Abstract
Spesial AT-rik sekvens-bindende protein-1 (SATB1) har blitt identifisert som et genom arrangør som omprogrammerer kromatin organisasjon og transkripsjon profiler. SATB1 fremmer tumorvekst og metastase i brystkreft og er assosiert med dårlig prognose i flere krefttyper. Sammenhengen mellom SATB1 og endetarmskreft (CRC) er ikke undersøkt intensivt. Derfor denne studien var å undersøke effekten av SATB1 på CRC vekst og metastasering in vitro og in vivo og dens sammenheng med total overlevelse og clinicopathological faktorer i CRC pasienter. Stabil SATB1 knockdown og SATB1-overekspresjon cellelinjer ble etablert. SATB1 knockdown redusert cellevekst, kolonidannelse, migrasjon og invasjon og økt apoptose i CRC celler in vitro (p 0,05), mens SATB1 overekspresjon hadde motsatt effekt. SATB1 overekspresjon økt tumorvekst og metastaser til lungene og leveren in vivo ved hjelp xenograft dyremodeller (p 0,05). Således SATB1 fremmet en aggressiv CRC fenotype in vitro og in vivo. Immunhistokjemisk analyse av 560 CRC prøvene viste at SATB1 ekspresjon var signifikant høyere i CRC vev enn i matchet ikke-tumor mucosa (p 0,001). I tillegg SATB1 uttrykk var signifikant høyere hos pasienter med dårlig differensierte svulster, høyere invasjon dybde, fjernmetastaser, og avansert TNM stadium. SATB1-positive pasienter hadde en dårligere prognose enn SATB1-negative pasienter, og SATB1 ble identifisert som en uavhengig prognostisk faktor for CRC (p = 0,009). Påfallende, evaluert vi også SATB2 uttrykk i barnekonvensjonen, og fant at SATB2 ble mer rikelig uttrykt i ikke-kreft slimhinnen i forhold til kolorektal kreft vev (p 0,001). Imidlertid SATB2 uttrykk ikke hadde noen innflytelse på prognose av CRC-pasienter (p = 0,836). SATB1 uttrykk var signifikant assosiert med kortere overlevelse tid enten i SATB2-positive pasienter eller i SATB2-negative pasienter (p 0,001). I konklusjonen, våre funn indikerte en viktig rolle for SATB1 i CRC tumorigenesis og metastasering. Derfor kan SATB1 representere en viktig prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for CRC
Citation. Zhang Y, Tian X, Ji H, Guan X, Xu W, Dong B, et al. (2014) Uttrykk for SATB1 fremmer vekst og metastasering av tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10,1371 /journal.pone.0100413
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 15 september 2013; Godkjent: 28 mai 2014; Publisert: 27 juni 2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science finansiering (No: 81272765), Capital Karakteristisk Clinical Application forskning (No: Z121107001012083), nøkkelen prosjekt Capital Medical Development Fund (No: 2009-2095), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No: 7122030) Beijings talenter tilskuddsordning (215 Program, No: 2009-2-18), spesielt prosjekt av Beijing «ti, hundre og tusen» Helse Talentsand midler fra Beijing Cancer Hospital (No: 10-04). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje største årsaken til kreft-assosiert dødsfall i USA [1] og den nest mest utbredte kreft i Kina [2]. Omtrent 15-25% av CRC pasienter opplever synkrone levermetastaser, og 80-90% av disse pasientene har unresectable metastatisk leversykdom [3]. Metastatisk leversykdom er den viktigste dødsårsaken i CRC pasienter [4]. Derfor er det et presserende behov for å identifisere sensitive og spesifikke molekylære markører for å forutsi CRC metastaser. Videre forståelse av de underliggende mekanismene for CRC metastaser er viktig i identifisering av biomarkører for metastatisk progresjon i CRC.
