 7TFP (Addgene plasmid 24308), pCMVdR8.2 (Addgene plasmid 8455), og pCMV-VSV-G (Addgene plasmid 8454) ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA). Den p7TFP vektor [34] er en replikasjons inkompetent, selv-inaktiverende lentiviral vektor inneholdende 7XTCF promoteren, ildflueluciferase reporter-genet og puromycin motstand kassetten for seleksjon [34]. Plasmidet pCMV dR8.2 [35] og pCMV-VSV-G [35], som koder for VSV-G-protein konvolutt, ble anvendt som lentiviral pakningssystem for fremstilling av smittsomme 7XTFP lentiviruser. Den pGL4.75 vektor som uttrykker Renilla luciferase genet ble kjøpt fra Promega Inc. (Madison, WI). Triptolide, FH535, PEITC, LiCl, Hoechst og polybren ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Puromycin, andre antibiotika og cellekulturmedier ble kjøpt fra Invitrogen (Grand Island, New York). Reagenser som brukes i kvantitativ PCR, inkludert enzymer ble levert av Applied Biosystems (Foster City, CA). HeLa-cellelinjen (CCL-2) og HEK293 T-cellelinje (CRL-11268) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Anti human β-catenin og anti humant p-aktin-antistoffer ble anskaffet fra Millipore (Billerica, Massachusetts). Dylight 680 anti-mus og Dylight 800 anti-kanin sekundære antistoffer ble oppnådd fra Li-Cor biovitenskap (Lincoln, Nebraska).
Kjemisk Syntese av Avns 2p, 2f og 2c fra Oats
Avns 2p, 2f og 2c ble syntetisert ved fremgangsmåter som er rapportert tidligere [36]. I korte trekk ble 5 mmol av det passende styrene (
p
-coumaric, ferulic eller koffeinsyre) i pyridin acetylert med overskudd av eddiksyreanhydrid. Etter reaksjon, ble kaldt vann tilsatt og utfellingen ble oppsamlet og tørket over natten. Til den acetylerte styrene i dimetylformamid, sammen med en liten mengde av trietylamin, ble det dråpevis tilsatt en ekvimolar mengde av benzotriazol-1-yloksy) tris- (dimetylamino) fosfonium-heksafluorfosfat oppløst i CH
2 Cl
2. Neste 5-hydroksy-antranilsyre (ekvimolar) i dimetylformamid ble tilsatt dråpevis. Reaksjonen ble stoppet med 0,5 M HCl. Etter ekstraksjon av det acetoxyavenanthramide i etylacetat og rotasjonsinndampning til tørrhet, ble de beskyttende acetylgruppene fjernes ved tilsetning av 5% pyrrolidin i CH
2 Cl
2. Den de-beskyttelses Reaksjonen ble stanset med 1 M HCI og AVN ekstrahert i etylacetat. Rensing av AVN ble utført ved LH-20 kolonnekromatografi.
Cell Culture
Den humane livmorhalskreft cellelinje HeLa (ATCC, CCL-2) og humane embryonale nyreceller 293T (ATCC , CRL-11268) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. HeLa 7TFP stabil reporter-cellelinjen ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 0,5 ug /ml puromycin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. Cellene ble oppbevart i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Cellene ble dyrket etter trypsinering når 90% konfluent med en 01:05 splitting forhold. For celleproliferasjonsanalyse bare ble cellene dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5% varme-inaktivert føtalt bovint serum, og 50 uM 2-merkaptoetanol. Celler ble sådd med forskjellige tettheter, som beskrevet i hvert forsøk. Levedyktige celler ble utført av trypanblått flekker ved hjelp av en hemocytometer.
