Abstract
GIPC1 er en cytoplasma scaffoldprotein som samhandler med mange reseptor signalkomplekser, og nye bevis tyder på at det spiller en rolle i tumorigenesis. GIPC1 er sterkt uttrykt i en rekke humane maligniteter, inkludert bryst, eggstokk, mage og bukspyttkjertel kreft. Undertrykkelse av GIPC1 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler hemmer
in vivo
tumorvekst i immunsvikt mus. For bedre å forstå GIPC1 funksjon, undertrykt vi uttrykk i menneskelig brystkreft og tykktarmskreft cellelinjer og menneskelige mammary epitelceller (HMECs) og analysert både genekspresjon og cellulær fenotype. Undertrykkelse av GIPC1 fremmer apoptose i MCF-7, MDA-MD231, SKBR-3, SW480, og SW620 celler og svekker forankringsuavhengig koloni dannelsen av HMECs. Disse observasjonene indikerer GIPC1 spiller en avgjørende rolle i onkogene transformasjon, og dens uttrykk er nødvendig for overlevelsen av menneskelig brystkreft og tykktarmskreftceller. I tillegg ble en GIPC1 knock-down gen signatur brukes til å avhøre offentlig tilgjengelig bryst- og eggstokk-kreft microarray datasett. Dette GIPC1 signatur statistisk korrelerer med en rekke brystkreft og eggstokkreft fenotyper og kliniske utfall, inkludert pasientens overlevelse. Samlet utgjør disse dataene indikerer at GIPC1 hemming kan representere et nytt mål for terapeutisk utvikling for behandling av kreft hos mennesker
Citation. Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng H, Holton K, Prendergast N, et al. (2010) Terapeutiske implikasjoner av GIPC1 lyddemping i kreft. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10,1371 /journal.pone.0015581
Redaktør: Pawel Michalak, Virginia Tech, USA
mottatt: 20 oktober 2010; Godkjent: 12 november 2010; Publisert: 30.12.2010
Copyright: © 2010 Chittenden et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, MA, og RS ble støttet av midler fra Dana-Farber Strategic Fund Initiative og Claudia Adams Barr Foundation. J.Q. og J.C.M ble støttet delvis av et stipend fra National Library of Medicine (R01LM010129) av USAs National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
GIPC1, GIPC2 og GIPC3 utgjør den menneskelige GIPC genet familie, som er preget av et enkelt, konservert PDZ domene og GIPC homologi (GH1 og GH2) domener [1]. GIPC1 er et stillas protein som er involvert i celleoverflate-reseptor-ekspresjon, intracellulær trafikk, og signaltransduksjon. Vi viste tidligere GIPC1 spiller en sentral rolle i fysiologisk vekstfaktor signalering, endotelceller regulering, og arteriell forgrening morphogenesis i både mus og sebrafisk [2], [3]. Videre interagerer GIPC1 med og stabiliserer viktige reseptor aliserte komplekser, inkludert reseptor-tyrosin-kinaser TrkA og TrkB [4], [5], VEGF ko-reseptor neuropilin-1 [6], FGF ko-reseptor syndecan-4- [7], [ ,,,0],8], frizzled-3-reseptor [9], IGF-1-reseptoren [10], TGF-beta type III reseptor [11], og endoglin [12]. Disse reseptor komplekse interaksjoner reflektere rollen GIPC1 spiller som en adapter protein, som knytter flere vekstfaktor-støttet anerkjennelse prosesser for å intracellulære signalveier, som kulminerte i cellesyklusregulering blant andre funksjoner.
I kreft, ble GIPC1 identifisert som et immunogent antigen over-uttrykt i både bryst- og eggstokk-tumorer [13], [14]. GIPC1 og GIPC2 mRNA er uttrykt i Okajima, TMK1, MKN45 og KATO-III humane magecancerceller, og i forskjellige primære gastriske tumorer [15], [16]. GIPC1 er sterkt uttrykt i menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom og spiller en sentral rolle stabiliteten av IGF-1R i bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer [17], [18]. Nå nylig, ble GIPC1 undertrykkelse i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler vist å hemme
in vivo
bukspyttkjerteltumorvekst i immunsvikt mus [19]. Imidlertid er mekanismen som GIPC1 fremmer kreft vekst ikke er godt etablert.