Spesial AT-rik sekvens-bindende protein-1 (SATB1) er en vev-spesifikk kjernefysisk protein som er hovedsakelig uttrykt i thymocytter [5] og ble opprinnelig anerkjent for sin kritiske rolle i riktig T-celle utvikling [6] – [8]. SATB1 binder spesielle AT-rike anker nettsider omsluttende heterochromatin å danne en «bur-lignende» funksjonelle kjernearkitektur som fungerer som en landingsplattform for kromatin-remodeling faktorer. Derfor kan SATB1 nettverket regulere genekspresjon ved å endre den funksjonelle organiseringen av DNA-sekvensen [9], [10]. SATB1 er nylig blitt rapportert å være et genom arrangøren. SATB1 uttrykk markert endret ekspresjon av over 1000 brystcancergener, inkludert metastase-assosierte gener og tumorsuppressorgener for å fremme vekst og metastasering av brysttumor [11]. Videre multivariat overlevelsesanalyse viste at SATB1 var et uavhengig prognostisk for brystkreft [11]. SATB1 overekspresjon har også vært assosiert med dårlig prognose i strupe plateepitelkarsinom [12], magekreft [13], [14], og ondartet hud melanom [15]. Sammenhengen mellom SATB1 og endetarmskreft (CRC) er fortsatt uklart
I denne studien har vi demonstrert involvering av SATB1 i CRC vekst og metastasering basert på følgende bevis:. (A) SATB1 overekspresjon ble påvist i både CRC cellelinjer og CRC-tumorer, (b) vekst og kolonidannelseshastigheten ble nedregulert i SATB1-knockdown-celler, men opp regulert i SATB1-overekspresjon celler, (c) migrering og invasjon evner ble mye dårligere i SATB1-knockdown celler, mens mer aggressiv i SATB1-overekspresjon-celler, (d) SATB1 overekspresjon fremmet karsinogenese og metastaser in vivo ved hjelp av dyremodeller, (e) ekspresjon av SATB1 protein var mer tallrike i CRC vev enn i sammenfallende ikke-cancervev, og (f) SATB1 ekspresjon ble funnet å være en uavhengig prognostisk faktor for CRC-pasienter.
Materialer og metoder
2,1 cellelinjer og cellekultur
SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO og LoVo CRC cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, og alle cellelinjene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin (100 ug /ml) og penicillin (100 ug /ml). Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2.
2,2 etablering av stabile SATB1-knockdown cellelinjer
Tre korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser ble utformet basert på SATB1 sekvensen (NM_002971) identifisert av shRNA Target Finder (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, California): shRNA1 (2566), 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 «; shRNA2 (2364), 5»-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 «; og shRNA3 (2797), 5»-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 «. De oligoduplexes ble klonet inn i pSilencer3.1 vektor (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, California). De resulterende konstruksjoner ble transfektert inn LoVo celler eller RKO celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler transfektert med tom vektor (pSilencer3.1) ble anvendt som kontroller. Stabile transfektanter shRNA ble selektert ved dyrking med 600 ug /ml G418 (GibcoBRL) i 3 uker. RT-PCR, western blot og immunfluorescens farging ble brukt til å bekrefte nedregulering av SATB1 uttrykk.
2,3 etablering av stabile SATB1-overekspresjon cellelinjer
Full-lengde human SATB1 cDNA ble klonet inn i pcDNA3.1 ekspresjonsvektor (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, California). SW480-celler ble transfektert med SATB1-pcDNA3.1 eller tom vektor (pcDNA3.1) som en kontroll. Transfektanter med stabil SATB1 overekspresjon ble selektert ved dyrking med 600 ug /ml G418 i 3 uker. RT-PCR, western blot, og immunofluorescens farging ble anvendt for å bekrefte opp regulering av SATB1 uttrykk.