Lentiviral Produksjon og Stabil Reporter Cell linje utvikling
Lentiviral produksjonen ble utført etter en modifisert protokoll fra Steward
et. al. product: [35]. Vi brukte en HeLa-cellelinjen som stabilt bærer lentiviral 7TFP reporter kassett inneholdende et ildflueluciferase rapportørgenet kontrollert av TCF-genpromoteren [34]. Den lentiviral levert Kassetten inneholder også en SV40-promoter-drevet puromycin resistensgen [34]. VSV-G pseudotyped lentivirus uttrykke 7TFP ble produsert i HEK293T celler ved co-transfeksjon av pCMV VSV-G, p7TFP, og pCMV dR8.2. HeLa-celler infisert med lentivirus ble inkubert i puromycin for 2 wk. Celler overlevende antibiotika utvalg ble spredd og preget for Wnt reporter aktivitet. Den lentivirale transduserte HeLa 7TFP stabil rapportør celler var stabile for Wnt rapportøraktivitet i minst 20 passasjer (data ikke vist) når det holdes i kulturmedium inneholdende 0,5 ug /ml puromycin.
Wnt Reporter Assay
En dobbel luciferase-assay ble anvendt for å bestemme graden av Wnt signal aktivering ved måling av β-catenin mediert TCF transkripsjon i HeLa 7TFP stabil rapportør cellene i respons til behandlinger med forbindelsene. Først ble transient transfeksjon utført som tidligere beskrevet [37]. HeLa 7TFP reporter celler ble dyrket på 6 cm kultur retter (2 × 10
6 celler hver oppvask). Etter 1d, for hver rett, ble 1 mikrogram av pGL4.75 blandet med transfeksjon løsning som inneholder tre ul Transit LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) og lagt til kulturen. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene trypsinert, resuspendert og sådd ut i brønner i en 96-brønns plate (2 x 10
4 celler per brønn). Seks timer senere, media ble erstattet med nye medier som inneholder behandlinger eller kjøretøy- dimetylsulfoksid (DMSO). Etter 4 timers inkubering, ble 50 mM LiCl tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 8 timer.
Wnt aktivering i de forskjellige prøver ble bestemt ved måling av ildflueluciferase aktivitet ved anvendelse av en dobbel Glo luciferase-assay kit ( Promega, Madison, WI). Ildflue luciferase-aktiviteten ble målt som luminescens ved anvendelse av en Synergy H4 hybrid Reader (BioTek, Winooski, VT) i celleekstrakter, normalisert for Renilla luciferase-aktivitet, og uttrykt som prosentvis endring sammenlignet med en LiCl behandlet positiv kontroll. Konsentrasjonene av testforbindelsene og deres behandling inkubasjonsperioder ble enten forhåndsbestemt ved hjelp av separate optimerings eksperimenter (data ikke vist) eller oppnådd fra tidligere rapporter [9], [20], [24], [32]. Betydningen av forbindelsen aktiviteter ble sammenlignet på en en-til-en basis med hensyn til LiCl kontroll (positiv kontroll). Celler ble behandlet med vehikkel (DMSO bare) og ikke aktivert ved hjelp av LiCl tjente som en negativ kontroll for å normalisere bakgrunnssignalet. Dataene ble uttrykt som prosent Wnt transkripsjon reporter aktivitet sammenlignet med LiCl.
Cell Proliferation Assay
evne HeLa-celler til å spre respons på ulike behandlinger ble målt ved hjelp av CellTiter 96® vandige løsning celleproliferasjonsanalyse (Promega Inc., Madison, WI), en kolorimetrisk metode for bestemmelse av antallet levedyktige celler i proliferasjon. Analysen benytter en tetrazolium-forbindelse [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium, indre salt; MTS] og en elektron koblingsreagens (fenazin ethosulfate; PES). Produsentens instruksjoner ble fulgt og behandlinger ble sammenlignet med kjøretøy kontroll (DMSO-behandlede celler) ved å lese absorbans ved 490 nm på en BioTek Synergy H4 multimode plateleser (BioTek, Winooski, VT). Alle data som vises er midler ± bred singlett. fra fire uavhengige forsøk.