For å undersøke hvilken rolle GIPC1 spiller i kreft, brukte vi RNAi å undertrykke GIPC1 uttrykk i både bryst og kolorektal kreft celler og menneskelige mammary epitelceller (HMECs). Vi startet vår studie ved å undersøke endringer i global genuttrykksmønster etter GIPC1 undertrykkelse. Vår analyse viser at GIPC1 er nødvendig for brystkreft og tykktarmskreft celleoverlevelse og spiller en viktig rolle i onkogene transformasjon.
Resultater
GIPC1 taushet genuttrykk mønster i MDA-MB231 menneskelige brystkreft celler
GIPC1 genekspresjon ble slått ned i MDA-MB231 celler ved transduksjon av korte hårnål RNA (GIPC1 KD), sammen med tom-vektor og ikke-omsatte kontroller. Etter puromycin utvalg, ble syv uavhengige biologiske replikater av hver transduksjon dyrket i kultur, ble RNA ekstrahert, og GIPC1 knock-down ble analysert ved hjelp av qPCR. qPCR funnet 85% knock-down i GIPC1 KD celler i forhold til ikke-omformet og tom-vektor kontroller. RNA fra de uavhengige bassengene ble hybridisert til Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 GeneChips ™, data ble normalisert ved hjelp av Robust Multi-Array analyse [20] implementert i Bioconductor
AFFY
pakken, og utforskende analyse utført med hierarkisk clustering hjelp den Bioconductor pakken,
made4 product: [21]. En sterk biologisk effekt av GIPC1 lyddemping ble observert (Figur S1). Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM, q-verdi = 0%). [22] ble brukt til å identifisere 3081 probesets (~2271 gener) med endret uttrykk i GIPC1 KD celler sammenlignet med vektorkontrollcellene
Dette GIPC1 KD genet listen ble sammenlignet med dem presentert av Bild et al. [23], som analyserte over-uttrykk for fem onkogener (aktivert H-Ras, menneskelig E2F3, aktivert β-catenin, human c-myc og human c-Src) i grunnskolen HMECs, ved hjelp av
OrderedList product: [ ,,,0],24]. Vi fant en statistisk signifikant overlapping av unormalt uttrykte gener i GIPC1 KD og de aktiverte H-Ras over-uttrykk genet lister (P«0.05, figur S2).
3081 GIPC1 KD probesets representerer 2271 gener ble brukt i en funksjonell berikelse analyse ved hjelp av Expression analyse Systematisk Explorer (ENKEL) [25] og nestet letthet, som gjelder EASE representasjons analyse iterativt å identifisere GO datter vilkår som driver betydningen av høyere nivå vilkår (Chittenden
et al
., submitted). ENKEL bruker Fishers eksakte test for å identifisere funksjonelle klasser i gen-sett som er overrepresentert i forhold til bakgrunnen fordeling av gener analysert. Åtte av 67 overrepresentert genet ontologi (GO) termer funnet av EASE er vist i tabell 1, blant disse er begreper knyttet til celleproliferasjon, cellesyklus, cellesyklus arrest, apoptose, cellemigrasjon, og ubiquitin-medierte protein degradering.
Nøstet ENKEL (nEASE) er en utvidelse av letthet som bruker en annen, sub-nivå, iterativ Fishers eksakte test for å finne GO underklasser som driver ENKEL sikt utvalg. Resultatene, vist i tabell 2, er 17 statistisk anrikede funksjonelle undergrupper av cellulære prosesser funnet av EASE. nEASE fant at EASE-signifikant GO biologisk prosess klasser,
celleproliferasjon
,
protein modifikasjon
,
mitose
,
cellevekst og /eller vedlikehold
cytoskjelettet organisasjon og biogenesis
, og
fysiologisk prosess
er kollektivt drevet av de biologiske prosessene
celle adhesjon og inte-mediert signale
. Tilsvarende ENKEL-signifikant sikt
cytoplasma organisasjon og biogenesis
ble funnet av nEASE å være drevet delvis av
cytokinese etter mitose
. nEASE funnet
apoptose
betydelig grunn til å gå begreper knyttet til
regulering av aktin filament Hotell og
JAK-STAT signalkaskade
. Altered uttrykk ble funnet i gener som er involvert i både
celle migrasjon Hotell og
metabolismen
; endringer i
ubiquitin-protein ligaseaktivitet
skyldes endringer i proteinbinding. nEASE indikerer også at GIPC1 KD endrer uttrykket av gener i EGF, TGFfi, og Wnt reseptor signalveier.