2.4 Pasienter og Prøver
CRC tumorvev ble oppnådd fra 560 pasienter som ble diagnostisert og behandlet i Kirurgisk avdeling, Peking University School of Oncology mellom 2005 og 2008. Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Fem hundre og førtito av disse pasientene ble fulgt opp postoperativt, over en periode på minst 3 år. Og detaljert clinicopathological informasjonen ble innhentet fra 520 pasienter. Frisk kolorektal svulsten og matchet normale tykktarmsslimhinnen prøver ble innhentet fra 21 pasienter. Prøver som ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Histopatologiske analyser ble utført uavhengig av to patologer. For bruk av kliniske materialer for forskningsformål, Kina ble innhentet godkjenning fra den regionale etiske komiteer, Beijing Cancer Hospital. Skriftlig informert samtykke er innhentet fra alle deltakerne. Den kliniske undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
2,5 Utvinning av Total RNA og revers transkripsjon-Polymerase Chain Reaction
SATB1 mRNA ble bestemt ved revers transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR). Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra det ekstraherte RNA (4 ug) ved hjelp av EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix sett (Invitrogen). PCR-amplifikasjon ble utført ved anvendelse av følgende SATB1 og beta-actin-gen-spesifikke primere: SATB1, 5′-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 «(sense) og 5′-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3′ (antisense); og beta-aktin, 5»-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 «(sense) og 5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3» (antisens). Beta-aktin ble brukt til å normalisere SATB1 genuttrykk. Tjueåtte PCR-sykluser ble utført, hvor hver syklus bestod av pre-denaturering ved 94 ° C i 3 minutter, denaturering ved 94 ° C i 45 s, annealing ved 55 ° C i 45 s og forlengelse ved 72 ° C i 45 s , og etter 28 sykluser er en sluttforlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produktene ble separert ved gel elektroforese på 2% agarosegel farget med etidiumbromid. Band intensitet ble målt direkte på en Alpha Imager 2200 analysesystem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).
2,6 Western Blot analyse
Celler og friske vev ble lysert i 1 × natrium dodecylsulfat (SDS) lyseringsbuffer. Like mengder av totalt protein ble separert ved SDS-PAGE, elektrooverført til polyvinylidendifluorid-membraner (Pall Corporation, Mexico City, Mexico), og inkubert over natten ved 4 ° C med en SATB1 kanin polyklonalt antistoff (1:500 fortynning, PRS4631; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Beta-aktin (1:10000, Sigma-Aldrich) ble anvendt som en kontroll lasting. Proteinbånd ble evaluert av forsterket kjemiluminescens (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).
2,7 immunfluorescens Farging og Laser-scanning konfokalmikroskopi
Cellene ble dyrket på dekkglass, festet med fire % paraformaldehyd, permeabilisert ved anvendelse av 0,1% Triton X-100, vasket og blokkert med 5% bovint serumalbumin. Cellene ble inkubert med primært antistoff SATB1 (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich), etterfulgt av inkubasjon med et rhodamin-konjugert sekundært antistoff (1:50; Zhongshan Golden Bridge Biotechnology, Beijing, Kina). Dekk ble montert med Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inneholder diamidino-to-phenylindole (DAPI) atom flekken og undersøkt under et fluorescens mikroskop, da bildene ble bygget ved hjelp av en programvare (LAS AF 2.2.1 versjon , TCSSP5, Leica, Tyskland).
2,8 cellevekst
Cellevekst vekst~~POS=HEADCOMP ble evaluert av 3- (4,5-methylthiozol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. Celler (3 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater og dyrket i 24, 48, 72 og 96 timer. MTT (10 ul) ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble dyrket i ytterligere 4 timer. Dyrkningsmediet ble fjernet, og 200 ul DMSO (AMRESCO Inc., Solon, OH, USA) ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ved 570 nm ble målt med en mikroplateleser (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Cell vekstkurver ble konstruert ved å plotte absorbans (borte ved DMSO) mot tiden.