Immunoblotting
HeLa-celler (CCL-2, ATCC, Manassas, VA) ble podet inn i 6-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
6 hver brønn . Neste dag, media ble fjernet og nye medier som inneholder indikerte konsentrasjoner av testforbindelser (AVN 2p, FH535, eller Triptolide) ble eller DMSO (kjøretøykontroll) lagt tilbake. Etter 4 timer ble LiCl til en sluttkonsentrasjon på 50 mM tilsatt til brønnene for en ytterligere 8 timers inkubering. Immunoblotting ble utført etter en protokoll beskrevet av
Gao et. al. product: [38]. I korthet ble cellene lysert i iskald RIPA [150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 0,4 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Nonident P-40 (NP-40)], etterfulgt av kort virvling og rotasjon i 30 min ved 4 ° C. Supernatanten ble overført, og fjernet ved sentrifugering. Like mengder (v /v) av cellelysater ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, blokkerte og dobbelt probet over natten med mus anti-humant β-catenin (1:2000 v /v) og kanin anti-humant p-aktin β ( 1:5000 v /v) antistoffer, og deretter inkubert med 680 Dylight anti-mus (1:5000 v /v) og Dylight 800 anti-kanin (1:5000 v /v) antistoffer. Blottene ble fotografert med et LI-COR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE).
immunfluorescens og Nuclear Localization analysen
HeLa-celler ble sådd på en 12 brønners plate på en tetthet på 2 x 10
5 hver brønn. Den neste dag, dyrkningsmedier ble fjernet, og en indikert konsentrasjon av hver forbindelse (AVN 2p, FH535, eller Triptolide) eller DMSO ble tilsatt tilbake. Den optimaliserte konsentrasjon av hver forbindelse ble på forhånd bestemt ved Wnt reporter analysen. Etter 4 timers inkubering, ble 50 mM LiCl tilsatt til brønnene for en ytterligere 8 timers inkubering. Immunofluorescens ble målt som tidligere beskrevet [37]. Celler ble immunofarget med mus anti β-catenin (1:1000 v /v) og geite-antimus Dylight 488 (1:2000 v /v) antistoffer sekvensielt. Kjerner ble farget med Hoechst fargestoff (0,1 ug /ml). Bilder ble samlet inn på
en EVOS FL epifluorescent mikroskop (AMG, Bothell, WA)
.
Det imaging data ble uttrykt som Dylight 488 (som indikerer β-catenin lokalisering), Hoechst (som indikerer nucleus) , og Merge (overlapping av Dylight 488 og Hoechst farging for samme syn). Nucleus lokalisering av β-catenin ble bestemt ved Dylight 488 farging i kjernen. Cellene med tilstedeværelse av β-catenin i kjernen ble tellet mellom 100 celler for hver behandling.
Total RNA ekstraksjon, rensing, og cDNA-syntese
Total RNA ekstraksjon, rensing og cDNA-syntese var utført som beskrevet av Dey
et. al
. tidligere [21]. Total RNA ble ekstrahert fra HeLa celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Grand Island, NY) etter produsentens anvisninger. RNA ble deretter behandlet med DNaseI (Invitrogen, Grand Island, NY) for å fjerne alle spor av DNA-kontaminering i henhold til produsentens retningslinjer. RNA ble kvantifisert spektrofotometrisk ved absorpsjonsmålinger ved 260 og 280 nm ved hjelp av Nanodrop 2000 systemet (Thermo Fisher Scientifics, Waltham, MA). CDNA ble syntetisert ved hjelp av 3 mikrogram av RNA for hver prøve ved hjelp MultiScribe revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA), etter produsentens protokoll.