Sammen er disse data tyder på at GIPC1 er involvert i celleproliferasjon, apoptose, cellemotilitet og heft og ubiquitin-medierte protein degradering. Disse dataene antyder at GIPC1 spiller en bred rolle utover sin tidlige tilknytning vaskulær regulering og at det kan, i kreft, være involvert i prosesser knyttet til celle- sykluskontroll.
GIPC1 lyddemping hemmer MDA-MB231 spredning og induserer apoptose
Fordi GIPC1 KD påvirker prosesser knyttet til cellevekst, vurdert vi effekten av GIPC1 uttømming på MDA-MB231 celleproliferasjon. Vi er fast bestemt celle levedyktighet etter GIPC1 utarming av både Resazurin og MTS tetrazoliumreduksjon analyser i eksperimentelle og kontrollceller. I begge tilfeller forårsaker GIPC1 stanse en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet ved 48 timer etter utsåing (figur 1A og 1D). Siden GIPC1 interagerer med neuropilin-1 [6], ble cellene behandlet med VEGFA (10 ng /ml) for å fastslå om tap av cellelevedyktighet forårsaket av GIPC1 undertrykkelse kan overvinnes ved en relevant mitogen. VEGFA behandlingen er ikke tilstrekkelig til å hindre en omtrentlig 40% og 60% reduksjon i celleviabilitet i GIPC1 KD celler ved 48 og 72 timer, respektivt (figur 1D).
A. Vurdering av cellelevedyktighet (blå) og kaspase 3/7 aktivitet (rosa) ved 0, 24, 48 og 72 timer. Solide linjer med blå boksene (ikke-transdusert) og blå diamanter (utenfor målgruppen) og stiplet linje med blå trekanter (GIPC1 KD) indikerer celle levedyktighet. Pink betegner caspase 3/7 aktivitet. B. Normalisert caspase 3/7 aktivitet. Total caspase 3/7 aktivitet var normalisert til celle levedyktighet og vurderes på 0, 24, 48 og 72 timer. Normalisering indikerer en 2,1 ganger økning i caspase 3/7 aktivitet i GIPC1 KD celler sammenlignet med ikke-målceller på 72 timer. C. Tunnel analysen. DNA-fragmentering ble bestemt som% positive kontroll. GIPC1 KD korrelerer med en 11,24 ganger økning i apoptose (GIPC1 /Non-målet; P 0,05). D. Evaluering av celleproliferasjon etter VEGF (10 ng /ml) induksjon. Proliferasjon ble evaluert ved 0, 24, 48 og 72 timer. Dag 1, 2 og 3 ble normalisert til dag 0. Solid linjer med blå boksene (ikke-omformet) og blå diamanter (utenfor målgruppen) og stiplet linje med blå trekanter (GIPC1 KD) indikerer celleproliferasjon i sult media. Pink betegner VEGF induksjon. D. Evaluering av spaltet PARP1. PARP1, kløyvde PARP1, GIPC1, og GAPDH uttrykket ble vurdert av western blot i MDA-MB231 menneskelige brystkreft celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P≤0.05) mellom ikke-målet og GIPC1 KD forhold.
GIPC1 KD påvirker også apoptose. For å bestemme effekten GIPC1 støydempere på kaspase 3/7 aktivitet, ble den fluorometriske resazurin reduksjon analysen vist i Figur 1A multiplekset med en Apo-ONE homogen caspase-3/7 assay. Når caspase 3/7 aktiviteter er normalisert til cellenes levedyktighet verdier, vi har oppdaget en signifikant økning i kaspase 3/7 aktivitet i GIPC1 KD celler når sammenlignet med kontrollcellelinjer etter 72 timer (figur 1B). Vi fant lignende tap av celle-levedyktighet og øket caspase 3/7 drift etter GIPC1 stanse i MCF-7 og SKBR-3 human brystkreft og SW480 og SW620 human kolorektal cancer-cellelinjer (data ikke vist).