2,9 apoptose og flowcytometri analyse
Stall SATB1-overekspresjon, SATB1-knockdown, og tomme vektorkontrollceller (en x 10
6-celler) ble dyrket i 60-mm skåler i 48 timer og høstet. Cellene ble merket med propidiumjodid og AnnexinV. Negative kontroller besto av umerkede celler og egnede isotype kontroller. Minst 10.000 hendelser for hver prøve ble samlet og analysert ved hjelp av en strømningscytometer. (FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)
2,10 Cell Cycle Analysis ved flowcytometri
Stall SATB1-overekspresjon, SATB1-knockdown, og tomme vektorkontrollceller ble dyrket i 60 mm-retter og serum sultet i 24 timer. Celler ble deretter dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS i 48 timer. Levedyktige celler ble høstet, fiksert i 70% etanol og analysert ved flowcytometri.
2,11 Soft Agar Colony Forming
Stall SATB1-overekspresjon, SATB1-knockdown, og tomme vektorkontrollceller (3 × 10
3) ble resuspendert i DMEM inneholdende 3 ml 0,4% agarose, 20% FBS, 0,5 mM natriumpyruvat, 10 m MHEPES, og 1% penicillin /streptomycin og lagvis på toppen av 4 ml 0,8% agarose i DMEM videre 60 mm-retter. Etter 3 uker ble kolonier telles og fotografert.
2.12 sårtilheling analysen
Stabile SATB1-overekspresjon, SATB1-knockdown, og tomme vektorkontrollceller ble dyrket i 60 mm-retter til cellen tetthet nådd 90% samløpet. En horisontal såret ble opprettet ved hjelp av en steril 10-mL mikrotip. Cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne celleavfall. Tre forskjellige områder i hver tallerken ble valgt å sammenligne avstanden migrere celler fra såret opprinnelse. Bilder ble tatt til fange ved 0 og 24 timer for å vurdere lukking av sår.
2,13 Transwell migrasjon og invasjon Analyser
Stall SATB1-overekspresjon, SATB1-knockdown, og tomme vektorkontrollceller (1 × 10
5) ble suspendert i 200 ul serumfritt medium og sådd ut i det øvre kammer av et transwell innsats med en 8-um porestørrelse membran (Corning Costar Corp., Cambridge, MA, USA). DMEM inneholdende 10% FBS ble plassert i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering i 24 timer ble det ikke-migrerte celler på den øvre kammer i transwell innsatsen fjernes med en bomullsdott, og de migrerte cellene på undersiden av filtermembranen ble fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett. Antallet migrerte celler ble tellet i 5 tilfeldig valgte mikroskopiske felt og fotografert. Den protokollen som brukes for invasjonen analysen var den samme som den som anvendes for overføringsmetoden, bortsett fra at transwell innskuddet ble belagt med Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland).
2,14 In Vivo Carcinogenesis
Stabile SATB1-overekspresjon og tomme vektorkontrollceller (2 × 10
6) i 100 mL Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS; GibcoBRL, Life Technologies) ble injisert i fem kvinnelige fire uker gamle BALB /c athymiske mus . SATB1-overekspresjon og tom vektorkontrollceller ble injisert subkutant inn i venstre og høyre dorsale flanke av hver mus, respektivt. Tumorvolumene ble målt to ganger ukentlig, og musene ble avlivet etter 4 uker. Svulster ble skåret ut, målt og veid. Svulster ble fiksert i 10% formalin for histopatologisk analyse eller lagret ved -80 ° C for RT-PCR og western blot. Alle dyreforsøk ble gjort i samsvar med relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Peking University School of Oncology (Permit Number: 2012-07). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
2,15 Xenotransplantat dyremodell av lunge og levermetastaser
Vi bestemte effekten av SATB1 uttrykk på CRC metastaser i xenograft musemodeller av lunge og levermetastaser. I leveren metastase modell, enkeltcellesuspensjoner av stabile SATB1-overekspresjon og tom vektorkontrollceller (2 x 10
6) i 100 pl HBSS ble langsomt injisert i milten hos BALB /c atymiske mus under anestesi. I den metastasemodellen lunge, enkeltcellesuspensjoner av SATB1-overekspresjon og tom vektorkontrollceller (2 x 10
6) i 100 pl HBSS ble injisert inn i den laterale halevenen. Fem mus ble inkludert i hver behandlingsgruppe. Mus ble avlivet 8 uker etter injeksjon, og miltene, lever og lunger ble skåret ut kirurgisk. Antallet og størrelsen av metastaser i lever og lunge ble dokumentert. Prøvene ble fiksert i 10% formalin eller lagret ved -80 ° C for senere analyse.