Real Time Kvantitativ PCR
Sanntids kvantitativ PCR ble utført som tidligere beskrevet [21]. De syntetiserte cDNA ble fortynnet 2,5 ganger. To mikroliter av hver fortynnet prøve ble tilsatt 0,5 mL gen-spesifikke primere (6 mikrometer; oligonukleotider syntetisert av IDT Inc., Coralville, IA) og 12,5 mL av Brilliant SYBR grønt PCR Master Mix (2X) (Applied Biosystems, Foster City, CA). ROX ble anvendt som en intern fargestoff. For å unngå forstyrrelser på grunn av genomisk DNA forurensning, ble bare intron-overlappende primere valgt å bruke Primer Express versjon 2.0 programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA) som følger (forover og bakover par av primere er angitt som «F» og » R «, henholdsvis): c-Myc (Genbank-ID: NM_002467), F: 5′-caccagcagcgactctga-3 «, R: 5′-gatccagactctgaccttttgc-3′; β-aktin (Genbank-ID: NM_007393), F: 5»-ccaaccgcgagaagatga-3 «, R: 5′-ccagaggcgtacagggatag-3». PCR-amplifikasjoner ble utført på en MX3005p system (Stratagene, Santa Clara, CA). En ikke kontroll templat ble inkludert i PCR-programmet som et kvalitetskontrolltrinn. Standard ΔΔCt metode ble anvendt for den relative mRNA mengde beregning med hensyn til LiCl-fremkalte kontroll (positiv kontroll), som er normalisert til en verdi på 1,0 som beskrevet av Dey
et. al
. [21]. En verdi på mindre enn 1,0 indikerer transkripsjonen nedregulering (hemming av genekspresjon) sammenlignet med LiCl positiv kontroll, som viser maksimal genetisk induksjon (1,0). Derfor lavere verdier angir større Wnt inhibitorisk aktivitet. Amplifikasjon av spesifikke transkripter ble ytterligere bekreftet ved å skaffe smelter kurveprofilene. Alle prøver ble kjørt in duplo.
Statistical Analysis
Eksperimentelle observasjoner blir uttrykt som gjennomsnitt ± bred singlett. I alle figurer, er betydningen av en hvilken som helst behandling over den ubehandlede kontrollgruppe (DMEM for fig. 1C, LiCl for fig. 2, DMSO for Fig. 3, og LiCl til fig. 4B, 5B og 6) ble bestemt ved Students
t
test. Behandlinger ble ansett vesentlig annerledes dersom p 0,05 *, stor betydning dersom p 0,01 *, eller ekstremt viktig hvis p 0,001 * * *
A.. Lentiviral vektor 7TFP inneholder 7XTCF promoteren, ildflueluciferase, og puromycin-resistensgenet under kontroll av SV40-promotoren. LTR, lang terminal gjenta; RRE, Rev responsive element; FFluc, Firefly luciferase; SV40, Simian vacuolating virus 40; PuroR, puromycin motstand; WPRE, woodchuck hepatitt virus posttranskripsjonelt regulerende element; SYND; selvinaktive. B. Skjematisk representasjoner av 7TFP lentiviral produksjon av transfeksjon, lentiviral infeksjon, og stabil reporter cellelinjevalg. C. Validering av konsentrasjonsavhengig Wnt reporter respons fra den stabile produsent-cellelinje følgende LiCl induksjon (8 h) ble målt ved anvendelse av luciferase-aktivitet. Folder av Wnt reporter aktivitet i forhold til negativ kontroll (kjøretøy-behandlet) er vist som gjennomsnitt ± SE
Resultater
Produksjon og optimalisering av Stabil Reporter HeLa 7TFP cellelinje for høyt innhold Screening fytokjemikalier for kreft egenskaper