For å avgjøre om økningen i caspase 3/7 aktivitet funnet i MDA-MB231 celler er assosiert med DNA fragmentering, utførte vi en deadend kolo TUNEL analysen (figur 1C). GIPC1 målretting induserer DNA-fragmentering; vurdert som et forhold i forhold til kontrollceller, er det relative forholdet av apoptotiske celler (GIPC1 KD /ikke-target-) 11,24 (P 0,05). Videre er økningen i begge kaspase 3/7 aktivitet og DNA-fragmentering i GIPC1-dempede-celler assosiert med en økt ekspresjon av spaltet PARP1 (figur 1D). Disse dataene er konsistent med microarray funn (tabell 1 og 2), noe som indikerer GIPC1 lyddemping hemmer celledeling og fremmer apoptose.
GIPC1 lyddemping induserer MDA-MB231 G2 cellesyklus arrest
Microarray resultatene innblandet cellesyklus effekten av GIPC1 KD. Vi utførte enkanals FACS-analyse av GIPC1 KD celler og de tilhørende kontroller for å oppdage cellesyklus i kontroll og GIPC1 KD celler. GIPC1 undertrykkelse fremmer subtil G1 og dyp G2 arrest på dag 14 etter puromycin utvalg av GIPC1 shRNA transfektanter (Figur 2A). Disse data indikerer akkumulering av celler i både G1 (43,70% ± 1,86% celler versus 38,58% ± 0,21%) og G2 (46,33% ± 1,29% vs. 27,70% ± 0,67%) fasene av cellesyklusen i GIPC1 KD sammenlignet ikke-mål kontrollceller. GIPC1 KD celler fortsette å traversere S-fasen mot fremtredende G2 arrest (9,98% ± 0,57% vs. 33,73% ± 0,53%). GIPC1 knockdown resulterer også i en signifikant akkumulering av celler i en 8N DNA topp (9,74% ± 0,67% vs. 0%) og i cellerester (sub-G1, 5,52% ± 0,54% vs. 1,57% ± 0,17%). Sammen med de mikroarray resultatene presentert i tabell 1 og 2, og sammenlignet med hensiktsmessige kontroller, tyder disse data GIPC1 undertrykkelse fremmer celledeling og apoptose.
A. Enkelt kanal FACS-analyse av ikke-transdusert, ikke-mål, og GIPC1 KD celler 14 dager etter transduksjon. Grey er% celler i G1. Gul indikerer% celler i S-fasen. Orange er lik% cellene i G2. Blå er% celler ved 8N. D indikerer% rusk. B. Western blot-analyse av Cdc25b, GIPC1, og GADD 45 α /γ ekspresjon i ikke-transdusert, ikke-mål, og GIPC1 KD celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P≤0.05) mellom ikke-target og GIPC1 KD forhold.
For å finne årsakene til unormal cellesyklusen funnet med GIPC1 undertrykkelse, vi brukte Western blotting for å evaluere protein uttrykk av kjent celle-syklus check-point regulatorer funnet forskjellig uttrykt i microarray analyse. GIPC1 stanse induserer et tap av Cdc25b og en økning i GADD45α /γ proteinekspresjon (figur 2B). CDC25b er nødvendig for CDK1 aktivering og inntreden i mitose; mens, er uttrykk for GADD45 protein familiemedlemmer økt etter vekst arrest og DNA-skader. Disse funnene støtter både microarray (tabell 1 og 2) og FACS (figur 2A) Resultatene indikerer at GIPC1 undertrykkelse hovedsakelig fremmer G2 arrest.