2,16 Immunhistokjemisk analyse av microarray
Formalin fiksert, parafin-embedded tykktarms tumor og ved normal kolorektal slimhinne prøvene ble bygget inn microarray (TMA). TMA blokkseksjoner (4 mikrometer) ble deparaffinized og rehydrert i gradert alkohol. Antigen gjenfinning ble utført i en mikrobølgeovn ved EDTA-buffer. Celler ble inkubert i 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet, og deretter i 5% ikke-fettholdig melk for å forhindre ikke-spesifikk binding. TMA blokkseksjoner ble inkubert over natten ved 4 ° C med en spesifikk SATB1 kanin monoklonalt antistoff (1:50, ab92307; Abcam, Cambridge, CA, USA) eller en kanin monoklonalt antistoff mot SATB2 (1:200, TA307098; OriGene Technologies, Inc .). For negative kontroller ble det primære antistoff erstattet med PBS. Alle delene ble undersøkt mikroskopisk og scoret av to uavhengige patologer som ble blindet for den kliniske opplysninger av fagene. I motsetning til vanlige seksjoner, SATB1 eller SATB2 immunhistokjemisk farging på vevet microarray chips var nesten 100% kjernekraft-farget eller ikke-farget for tumorvev eller normal kolorektal slimhinne, så når man vurderer sin farging, vi tok bare hensyn til fargeintensitet av positivt farget kjerne. Nuclear intensitet ble betegnet som negativ, svakt positiv, moderat positiv eller sterkt positiv. Og når du utfører statistisk analyse, kombinert vi pasientene til svakt positiv, moderat positiv og sterkt positiv farging som en positiv farging gruppe.
2,17 Statistical Analysis
SPSS 16,0 programvare (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) ble brukt til å utføre de statistiske analysene. Alle in vitro eksperimenter ble utført in triplo og gjentatt 3 ganger. Uparet 2-tailed
t
tester ble brukt for gruppesammenligninger etter å ha kontrollert normalitet og homogenitet av varians. Data i tall og tekst er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. To-tailed chi-squared test (χ
2) eller Fishers eksakte test ble brukt til å evaluere forholdet mellom SATB1 uttrykk og clinicopathological faktorer eller SATB2 uttrykk. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse ble anvendt for å vurdere pasientens prognose, og p-verdier ble beregnet ved log rank test. Multivariat analyse av Cox regresjonsmodell ble brukt for å bestemme effekten av SATB1 uttrykk og clinicopathological faktorer på pasientens overlevelse. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
3,1 Expression of SATB1 i CRC cellelinjer
mRNA og protein uttrykk for SATB1 i seks human CRC celle. linjer, er SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, og LoVo vist på fig. 1A. SATB1 mRNA og protein uttrykk ble ikke påvist i SW480, SW620, HT-29, og HCT116-celler. SATB1 mRNA ble påvist i de høyt metastatiske RKO og LoVo cellelinjer. I tillegg ble SATB1 protein sterkt uttrykt i RKO og LoVo-celler. Så LoVo og RKO cellelinjer ble valgt for en serie av SATB1 knockdown-eksperimenter og SW480 cellelinjer for de SATB1 overekspresjon forsøkene.
