Abstract
I kroppen vår, blir cellene kontinuerlig utsatt for fysiske krefter som kan regulere ulike cellefunksjoner som celledeling, differensiering og død . I dette arbeidet brukte vi to ulike strategier for mekanisk belastning kreftceller. Kreften og sunne cellepopulasjoner ble behandlet enten med mekanisk stress levert av en mikropumpe (fabrikkert av dyp X-ray nanolithography) eller ved ultralyd bølge stimuli. En spesifikk nedregulering av Major Histocompatibility Complex (MHC) klasse I molekyler ekspresjon på kreftcellemembran i forhold til forskjellige typer sunne celler (fibroblaster, makrofager, dendrittiske og lymfocytt-celler) ble observert, stimulere cellene med krefter i størrelsesorden nano -newton, og trykk på mellom 1 og 10 bar (1 bar = 100,000 Pascal), avhengig av enhetene som brukes. Dessuten, Raman-spektroskopi-analyse, etter mekanisk behandling, i området mellom 700-1800 cm
-1, indikerte en relativ konsentrasjon variant av MHC-klasse I. PCA-analyse ble også utført for å skille kontroll og stresset celler i forskjellige cellelinjer. Disse mekaniske indusert fenotypiske endringer øke svulsten immunogenisitet, som avslørt av den tilhørende økt mottakelighet for Natural Killer (NK) celler cytotoksiske anerkjennelse
Citation:. La Rocca R, Tallerico R, Talib Hassan A, Das G, Tadepally L, M Matteucci, et al. (2014) Mekanisk Stress nedregulerer MHC klasse I Expression on Human Cancer cellemembranen. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10,1371 /journal.pone.0111758
Redaktør: Laurent Kreplak, Dalhousie University, Canada
mottatt: 17 april 2014; Godkjent: 30 september 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 La Rocca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Ennio Carbone arbeid har blitt støttet av en UICC International Cancer Technology Transfer Fellowship, gi AIRC-IG 10189, og gi AIRC 15521. Rossana Tallerico er en Post Doc tildelt av treårige stipend «Luciana Selce» FIRC. Giovanni Cuda har blitt støttet av PON01_02834 Prometeo (Kunnskapsdepartementet) og PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (Kunnskapsdepartementet). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i naturen blir cellene kontinuerlig utsatt for fysiske, kjemiske og biologiske påkjenninger. I det siste, var fysiske endringer som forekommer i patologisk vev tatt hensyn til av leger som verdifulle diagnostiske indikatorer. Fysiske belastninger er involvert i patofysiologien til en rekke menneskelige sykdommer, så som inflammasjon og kreft. I begge betingelser, blir en endring i den kjemisk-fysiske ekstracellulære matriks (ECM) miljø forbundet med patogenesen av disse sykdommene. Videre fysiske krefter spille en betydelig rolle i metastatisk progresjon. I de senere år, nye verktøy, slik som atomkraftmikroskopi, er blitt utviklet for å analysere endringer i cellene elastisitet er relatert til fysiske endringer i den ekstracellulære matriks rommet [1]. Videre, for å finne ut hvor mye en celle kan bli deformert, en anordning som kalles «optisk båre» ble utviklet [2]. I motsetning til andre verktøy, er den optiske båre basert på en dobbel-stråle optisk felle [3], [4], hvor to motstander og identiske laserstråler felle en celle i midten. Denne fremgangsmåten kan brukes til å måle de elastiske og kontraktile egenskaper av mange celler, som det er kjent at cellens evne til å trekke seg sammen er meget viktig for migrering og proliferasjon [5]. Videre kan elastisitet og kontraktilitet av forskjellige tumorceller endre seg med progresjon av sykdommen, sammen med en økt elastisitet av kreft sammenlignet med friske celler [6]. Et forhold mellom ECM stivhet og tumor-transformasjon er blitt beskrevet [7]. Det er blitt vist at ECM-mediert isometriske krefter avføles av integriner som regulerer fosforylering av mekanisk-transduser-kinaser, slik som ERK og Rho [8]. Det er også blitt vist at økningen av eksogene krefter føre til en økt celleformering hastighet og indusere tumor-liknende fenotypiske forandringer. Til slutt blir inflammatorisk brystkreft kjent for å utøve en mekanisk belastning på grunn av ECM endringene, kan føre til en høyere metastatisk potensiale [9].