GIPC1 undertrykkelse endrer celle adhesjon og motilitet
Microarray funn tyder GIPC1 er involvert i adhesjon og motilitet (tabell 1 og 2). Vi vurderte effekten av GIPC1 stanse på cellemotilitet og heft i MDA-MB231 eksperimentelle og kontrollceller. GIPC1 lyddemping betydelig forbedret MDA-MB231 celle adhesjon på både 30 og 60 minutter etter plating (figur S3A). Vi brukte en ripe (sår) analyse for å vurdere virkningene av GIPC1 KD på cellemotilitet. GIPC1 undertrykkelse signifikant redusert MDA-MB231 cellemigrasjon, enten med eller uten åtte timers vekstfaktor-induksjon (fig S3b). Microarray funn indikerer GIPC1 undertrykkelse er forbundet med en anrikning av unormalt uttrykte gener innenfor integrin-medierte, RHO protein, JAK-STAT, EGF, Ras, TGFp og wnt baner (Tabell 2 og Figur S2). Disse banene, først funnet i vår bioinformatikk analyse, regulere både celle adhesjon og migrasjon og er kandidater for videre undersøkelser. Eksperimentelt, GIPC1 depletion resulterer i forbedret celle adhesjon og redusert cellemotilitet. GIPC1 uttømming resulterer i tap av EGF, FGF2, PDGF-BB, TGFβ1, og VEGFA indusert celle motilitet (figur S3b). Disse data antyder at GIPC1 spiller en rolle i en rekke viktige signaltransduksjonsveier som har betydning for både celleadhesjon og motilitet.
GIPC1 er nødvendig for forankrings-uavhengig koloni dannelse av tHMEC-LT-st cellelinje
for å vurdere om GIPC1 er nødvendig for onkogene transformasjon, undertrykt vi uttrykk i hTERT-udødelig HMECs transformert med SV40 stor T (LT) og Small T (m) antigener (tHMEC-LT-st) [26]. tHMEC-LT-st-celler er i stand til forankrings-uavhengig vekst; imidlertid, GIPC1 uttømming redusert i betydelig grad effektiviteten av forankrings-uavhengig koloni dannelse av tHMEC-LT-st-cellelinje sammenlignet med kontrollceller. Som en ytterligere kontroll ble en andre GIPC1 shRNA-konstruksjon som brukes i dette settet av eksperimenter (figur 3A). Disse data indikerer at GIPC1 er nødvendig for forankrings-uavhengig koloni formasjon, er et mål på onkogen transformasjon av HMEC celler.
A. Soft agar-kolonidannelse i nontransduced, ikke-målet, og GIPC1 KD tHMEC-LT-st celler celler. B. Western blotting indikerer effectivness av GIPC1 stanse med to uavhengige GIPC1 shRNA contructs: NM_005716.2-1083s1c1 og NM_005716.2-499s1c1. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P≤0.05) mellom ikke-målet og GIPC1 KD forhold.
Klinisk relevans av gener som reguleres av GIPC1 knock-down
For å vurdere antakelsen om at ytterligere GIPC1 spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker, 411 probesets med en fold-endring ≥2 i SAM analyse av GIPC1 utarmet MDA-MB231 celler sammenlignet med kontrollceller (GIPC1 signatur; Tabell S1) ble brukt til å avhøre to offentlig tilgjengelig og klinisk annotert brystkreft og eggstokkreft datasett med Bioconductor pakken,
globaltest product: [27]. En stor sammenslåtte brystkreft DNA mikroarray datasett med 689 forbehandling prøver [28], [29], [30] og en ovarial cancer datasett med 274 pasienter behandlet med [31] ble anvendt for analysen. I Global Test multivariat analyse av 689 brystkreftpasienter, er GIPC1 KD signatur i forbindelse med svulst Karakter (P 0,01), lymfeknutestatus (P 0,0001), og ER status (P 0,05). Den GIPC1 signatur er også sterkt forbundet pasient overlevelse innenfor ErbB2 + /ER + (n = 42, P 0,001), luminal B (n = 146, P 0,05) og basal (n = 92, P 0,01) molekylær brystkreft subtyper (Tabell 3). Analyse av eggstokkreft datasettet indikerer at GIPC1 signatur er signifikant assosiert med alle kliniske variabler vurderes; inkludert pasientens overlevelse og tumorstadium, klasse, og type (Tabell 3). Disse dataene støtter siste rapportene tyder på at GIPC1 spiller en rolle i menneskelig brystkreft og eggstokkreft etiologi og progresjon [13], [14].