(A) SATB1 mRNA og protein ble bestemt uttrykk i (A) 6 CRC-cellelinjer , SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, og LoVo; (B) representative tykktarmssvulster og matchet normal slimhinne; (C) moderat og dårlig differensierte svulster og normal slimhinne; og (D) representative tykktarmssvulster og matchet synkrone levermetastaser foci svulster. SATB1 mRNA og protein ekspresjon ble bestemt ved RT-PCR og western blot, henholdsvis, og normalisert til p-aktin. T, tykktarmssvulster; N, matchet normal slimhinne; M, synkrone levermetastaser foci svulster.
3,2 Expression of SATB1 i Primær CRC og levermetastaser Foci
Uttrykket nivået av SATB1 mRNA og protein ble bestemt i primær CRC svulsten og matchet ikke-tumorslimhinnen prøver. Blant de 21 passet tilfellene ble SATB1 mRNA og protein påvist i 17 tumorprøver, men ikke i noen av de ikke-tumorslimhinne prøver (fig. 1B). Videre SATB1 mRNA og protein uttrykk var høyere i dårlig differensierte tumorprøver enn i moderat differensierte tumorprøver (Fig. 1C). SATB1 mRNA og protein uttrykk i primær CRC var lik som i matchet synkrone levermetastaser foci (Fig. 1 D).
3,3 Undertrykkelse av SATB1 Expression Reduserer Cell Proliferation, Colony Forming, migrasjon og invasjon i Vitro
for å vurdere rollen til SATB1 i CRC progresjon ble tre stabile SATB1-knockdown LoVo cellelinjer etablert ved hjelp shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 cellelinjer var effektive i downregulating SATB1 mRNA og protein uttrykk (Fig. 2A). Protein uttrykk for SATB1 var knapt synlig i SATB1-shRNA1 og SATB1-shRNA2 celler. SATB1 mRNA-ekspresjon ble redusert med nesten 90% i SATB1-shRNA1 celler, og med 70% og 60% i SATB1-shRNA2 og SATB1-shRNA3-celler, henholdsvis (fig. 2A). Veksttakten av alle SATB1-shRNA cellelinjer var tregere enn for de tomme vektorkontrollcellene (p 0,05, figur 2B.). Som vist på fig. 2C, SATB1-shRNA1-celler hadde en signifikant høyere prosentandel av apoptotiske celler enn kontrollcellene (45,1% versus 20,3%, p 0,01). Men andelen av apoptotiske celler var ikke signifikant forskjellig mellom SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3, og kontrollceller (data ikke vist). SATB1 knockdown indusert G1-fase cellesyklus-stans: prosentandelen av celler i G0 /G1 fase var høyere i SATB1-shRNA1 (46,4%) og SATB1-shRNA2 celler (45,6%) enn i kontrollcellene (36,8%) (p 0,01, fig. 2D). I motsetning til dette, prosentandelen av celler i G2 /M og S fasene var signifikant lavere i shRNA1 og shRNA2 cellene enn i kontrollcellene (p 0,01, Fig. 2D). Cellesyklus endringer ble ikke observert i SATB1-shRNA3 celler (data ikke vist). Disse funnene indikerer at SATB1 kan spille en viktig rolle i å fremme vekst og overlevelse av CRC celler.