På denne bakgrunn hypotese vi at mekaniske påkjenninger kan enten påvirke ekspresjon av celle antigener eller indusere uttrykk for stress-induserbar molekyler som NKG2D reseptorligander [10] i stand til å prime cytotoksiske effektor-lymfocytter celle funksjoner.
i de siste årene oppdagelsen av immunoreceptors erkjenner stress-induserbare proteiner har utvidet vår kunnskap på hvordan immunsystemet er fylt [11], [12]. Disse observasjonene har fostret vår interesse i kontrollert spenning avgivelsesanordninger som kunne fremkalle en svulst immunogent fenotype i stand til å fremkalle en immunrespons, spesielt når svulsten har allerede blitt redigert av cytotoksiske lymfocytter [13].
naturlige killer-celler er potente cytotoksiske lymfocytter i stand til å gjenkjenne ferskt eksplanterte kreftceller [14] – [16] og til spontant å lyse bestemte tumor målene [17] – [19]. De er regulert av en hårfin balanse mellom hemmende reseptorer, erkjenner selv MHC klasse I molekyler, og aktiverer reseptorer for stress-induserbar molekyler [20]. NK-celler har evnen til å identifisere og drepe virusinfiserte og ondartede celler skåner normale celler. NK-celler regulering ble dårlig forstått før på slutten av 1980-tallet da «the missing self» hypotesen ble foreslått [21]. Ifølge denne hypotesen, nedregulering av MHC klasse I molekyler under virusinfeksjon eller ondartet transformasjon utløser NK aktivering.
Her spør vi om behandlingen av NK resistente kreftceller ved mekanisk stress kan tippe balansen mellom hemmende og aktivering av tumor uttrykker molekyler i favør av den sistnevnte, som fører til NK-celleaktivering. I dette arbeidet har vi brukt to forskjellige prosedyrer for å mekanisk belastning kreft og normale celler under kontrollerte forhold. Vi sammenlignet de biologiske virkninger av mekaniske stimuli som leveres enten av en mikropumpe-enhet konstruert spesielt for dette formålet [22], til de som er levert av en sjokkbølger puls utstyr. Variasjonen i MHC klasse I-molekyler før og etter mekanisk påkjenning ble målt både ved hjelp av Raman-spektroskopi (i kombinasjon med hovedkomponentanalyse (PCA)) og ved hjelp av cytotoksiske målinger. Det endelige målet med vår studie var å forstå hvis de anvendte mekaniske krefter kunne utløse og /eller modulere relevante biologiske cellefunksjoner, for eksempel deres immunogenisitet. Videre utforsket vi muligheten til å bruke adoptiv mekaniske manipulasjoner toswitch en svulst NK celle resistent fenotype i en utsatt ett.
Materialer og metoder
Micro enhet
For å levere mekaniske påkjenninger for tumorcellepopulasjoner, anvendte vi en tidligere beskrevet mikropumpe [22] (S1A fig.) fremstilt ved hjelp ofdeep røntgenstråle-litografi (DXRL) teknikk for spesifikt å behandle eukaryote celler uten å ødelegge dem. Tre millioner celler /ml ble mekanisk understreket i 1 time ved 48 sykluser og styrken av det maksimale trykk som utøves var om lag 10 bar. Dette ble vurdert ved å måle pumpe utbredelse ved hjelp av vann som en væske. Etterpå cellene ble samlet i en 15 ml rør og ble analysert ved flowcytometri og mikro Raman-spektroskopi.
sjokkbølger enhet
Sjokkbølger brukes i ortopedi og er i hovedsak akustiske bølger med en mekanisk effekt. Når sjokkbølger passere gjennom en væske, skape trykkforskjeller som er ansvarlige for dannelsen av gassbobler (kavitasjon) som påvirkes av etterfølgende sjokkbølger og er deformert inntil implosjon. Asymmetrisk kollaps av boblen fører til dannelse av en vannstråle «jet stream». Dette fenomenet ytterligere forbedrer den mekaniske effekt av sjokkbølgen som forårsaker mikro lesjoner hvis størrelse er en funksjon av antallet pulser og forandring av energi. For behandling av kreftcellelinjer ble brukt
Swiss Dolorclast enhet plakater (Electro Medical System-EMS, Italia) med en hånd-brikke med høy energi (S1B fig.).