for å identifisere naturlig forekommende kjemiske modulatorer av Wnt signal, utviklet vi et høyt innhold av analyse for å måle aktivering, kjernekraft translokasjon og påfølgende binding av β-catenin til TCF transcriptional kompleks i HeLa celler. Inhibering av GSK-3-kompleks i cytoplasma fører til produksjon av aberrant β-catenin som deretter translocates til kjernen for å binde til TCF-komplekset utløsning nedstrøms aktivering av wnt spredningsveier gener. Vi brukte en HeLa-cellelinjen som stabilt bærer et lentiviral 7TFP reporter kassett inneholdende et ildflueluciferase rapportørgenet kontrollert av TCF-gen-promotoren (fig. 1A). For å demonstrere funksjonelle betydningen av HeLa 7TFP rapportørcellelinje, anvendte vi LiCl, et farmakologisk inhibitor av GSK-3 [31], [39], som en Wnt aktivator. Som vist på fig. 1C, 8 timer etter LiCl behandlings 7TFP celler viste en doseavhengig stimulering av Wnt signalrespons som angitt ved ildflueluciferase aktivitet. Ved 50 mM LiCl fremkalte en nær 1000 gangers reporter induksjon i forhold til den negative kontroll (DMEM). Derfor, for alle etterfølgende eksperimenter LiCl ble brukt ved 50 mM konsentrasjon. Vi har videre bekreftet evnen til analysesystemet for å identifisere forbindelser som påvirker Wnt signalering ved bruk av en kjent inhibitor av Wnt signalering, en syntetisk lite molekyl FH535 oppnådd fra Sigma Chemicals (St. Louis, MO) (stående validerings data ikke vist). Derfor ble FH535 anvendt som en referanse kontroll for alle etterfølgende eksperimenter som er vist i fig. 2-6.
Reporter og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt ved hjelp av en Dual Glo luciferase assay kit. Normaliserte prosentverdiene i forhold til LiCl kontroll er vist som gjennomsnitt ± bred singlett (n = 4). Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom sammensatte
–
behandlet celler og LiCl-indusert kontroll. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05
Utvalg av forbindelser for deres evne til å hemme Transkripsjonell Induksjon av Wnt signale
for å identifisere naturlige modulatorer av kanonisk Wnt signal og videre validere vår reporter analysesystem, utførte vi pilot og fokusert screening med fem forbindelser fra vårt laboratorium naturprodukt samling. Anvendelse av mere enn 25% inhibisjon ved den høyeste testede konsentrasjon, kombinert med konsentrasjonsavhengig inhibering kurve sammenlignet med LiCl positiv kontroll, identifiserte vi tre forbindelser som downregulated TCF-mediert signalisering Wnt aktivering (fig. 2). Avns 2p og 2f attenuated 30% av aktiveringen ved 40 uM konsentrasjoner, mens den samme grad av dempning ble oppnådd ved 22,24 nM Triptolide. Den syntetiske FH535 oppnås en større grad av Wnt signal dempning ved 10 uM konsentrasjon. Det viste ingen aktivitet på nanomolare nivåer (data ikke vist). Det bør nevnes at ingen åpenbare cellulære cytopatiske effekter ble observert ved bruk av et fasekontrastmikroskop i løpet av 12 timers eksponering av cellene for alle testede forbindelser. Vi observerte ikke vesentlige endringer i transkripsjonsaktiveringsnivå som svar på Avn 2p eller Triptolide med langvarig inkubasjon (12 h), sammenlignet med 8 h behandlinger.
Demping av HeLa Cell Proliferation av test Agents
Wnt signaleringsaktivering har vært knyttet til ukontrollert celleformering i løpet av karsinogenese [3]. I vår screening eksperiment ved hjelp stabil Wnt reporter HeLa-celler, 2p, 2f og Triptolide trykt LiCl aktivert TCF-mediert transkripsjon i en konsentrasjonsavhengig måte. Siden deregulert celleproliferasjon er et kjennetegn på kreftceller, ble antiproliferative virkningene av tre forbindelser som testet positivt i screeningsbestemmelsen (fig. 2) bestemt. Både Triptolide og Avn 2p viste signifikant, konsentrasjonsavhengig antiproliferativ aktivitet (Fig. 3). Avn 2f viste ikke antiproliferativ aktivitet under 24 timer kultur, og dermed bare 2p og Triptolide ble studert i senere eksperimenter.