(A) Tre stabile SATB1-knockdown LoVo cellelinjer ble etablert ved hjelp shRNA. -Celler transfektert med tom vektor tjente som kontroller. Effekten av SATB1 knockdown ble verifisert ved RT-PCR (øverst til venstre panel), western blot (nederst til venstre panel), og immunfluorescens (høyre panel). β-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning. (B) Cell spredning av tom vektor kontroll, ble SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemt ved MTT-analyse. (C) apoptose av SATB1-shRNA1 og tomme vektorkontrollceller ble bestemt ved flowcytometri analyse av PI og Annexin V farging. (D) Flowcytometri analyse av cellesyklus i tom vektor kontroll, SATB1-shRNA1, og SATB1-shRNA2 celler. (E) Soft agar-kolonidannelse tom vektor kontroll, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler etter 3 uker. * P 0,001. (F) Migrering av tom vektor kontroll, ble SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemmes ved sårheling analysen (venstre panel) og transwell migrasjon analysen (panel øverst til høyre). Antallet migrerte celler i transwellmigrasjonsanalysen ble kvantifisert ved telling av cellene på undersiden av filtermembranen i 5 tilfeldig valgte mikroskopiske felt (høyre panel lavere). * P 0,001, antall migrerte celler sammenlignet med kontrollen. (G) Cell invasjonen av tom vektor kontroll, ble SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, og SATB1-shRNA3 celler bestemmes av Matrigel transwell invasjon analysen. Antallet invaderte celler ble kvantifisert ved å telle cellene på undersiden av filtermembranen i 5 tilfeldig valgte mikroskopiske felt. * P 0,001, antall invaderte celler sammenlignet med kontrollgruppen
knockdown av SATB1 uttrykk redusert kolonidannelse hastighet og kolonistørrelse (figur 2E.).. I kontrollcellene, kan nesten 100 til 120 kolonier holdes i tilfeldig valgte mikroskopiske felt. I motsetning til dette kolonidannelse var mye færre i de tre SATB1-shRNA-celler (shRNA1: 28,75 ± 8,5; shRNA2: 34,5 ± 7,8; shRNA3: 40,5 ± 4,5). Knockdown av SATB1 også redusert cellemotilitet som gjenspeiles av den større såret nedleggelser i de 3 SATB1-shRNA cellelinjer i forhold til de i (Fig. 2F) kontrollcellene. Den invasive evne var betydelig lavere i SATB1-shRNA1, shRNA2, og shRNA3 celler enn i kontrollcellene (p 0,001 Fig. 2G). Disse resultatene var i samsvar med de av transwellmigrasjonsanalyse (fig. 2F).
Videre testet vi vekstraten og migrasjon /invasjon evne i RKO cellelinjer. SATB1-knockdown av RKO cellelinjer ble etablert ved hjelp shRNA1 (oppkalt SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer). Begge de mRNA og proteinnivåene av SATB1 ble effektivt nedregulert ved shRNA1 (Fig. 3A). I samsvar med SATB1 knockdown eksperimenter i LoVo cellelinjer, vekstraten til SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer var tregere enn for de tomme vektorkontrollcellene (p. 0,05, figur 3B), og SATB1-shRNA1 RKO cellelinjer viste også G1-fase cellesyklus-stans (fig. 3C). Migrasjon analysen gitt bevis for at knockdown av SATB1 genet kan redusere cellemotilitet (p. 0,001 Fig 3D). Og i RKO cellelinjer, ble det invasive evne reduseres vesentlig ved å nedregulere ekspresjon SATB1, som vist i fig. 3E (p 0,001).
(A) SATB1-knockdown RKO cellelinjer ble etablert ved hjelp shRNA1. -Celler transfektert med tom vektor tjente som kontroller. Effekten av SATB1 knockdown ble verifisert ved hjelp av RT-PCR og western blot. β-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning. (B) Cell spredning av tom vektor kontroll, og SATB1-shRNA1 RKO celler ble bestemt ved MTT-analyse. (C) Flowcytometri analyse av cellesyklus i tom vektor kontroll, SATB1-shRNA1 RKO celler. (D) Migrering av tom vektor kontroll, ble SATB1-shRNA1 RKO celler bestemmes av transwell migrasjon analysen. * P 0,001, antall migrerte celler sammenlignet med kontrollen. (E) Cell invasjonen av tom vektor kontroll, SATB1-shRNA1 RKO celler ble bestemt ved Matrigel Transwell invasjon analysen. * P 0,001, antall invaderte celler sammenlignet med kontrollgruppen