Kreftceller ble dyrket i Petri-skåler og behandlet med sjokkbølger (500 skudd) påføring av en fluks av energi av en bar. Etter behandling ble cellene samlet opp og analysert, og de oppnådde data ble sammenlignet med de respektive kontroller.
Celler isolasjon og kulturen
For mekanisk belastning eksperimenter vi benyttet ulike typer cellelinjer. Primære celler Mel 59c, Mel 42a, Mel 42b Mel 66b, Mel 137A og Mel 103b ble hentet fra ferske Eksplanterte melanom hud metastatiske celler med få in vitro passasjer, henholdsvis fra pasienter 59, 42, 66, 137 og 103. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen og etikkomiteen II i Heidelberg University (0198,3 /2002). Friske donorer PBL og tilhørende rensede NK-celler ble generert følgelig med etikkomiteen ved University Magna Graecia av Catanzaro (49/2003). Studien ble godkjent av UMG Ethics Committee (49/2003). Human nyre carcinoma cellelinje (293T), human B lymfoblastoid cellelinje (IM9), og fibroblast-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Perifert blod lymfocytter (PBL) ble oppnådd fra friske donorer ved Ficoll-Paque (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) densitetsgradientsentrifugering de humane prøver ble samlet inn tilsvarende med etikkomiteen ved University Magna Graecia av Catanzaro (49/2003). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium og i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma Aldrich, St. Louis) og penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 mg /mL ) (Sigma Aldrich, St. Louis) og ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Makrofager og dendrittiske celler (DC) ble oppnådd fra blod mononukleære celler. Makrofager ble samlet inn monocytter tilhenger på tallerkenen. Dendrittiske celler (DC) ble etablert fra monocytter supplert i 7 dager med 50 ng /ml granulocytt /makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) og 1000 U /ml IL-4 [23] .
Natural Killer cell rensing
NK-celler ble oppnådd som beskrevet [24]. I korte trekk ble humane NK-lymfocytter ble renset fra perifere mononukleære blodceller (PBMC), oppnådd fra friske donorer ved hjelp av Ficoll-Paque densitetsgradient-sentrifugering, ved hjelp av NK-celleisolasjon kit og Vario MACS for uttømming av ikke-NK-celler (Miltenyi Biotec). Celler ble resuspendert i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 3% humant serum, penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 ug /ml) og ble anvendt for cytotoksisitet analysen. NK celle renhet var minst 95%.
Raman spek
Mikrosonde Raman spektra ble opphisset av nær IR laser med 830 nm laser linje ved romtemperatur (RT) i backscattering geometri gjennom en 100X objektiv (
NA
= 0,95) av Leica mikroskop (Model – DMLM). Alle data ble samlet inn med en laser makt 70-130 mW. Lasereffekt ble alltid velges på en slik måte for å unngå skade på cellen. Denne lasereffekt forventes ikke å medføre noen vesentlig økning i prøvetemperaturen på grunn av den ekstremt lave absorpsjonskoeffisient av cellene ved 830 nm. I tillegg ble cellebetingelsene verifisert ved optisk bilde før og etter målingene. Flere celler av hver cellelinje ble probet i området 700-1800 cm
-1 ved punktkartleggingsmålinger, som samler forskjellige spektre på annet sted som dekker hele celleoverflaten. For hver cellelinje 5-celler ble tilfeldig valgt for punkt kartlegging. Raman-spektrene av forskjellige celler av hver cellelinjer ble så oppsamlet og brukt for statistisk analyse (Spectra ikke viser signifikant forskjellig fra hverandre, [25], [26]). Den statistiske analysen (med standardavvik feil) ble utført i 10 Raman-spektrene for hver cellelinje. Det er bemerkelsesverdig å påpeke det seg at målingene for kontroll og stressede celler av hver cellelinje ble utført på samme dag for å unngå enhver variasjon i instrumentrespons. Spectral glatting ble utført for alle individuelle Raman spektra ved hjelp av wire 2,0 PS9 programvaren som følger med Renishaw Raman spektrometer. Den kurvetilpasning av spektra ble utført ved anvendelse av kombinerte gaussisk og Lorentzian funksjon.