Hela-celler ble dyrket med MTS dyrkingsmedium. Absorbans ble avlest ved 490 nm, og data ble uttrykt som prosent cellelevedyktighet i forhold til DMSO-kontroll (bærer). Normaliserte prosentverdiene i forhold til DMSO-kontroll er vist som gjennomsnitt ± bred singlett (n = 4). Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller mellom sammensatte
–
behandlet celler og kontroll. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05
Avn 2p og Triptolide fremmes Cellular
β-catenin
protein degradering
Videre mekanistisk gransking Wnt signal forstyrrelse av Triptolide og 2p ble utført. Siden Wnt signaleringsaktivering som ble undertrykt ved hjelp av forbindelsene, krever cellulær produksjon av β-catenin og dens binding til TCF transkripsjon kompleks i kjernen [3], undersøkte vi muligheten til forbindelsene for å forbedre cellulært β-catenin proteinnedbrytingen. Konsentrasjonsavhengig LiCl-indusert β-catenin protein degradering ble observert i respons til 2p og Triptolide i HeLa-celler (Fig. 4B). Redusert ekspresjon av β-catenin ble også observert i FH535-behandlede celler (Fig. 4B). Spesielt, endogene actin-ekspresjon ble ikke forandret i celler behandlet med 2p eller FH535, noe som indikerer at den observerte reduksjon av β-catenin var ikke på grunn av legemiddeltoksisitet (Fig. 4A).
A. β-catenin proteinekspresjon: Western blot var dobbelt probet med mus anti-humant β-catenin (1:2000 v /v) og kanin anti-humant β-aktin (1:5000 v /v) antistoffer, vasket i fosfatbufret saltvann, og ytterligere inkubert med Dylight 680 anti-mus (1:5000 v /v) og Dylight 800-anti-kanin (1:5000 v /v) antistoffer. LI-COR Odyssey Infrared Imaging System ble brukt i immunoblotting signal deteksjon. B. Densitometrisk analyse av β-catenin proteinnivåer (gjennomsnitt ± SE, n = 3): p-aktin ble benyttet som kontroll for rengjøring normalisering. Stjerne indikerer uttrykk nivåer av β-catenin i forbindelser-behandlede celler som er vesentlig forskjellig fra LiCl indusert kontroll:. *** P≤0.001, ** p≤0.01, * p≤0.05
Avn 2p og Triptolide opphevet Nuclear lokalisering av
β-catenin
Wnt signalresponsen er avhengig av den kjernefysiske lokalisering av β-catenin hvor den samhandler med TCF /LEF familie av transkripsjonsfaktorer for å aktivere Wnt veien. Derfor ønsket vi å bekrefte om mobilnettet degradering av β-catenin av 2p og Triptolide (Fig. 4) logisk fører til reduksjon i kjernefysiske lokalisering av β-catenin.
Som vist i fig. 5A, nukleær lokalisering av β-catenin ble betydelig inhibert i HeLa-celler behandlet med både forbindelsene sammenlignet med ubehandlede celler. Kvantitativ analyse av antall celler som oppviser atom β-catenin farging ut av 100 tilfeldig telte celler fra behandlede eller LiCl kontroll støttes videre vår observasjon (Fig. 5B). Omtrent 30% av ubehandlede celler besatt den nukleære translokasjonen av β-catenin i motsetning til 14% i 2p- og 8% i Triptolide-behandlede celler.
A. Mikroskopisk påvisning av β-catenin lokalisering av immunfluorescens: Jakten celler ble behandlet med kun kjøretøy (DMSO, topp panel), 15 mikrometer FH535 (andre fra toppen), 80 mikrometer Avn 2p (tredje fra toppen) eller 22 nM Triptolide (nederst) før til 50 mM LiCl induksjon for hver.