3,4 Overuttrykte SATB1 Fremmer Cell Proliferation, Colony Forming, migrasjon og invasjon i Vitro
For å ytterligere bekrefte rollen. av SATB1 i CRC progresjon, ble en SATB1-overekspresjon cellelinje etablert ved hjelp av dårlig metastatiske SW480 celler. SATB1 overekspresjon ble bekreftet ved western blot, RT-PCR, og immunofluorescens-farging (fig. 4A). Veksttakten var høyere i SATB1-overekspresjon celler enn i de tomme vektorkontrollcellene (p 0,05, Fig. 4B). Prosentandelen av apoptotiske celler var lavere i de SATB1-overekspresjon celler enn i kontrollcellene (28,7% versus 36,1%, p 0,01, Fig. 4C). Overekspresjon av SATB1 fremmes cellesyklusprogresjon fra G0 /G1 fase til G2 /M og S-faser (56,3% G0 /G1 fase i SATB1-overuttrykkende cellelinjer versus 63,6% G0 /G1 fase i kontrollceller) (fig. 4D). Kolonidannelse hastighet og kolonistørrelse var høyere i de SATB1-overekspresjon celler (67,5 ± 9,5) enn i kontrollcellene (24.75 ± 2.75) (fig. 4E). SATB1 overekspresjon økt cellemigrasjon som dokumentert av komplett lukking av sår og mer migrerte celler i SATB1-overekspresjon celler (Fig. 4F). I tillegg invasjon evne var høyere i SATB1-overekspresjon celler (109 ± 8,7) enn i kontrollcellene (12,75 ± 4,5) (fig. 4G).
(A) SW480-celler ble transfektert med pcDNA3 0,1-SATB1 ekspresjonsvektor eller tom vektor. Oppregulering av SATB1 mRNA og protein uttrykk ble verifisert ved RT-PCR (øverst til venstre panel), western blot (nederst til venstre panel), og immunfluorescens (høyre panel). β-aktin ble benyttet for å sikre lik belastning. (B) celle proliferasjon av tom vektorkontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler ble bestemt ved MTT-assay. (C) Apoptose av tom vektorkontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler ble bestemt ved flow-cytometri analyse av PI og Annexin V-farging. (D) Strømningscytometri-analyse av cellesyklus i tom vektorkontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler. (E) Soft agar-kolonidannelse av tomme vektor kontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler etter 3 uker. (F) Migrasjon av tom vektor kontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler ble bestemt ved sårheling analysen (venstre panel) og transwell migrasjonsanalyse (høyre panel). * P 0,001, antall migrerte celler sammenlignet med kontroller. (G) Cell invasjonen av tom vektor kontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler ble bestemt av Matrigel Transwell invasjon analysen (* p 0,001).
3,5 SATB1 fremmer vekst og metastasering av CRC celler i vivo
Deretter evaluerte vi virkningen av SATB1 overekspresjon på CRC carcinogenesis in vivo, mRNA og protein ekspresjon av SATB1 var høyere i tumorer fra de SATB1-overekspresjon celler enn i tumorer fra de tomme vektor-celler (fig. 5A). Svulster fra SATB1-overekspresjon cellene hadde en raskere vekst enn svulster fra kontrollcellene, noe som var i samsvar med in vitro vekstrater (p . 0.01, figur 5A, topp panel). Tumorvekter fra SATB1-overekspresjon celler var omtrent 5-6 ganger tyngre enn de fra de tomme vektor-celler, noe som indikerer at SATB1 kunne fremme veksten av kolorektale tumorer in vivo (Fig. 5A, nedre panel).
(A) mRNA og protein uttrykk for SATB1 inxenograft svulster fra tom vektor kontroll og pcDNA3.1-SATB1 celler ble bestemt ved RT-PCR og Western blot, henholdsvis (øverst til venstre panel). Deretter ble tumorvekst bestemt i en in vivo-xenograft modell. Stabile SATB1-overekspresjon og tom vektorkontrollceller (2 x 10
6) ble injisert subkutant inn i venstre og høyre dorsale flanke, henholdsvis i 5 BALB /c atymiske mus. Tumorstørrelsene ble målt to ganger ukentlig, og musene ble avlivet etter 4 uker.