Principal Component Analysis
I det siste tiåret multivariate teknikker har vært meget anvendt for analyse av store Raman datasett [27] , [28]. Blant disse teknikkene, er hovedkomponentanalyse (PCA) vist seg å være en av de mest robuste og pålitelige metoder [29], [30]. Når PCA brukes til Raman spektra, er hver Raman frekvensen anses som en variabel med verdi endringer over innspilt spektra, slik at hele datasettet utgjør en
N
dimensjonal plass der
N
er antallet av målte frekvenser (
N
er vanligvis meget store). Hovedformålet med PCA er dimensionality-reduksjon uten tap av informasjon. Dette oppnås gjennom den diagonalisering av kovariansmatrisen av spektra: egenvektorene definere en-dimensjonale (1D) aksene i
N
-plass og de tilsvarende egenverdier uttrykker mengden av totale varians forklart ved hver egenvektoren. Egenvektorene er de såkalte hovedkomponenter (PC), mens egenverdiene er oppkalt latents. Den første hovedkomponent er 1D akse langs hvilken den største mengden av varians er tatt hensyn til (det vil si aksen med størst latent verdi); den andre hovedkomponent er aksen (vinkelrett på den første), som utgjør den største gjenværende varians (det vil si aksen med den nest største latent), og så videre for de følgende komponenter. På denne måte fra et
N
-variables datasettet er vi redusert til et par-variable datasettet, uten å miste vesentlig del av informasjon. PCA analyse ble utført ved hjelp av programvare utviklet av P. Candeloro et al. [31].
Immunofluorescens-analyse
Etter hver behandling ble cellene oppsamlet i rør og ble inkubert med humant serum i 15 minutter ved RT. Deretter ble cellene vasket tre ganger i PBS 1X og deretter inkubert i 30 minutter i mørket ved 4 ° C, med følgende mAb’er: W6 /32 (anti-MHC klasse I, IgG2a, BioLegend, San Diego, CA); klone BAM 195 (anti-MICA, IgG1) og mAb 6D4 (anti-MICA /B, IgG1) ble vennlig levert av Veronika Groh (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA); M295 (anti-ULBP1, IgG1), M310 (anti-ULBP2, IgG1), M550 (anti-ULBP3, IgG3) og M478 (anti-ULBP4, IgG1) var velvillig Gitt av D. Cosman, (Amgen Inc. Seattle, WA ); mAb L95 (anti-PVR, IgG1) og mAb L14 (anti-Nectin-2, IgG2a) vennlig levert av A. Moretta (Universitetet i Genova, Genova, Italia). Etter vasking to ganger, ble cellene farget med de sekundære mAbs FITC geit anti-mus IgG (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) i 30 minutter ved 4 ° C i mørket. Deretter ble cellene igjen vasket to ganger og analysert ved hjelp av strømningscytometri FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). For intracellulær farging ble cellene fiksert i Cytofix og permeabilisert ved Cytoperm (BD Biosciences). Cellene ble farget med de spesifikke mAbs etterfulgt av FITC-konjugert anti-muse IgG antistoff (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) og ble analysert. Resultatene ble analysert ved hjelp av Cell quest (BD Biosciences) eller FlowJo programvareversjon 9.3.1.
Cvtotoksisitetsmålinq
For cytotoksisitetsassayer den svulst eller friske celler som mål og NK-lymfocytter som effektor celler ble anvendt. Etter mekanisk stress behandlingen ble målceller inkubert med det fluorescerende cfda (karboksyfluorescein-diacetat, Life Technologies, NY, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, deretter vasket to ganger og inkubert med NK-celler i tre timer i inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Detaljene i protokollen ble beskrevet fra McGinnes et al [32]. Strømningscytometeret ble brukt til å analysere prøvene.
Real Time
Totalt cellulære RNA fra fire forskjellige melanoma primære celler og to friske celler ble isolert ved hjelp Trizol (Life Technologies).