Diskusjoner
Lite er kjent om rollen av GIPC1 i tumorvekst og progresjon. Bevis indikerer at den er høyt uttrykt i en rekke humane maligniteter, inkludert bryst, eggstokk, mage og bukspyttkjertel kreft [13], [14]. Videre er en fersk rapport viser GIPC1 kreves for
in vivo
bukspyttkjerteltumorvekst i immunsvikt mus [19]. I denne studien brukte vi både beregnings og eksperimentelle tilnærminger til å undersøke GIPC1 i menneskets bryst og kolorektal kreftceller, og hos pasienter med brystkreft og eggstokkreft. Vi fant ut at GIPC1 er nødvendig for brystkreft og tykktarmskreft celleoverlevelse, og det spiller en viktig rolle i onkogene transformasjon av menneskelige mammary epitelceller.
Våre data viser også GIPC1 spiller en viktig rolle i cellesyklusregulering. ENKEL analyse av GIPC1 knockdown i MDA-MB231 celler viser anrikning av ulikt uttrykte gener med kommenterte funksjoner i G1 /S og G2 /M overganger, cellesyklus arrest, celleproliferasjon, og apoptose. nEASE søker biologiske forklaringer på disse hovedeffektene og impliserer potensielle avvik i celle adhesjon, inte-mediert signalering, og regulering av aktin cytoskjelettet. I tillegg nEASE funnet en berikelse av gener involvert i cytokinese. Dette funnet er i samsvar med en fersk rapport som viser at aktivering av syndecan-4 (SDC4), et trans heparansulfat proteoglykan som samhandler med GIPC1 og FGFR1 reseptoren for å regulere FGF2 signalering, er nødvendig for cytokinese av MCF-7 humane brystkreftceller [32]. Keller-Pinter
et al
. viste at serine179-fosforylering og ectodomain Shedding av SDC4 er maksimal i G2 /M. Uttrykk av konstruerte mutanter ligne serin 179-fosforylering (Ser179Glu) eller fosforylering bestandig SDC4 forårsaket ufullstendig abscission og gigantiske, multinucleated celler [32]. I tillegg SDC4 regulerer aktin polymerisasjon, fokale vedheft formasjon, og cellemotilitet gjennom PI3K signale
nEASE analyse antyder også at GIPC1 er involvert i seks store signaltransduksjon nettverk i brystkreft:. Grin-mediert, RHO protein, JAK-STAT, EGF, TGFp og WNT. Disse funnene støtter tidligere rapporter som indikerer at GIPC1 samvirker med frizzled-3-reseptor [9], TGF-beta type III reseptor [11], og endoglin [12]. Til tross for at vår analyse ikke foreslå en berikelse av gener innenfor PI3K signaltransduksjon nettverk, finner vi at GIPC1 undertrykkelse reduserer uttrykk for en rekke viktige gener involvert i veien, inkludert
SDC2, PIK3CB, PIK3D, PDK1, akt3, CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1, etter og
Rac1
. Omvendt, fremmer GIPC1 stanse betydelige økninger i genuttrykk for
PTEN, p27
Kip1, RHOBTB1, RHOB, etter og
Pak2
. Mens avvikende aktivering av PI3K signalering er involvert i induksjon av onkogene transformasjon, disse genene virker sammen for å integrere mekanismene som styrer en rekke cellulære prosesser, blant annet cytoskjelett regulering, celle motilitet og adhesjon, celleproliferasjon og apoptose [26], [ ,,,0],33].
Eksperimentell validering av genuttrykk profilering resultater indikerer at GIPC1 lyddemping fremmer G2 cellesyklus arrest, apoptose, og alter i celle adhesjon og bevegelighet i MDA-MB231 menneskelige brystkreft celler. GIPC1 uttømming korrelerer med økt caspase 3/7 aktivitet, DNA fragmentering, oppregulering av GADD45 familiemedlemmer, og tap av Cdc25b uttrykk. Videre korrelerer GIPC1 stanse med markert reduksjon i celle levedyktighet og evalueringer i caspase 3/7 aktiviteter i MCF-7 og SKBR-3 human brystkreft og SW480 og SW620 menneskelige kolorektal kreft celler.
Ved å bruke RNAi å utarme GIPC1 mRNA i MDA-MB-231-celler var vi i stand til å identifisere et bredt spekter av gener hvis ekspresjon ble endret. Vi har sammenlignet denne GIPC1 signatur i offentlig tilgjengelig bryst- og eggstokk-kreft genuttrykk datasett som godt kommenterte fenotype og resultatdata var tilgjengelig. Vi fant sterk sammenheng mellom GIPC1 signatur og en rekke viktige pasient kliniske variabler.