Kort, 1 mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Superscript III Reverse Avskrift Kit (Life Technologies) i henhold til produsentens anbefalinger; cDNA ble amplifisert ved iTaq Universal SYBER Grønn Supermix (BioRad, Segrate (MI), Italia) i nærvær av spesifikke primere som tidligere beskrevet [33]. De følgende primere ble anvendt: MHC-I- FW, 5′- CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3; MHC-I- RV, 5’CAGAGATGGAGACACCTCAGC -3 «. Ekspresjonen av husholdningsgenet glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt for å normalisere prøvene, og den relative kvantifisering av HLA klasse I ble utført for å påføre to
-ΔΔCt metoden [34]. De følgende primere ble anvendt: GAPDH-FV, 5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 «, GAPDH-RV 5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3»
Western Blotting
utskillelsen av MHC klasse I-molekyler. inn i det kondisjonerte medium ble bekreftet ved Western blot-analyse. For Western blotting, ble celler dyrket i 100 cm skåler ble vasket med 0,1 M fosfat-bufret saltløsning (pH 7,4) (Life Technologies), og deretter ble 2 ml av serumfritt RPMI tilsatt. Etter spenning behandling, ble mediet høstet. Cellene medium proteiner konsentrasjonen for hver stressede prøve ble målt in triplo ved bruk av fargestoff-bindingsprotein (Bio-Rad) med humant serumalbumin (Life Technologies) som standardkurve.
For hvert forsøk, 50 ug celle -Kultur mellom proteiner ble overført til sterile rør inneholdende kald aceton (20%, vekt /volum) og utfelt i 30 minutter på is etterfulgt av sentrifugering ved 15 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C.
supernatanten ble dekantert, og pelleten vasket med avkjølt aceton etterfulgt av fjerning av all aceton. Pelleten ble deretter solubilisert i LB [31,25 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 1,25% SDS, 6,25% glyserol, 0,06% bromfenolblått, og 5% h-merkaptoetanol], løst ved hjelp av SDS-PAGE, og overført til nitrocellulosemembraner.
Etter tilsetning av den blokkerende blanding [5% (w /v) melk i PBS (pH 7,4) og 0,05% Tween 20], ble membranen inkubert med en 1:100 fortynning av muse-anti -HLA antistoff, klone W6 /32 (BioLegend,). Signalet ble påvist med anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:5000; Santa Cruz Biotechnology). Membranen ble utviklet av forbedrede Chemiluminescence-Western blot gjenkjenning reagenser i henhold til produsentens instruksjoner (Santa Cruz Biotechnology).
Membranen ble inkubert med Ponceau S røde flekker løsning (Sigma-Aldrich) for å sikre ensartet gel lasting. En intern kontroll ble ikke brukt fordi det er stort sett umulig å finne en «housekeeping» protein i serum-fritt medium celler som kan brukes som en konstant referanse. Ponceau S kan brukes med fordel i løpet av aktin deteksjon for kvalitet eller lik belastning kontroll i Western blotting; Dessuten har den en ytterligere fordel, dvs. at det ikke er avhengig av et enkelt protein for å normalisere eller lasting kontroll. Dette omgår muligheten for at de «housekeeping» proteiner som brukes for dette formål kan faktisk variere i noen tilstander, eller at de er mettet på nivåene av lasting er nødvendig for deteksjon av lav-ekspresjonsproduktene eller at de ikke er detekterbare som i vårt eksempel [35 ].
ATM /ATR signalkaskade analyse
Etoposide (Sigma, St. Louis, MO, USA) ble oppløst i DMSO og lagt ved sluttkonsentrasjonen fem mikrometer i 1 time. Helcellelysater ble fremstilt fra nylig oppsamlede celler ved hjelp av en lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 400 mM NaCl) supplert med protease inhibitor blanding (Calbiochem, Merck Darmstadt , Tyskland), 0,5 mM PMSF og 2 mM natriumortovanadat. Lysater ble inkubert på is i 15 minutter og sentrifugert ved 13 000 rpm i 10 min. Proteinkonsentrasjon fra supernatanter ble bestemt ved Biorad-analyse (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). For immunoblot ble prøvene lagt i Laemmli-buffer på 6% eller 10% Tris-glycin-SDS /PAGE-geler, overført til nitrocellulosemembraner og hybridisert med egnede antistoffer ved 1:1000 fortynning. Blottene ble utviklet av forsterket kjemiluminescens (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Tyskland). Antistoffer: mus anti-phosphoAtm (Ser 1981), kanin-anti-phosphoChk1 (Ser 345), kanin-anti-phosphoChk2 (Thr 387), kanin-anti-fosfo JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, New York, NY, USA), kanin anti -p53 og mus anti-MCM7 (Santa Cruz).
Statistisk analyse
Alle resultater ble rapportert som gjennomsnitt ± SEM. Signifikansnivået ble bestemt ved Mann – Whitney-testen. En verdi * p≤0.05, ** p≤0,001 og **** p≤0,0001 ble betraktet som statistisk signifikant. Data ble uttrykt som ganger endring i forhold til kontroll, satt som 1.