I brystkreft, brukte vi Global Test metodikk og fant tilbakefall overlevelse var signifikant assosiert med GIPC1 signaturen kun innenfor spesifikke molekylære undergrupper av sykdommen: pasienter med luminal B ER + tumorer (høyverdig ER +; P = 0,015), ErbB2 + /ER + sykdom (P = 4,3 × 10
-4), og kanskje basal-lignende eller trippel-negativ kreft (P = 0,0074). Innenfor luminal A ER + (lavgradig ER +) tilfeller og pasienter med ErbB2 + /ER- kreft, den GIPC1 signaturen var ikke prediktiv av tilbakefall overlevelse. Derfor kan GIPC1 signatur være i stand til å skille pasientens utfall innenfor grupper av høy klasse brystkreft, særlig de som er ER +, og ikke bare skille tumor Karakter (høy vs lav) eller ER status (positiv versus negativ). I eggstokkreft datasettet er GIPC1 signatur statistisk korrelert med alle kliniske variabler vurderes: total overlevelse og svulst klasse, type, og scenen. Et fellestrekk ved de sammenhengene vi har funnet mellom GIPC1 signatur og kliniske parametre i bryst- og eggstokkreft var en forening med høyverdig svulster som er preget av overdreven DNA-skader og dårlig pasient prognose.
Den tilgjengelige uttrykk data indikerer at GIPC1 er sterkt uttrykt i hver human kreft og tyder våre resultater GIPC1 er en nødvendig komponent for vekst human kreft fremmes ved oppstrøms vekstfaktorer og deres reseptorer. Fordi GIPC1 signaltransduksjon aktiveres av et bredt spekter av celleoverflatereseptorer, og fordi det er også kjent for å være essensiell for forgrening morfogenese av arterielle blodkar, rettet GIPC1 medierte baner er et logisk terapeutisk strategi for behandling av kreft hos mennesker. Spesielt tyder våre data målgruppe GIPC1 kan være spesielt viktig for østrogenreseptor-positiv høyverdig brystkreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
MCF-7 ble MDA-MB231, og SKBR-3 humane brystkreftcellelinjer og SW480 og SW620 menneskelige kolorektal kreft cellelinjer kjøpt fra ATCC. Menneskelige mammary epitelceller (HMECs) ble kjøpt fra Invitrogen (# A-10565). Primære HMEC eksperimenter ble utført ≤ passasje 10.
hTERT
-immortalized HMECs uttrykker SV40 LT og st ble dyrket som beskrevet tidligere [26]. Alle cellelinjer ble dyrket i 100 × 20 mm vevskulturstudier retter (Becton Dickinson # 353803). MCF-7 celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i EMEM (GIBCO # 11095-080) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (ATCC # 30-2020) og 1% Antibiotikum-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). MDA-MB231-celler ble dyrket ved 37 ° C og 0% CO
2 i Leibovitz L-15 media (Gibco # 11415-064) supplert med 10% FBS og 1% Antibiotikum-Antimyotic. SKBR-3-celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i McCoys 5A media (GIBCO # 12330-031) supplert med 10% FBS og 1% Antibiotika Antimyotic. SW480 og SW620-celler ble dyrket ved 37 ° C og 0% CO
2 i Leibovitz L-15 media supplert med 10% FBS og 1% Antibiotikum-Antimyotic. Primære HMECs ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i Mellom 171PRF (fenolrødt-fritt) (GIBCO # M-171PRF-500) supplert med melke epitelial vekstsupplement (Mb) (Gibco # S-015- 5) og 1% Antibiotika Antimyotic. Alle cellelinjer ble opprettholdt på 60-70% konfluens.