Resultater
For å forstå de potensielle effektene av mekanisk stress på celle immunogenisitet, kreft og friske celler ble mekanisk stresset med en mikropumpe enhets- og sjokkbølger.
endringene indusert av mikropumpe levert stresset ble analysert ved Raman-spektroskopi. Raman målinger ble utført for de respektive celler (Mel 59c, 42a Mel Mel 103a og 293 T-cellelinje) i PBS-løsning i det spektrale området mellom 700-1800 cm
-1. Raman-spektrene med standardavvik feilfelt for kontroll (ubetonte) celler og mekanisk belastede celler i PBS-buffer-løsning er vist i fig. 1. Raman-spektrene for disse cellene er lik den karakteristiske Raman-spektrene for de fleste levende celler. Alle spektrene viser forskjellige topper ved ca. 780, 850, 1003, 1125, 1445, og 1660 cm
-1. Typiske bånd i disse spektra (fig. 1) er forbundet til den nukleotid-konformasjon (600-800 cm
-1), molekylære skjelett geometri og fosfatmessige vibrasjoner (800-1200 cm
-1), nukleotider ( 1200-1600 cm
-1), og CC og CH
x moduser grunn av proteiner og lipider [36]. Amidet vibrasjoner, slik som amid I-bånd (på grunn av C = O-strekking, 1650-1700 cm
-1) og amid III bånd (på grunn CN strekking og bøying NH, 1250 cm
– 1) i proteiner er lett gjenkjennelig [37]. Den amid I bånd i området mellom 1650-1700 cm
-1 give også meget viktig informasjon om bekreftelse status av sekundærstruktur (α-helix, β-ark og tilfeldig spiral struktur) av proteiner. Forskjellige aminosyrer kan bli gjenkjent eksplisitt ved ca. 1003, 1011 og 1032 cm
-1 i Raman-spektrene [37].
Raman-spektrene for kontroll og stresset cancercellelinjer (Mel 59c (A), Mel 42a (B), Mel 103b (C) og 293T (D)) med standardavvik error bar. Spektrene ble utført før og etter mekanisk belastning med mikropumpe.
variasjon av relative konsentrasjonen av protein i forskjellige celler ble beregnet ved hjelp av kurvetilpasning disse to områder med proteinbånd ved ca. 1440 og 1650 cm
1. Fig. 2 viser, for forskjellige celletyper, variasjon i relativ intensitet på cellemembranprotein /lipid (1440 cm
-1) og α-heliks (1650 cm
-1) bånd før og etter påføring av mekanisk spenning . En tydelig reduksjon av proteinmengden og dens α-heliks sekundær struktur ble observert ved mekaniske påkjenninger cellen behandling.
Normalisert areal på bånd sentrert på rundt 1440 (øverst) og 1670 cm
-1 (ned) for alle cellelinjer, som viser variasjonen i proteinkonsentrasjon og relativ α-heliks-innhold over celleoverflaten.
En meget klart bilde kan bli avdekket fra variasjonen av sekundærstruktur etter anvendelse av mekaniske påkjenninger. Det viser reduksjonen av α-heliks sekundære struktur av amid I bånd for alle cellene med mekaniske påkjenninger. Denne trenden er ikke klart observert i Mel 42a celler som spekteret er veldig bråkete (Fig. 1B). Videre, på dyp analyse, er det funnet at Mel 59c og 293-T-celler som oppfører seg på lignende måte. Alle de undersøkte cellelinjene viser en avtagende sekundærstruktur på mekaniske påkjenninger. Quenching av α-heliks struktur og en forsterkning av fluorescens bakgrunn, så vel klart kan observeres. Disse endringene i Raman-spektrene er i tråd med vår tidligere rapportert funn på MHC klasse I deteksjon av Raman-spektroskopi [38].