shRNA lentiviral vektor produksjon og transduksjon
GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 og NM_005716.2-499s1c1) og tomme vektor shRNA plasmider som samt Delta 8,9 og VsVg plasmider ble hentet fra The RNAi Facility på Dana-Farber Cancer Institute. En egge, non-target shRNA plasmid ble kjøpt fra Sigma (# SHC002). cDNA versjoner av SV40 LT + st (LTG) ble klonet inn pWZL-blast som tidligere beskrevet [26]. Alle plasmider ble dyrket i LB buljong 100 ug /ul Ampicillin (Teknova # L8105). Plasmider ble renset ved hjelp av Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen # 12663), og gir ble vurdert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific # SID-10135606). HEK 293T /17-celler (ATCC # CRL-11268) ble ekspandert til en tetthet på 5 x 10
6/100 mm cellekulturskål (BD Primaria # 353803) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (ATCC # 30-2002) + 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (ATCC # 30-2020) og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 til 24 timer. Hver plate ble deretter transfektert med Fugene 6 Transfeksjon Reagens (Roche # 11814443001), VsVG renset plasmid, Delta 8,9 renset plasmid, og enten 6 mikrogram shRNA renset plasmid eller 4 mikrogram renset LTG
WB plasmid i OptiMem media (Invitrogen # 11058-021). Media ble endret en dag etter transfeksjon med DMEM + 10% FBS medier som inneholder 1% Antibiotika Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). Media inneholdende pakkede virus ble oppsamlet på dag 2 etter transfeksjon, friskt medium ble tilsatt, og den virale innhøstingen ble oppsamlet igjen på dag 3 etter transfeksjon. Den pakkede lentivirus ble filtrert med 0,45 um filter (Corning # 431220) og konsentrert i 90 minutter ved 16 600 g ved anvendelse av en ultrasentrifuge (Beckman L8-70M #). Etter resuspensjon ble lentivirus titered bruker QuickTiter Lentivirus Kvantitering Kit (Cell Biolabs # VPK-108-HIV) per produsentens instruksjoner. For lentiviral shRNA vektor transduksjon, vekstmedier inneholdende polybren og et volum av lentivirus som likestilles med en MOI på 50 ble tilsatt til cellene og inkubert over natten i cellelinje-spesifikk dyrkningsbetingelser. Neste dag, virus medium ble erstattet med cellelinje spesifikk vekstmedier. Ved 72 timer ble vekstmediet supplert med enten 10 ug /ml puromycin og /eller 2,5 ug /ml blasticidin. Eksperimenter ble utført 14 dager etter valget.
RNA isolering, microarray hybridisering og prosessering, og kvantitativ PCR
Total RNA ble isolert fra cellelinjer ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen # 74106) i henhold til produsentens spesifikasjoner med QIAshredder kolonner (Qiagen # 79656) for celle pellet homogenisering. Total RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific # SID-10135606). Tjue en Affymetrix Genechip Human Genome U133 Plus 2,0 Arrays ble brukt i denne studien. Syv arrays per gruppe ble brukt for følgende MDA-MB231 cellelinjer: ikke-omsatte, tom vektor og GIPC1 KD. Microarray hybridisering og behandling ble utført ved hjelp av standard protokoller på microarray kjernen Facility på Dana-Farber Cancer Institute. Utvalgets behandling ble utført med Affymetrix Genechip lufthåndtering Station FS450 og matriser ble skannet med en GCS300 radarantenne i henhold til produsentens anbefalinger. To-trinns Kvantitativ Real-Time PCR ble utført med en Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems # 4329001) system. TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems # Hs00991802_m1) og 18S Endogen kontroll (Applied Biosystems # 4304437) Analysene ble gjennomført ved 8 gjentak per prøve å bruke Relative Kvantifisering (Delta Ct), Fam ingen kjøle innstillinger. Delta CTS ble beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige Ct av endogene kontroller fra den gjennomsnittlige Ct av forsterknings målet. Delta-delta Ct ble beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige delta Ct av de tomme vektor prøvene fra den gjennomsnittlige delta-Ct av målvektoren prøvene. Brett endringen ble beregnet som to til makten av delta-deltaet Ct.
microarray data normalisering og analyse
Rådata (.cel filer) ble importert til R og data ble normalisert med RMA [ ,,,0],20] med Bioconductor pakken,
AFFY
. Initial utforskende data analyse ble utført med hierarkisk clustering analyse (gjennomsnitt-kobling og metriske 1 – Pearson korrelasjonskoeffisient avstand) ved hjelp av Bioconductor pakken,
made4 product: [21]. To klasse uparet Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM;. [22] med en 0% falsk oppdagelse hastighet (Q-verdi) ble anvendt for å bestemme differensial genekspresjon mellom tom vektorkontroll og GIPC1 KD MDA-MB231-celler