Videre er Principal Component Analysis (PCA) utføres for å diskriminere stresset til å kontrollere celler hver cellelinjer. PCA, en statistisk analyse, reduserer dimensjonalitet multi-dimensjonale datasett, å holde karakteristisk for alle spektrene [31]. De reduserte målepunktene i hvert spektrum er beskrevet av et begrenset antall variabler, kalt hovedkomponenter (PC). Disse PC innlemme det meste av den spektrale informasjon. Fig. 3 representerer den PCA-analyse (PC1 vs. PC2, PC2 PC3 vs. og PC1 vs. PC3) av alle cellelinjene i området 700-1800 cm
-1. De fylte blokker er for kontrollceller, mens de tomme blokkene er knyttet til stress celler. Stress celler kan også skjelnes fra kontrollceller og videre hver cellelinjer kan bli funnet i-gruppert tydelig i fig. Disse resultatene viser en interessant og viktig måte å skille mellom celler og også hvis cellene har blitt opprørt eksternt
PCA analyse på kontroll og stress celler for ulike cellelinjer.; Mel 42a, Mel 59c, Mel 103b og 293T. a) PC1 vs. PC2, b) PC2 vs. PC3 og c) PC1 vs. PC3.
For å bekrefte at mekanisk stress induserer en nedregulering av MHC klasse I på cellene overflaten utførte vi en immunfenotypen analyse for alle de forskjellige celletyper.
etter en bar makt behandling, ble av Micro og sjokkbølger, en klar reduksjon av MHC klasse i nivåer på kreftceller membranen observert (fig. 4A), mens ingen endringer ble observert når friske celler, fibroblast, macrophage, dendrittiske celler og lymfocytter, ble understreket (fig. 4B). Statistiske analyser ble utført på tumorceller (melanom og IM9 cellelinjer, fig. 4C) og friske celler (fibroblast, makrofag, dendrittiske celler og lymfocytter, fig. 4D).
Panel A viser reduksjon av MHC klasse i molekylene ekspresjon på kreftceller (5 melanom og en lymfoblastoid-cellelinjer) etter mekanisk belastning behandling ved hjelp av mikropumpe (øvre del) og sjokkbølgene (nedre del) sammenlignet med ubehandlede celler. Panel B rapporterer virkningen av mekaniske spenninger på noen sunne celler (fibroblaster og makrofager) av MHC klasse I med de to nevnte behandlinger. Den relatert isotoper kontroll MFI ga samme overlapping signal for alle cellelinjer som benyttes, derfor er utelatt. Panel C representerer de statistiske verdiene av ganger reduksjon av MHC-I utført på melanomceller (n = 4 separate eksperimentere med mikropumpe og n = 4 separat eksperiment med sjokkbølger; p 0,05) og IM9 celler (n = 10 separat eksperiment med sjokkbølger; p 0,0001). Den gangers nedgang av MHC-I ble avledet fra den Median fluorescensintensitet (MFI) på MHC-I molekyler før og etter behandling av melanom og IM9 cellelinjer. Panelet D viser de statistiske verdier som oppnås fra de forskjellige eksperiment (n = 3) for hver type av friske celler. Fibroblastene og PBL ble understreket med den mikropumpe stund, ble makrofager og dendrittiske celler behandlet med sjokkbølger. Verdien rapportert i panel D er ikke statistisk signifikant.
De andre immunogene molekyler analyseres, for eksempel MICA, MICB, ULBPs, PVR og Nectin-2, viste ikke signifikante endringer mellom kontroll og stresset celler med sjokkbølger (S2 fig.). For å forstå effekten av redusert MHC klasse I uttrykket på mekanisk stresset tumorceller immunogenisitet ble funksjonelle analyser utført ved hjelp av begge enhetene, Micro og sjokkbølger. Heri ble NK cellene mottakelighet for mekanisk belastede tumor målceller sammenlignet med deres trykksvake kontrollene ved klassiske cytotoksisitetsanalyser. En klar og reproduserbar økning i NK følsomhet ble observert etter mekanisk påkjenning behandling. Området for å øke NK lysing i prosent på tumorceller som var mellom 30-70% (fig. 5A-E), mens friske celler, dvs. fibroblast (fig. 5F), ikke svare for mekaniske påkjenninger behandling. Resultatene viser at mekanisk påkjenning forbedrer NK anerkjennelse for tumor med statistisk signifikans (fig. 5G-H), men ikke for friske celler. Mekanisk stress slår svulsten fenotype fra å være NK motstandsdyktig mot NK utsatt. Denne endringen i NK mottakelighet korrelerer med tumor spesifikke MHC-klasse I tap. MHC klasse I-molekyler er de mest potente hemmende ligander for NK reseptorer. MHC klasse I nedregulering på tumorceller utløse NK respons tilsvarende med «Manglende selv hypotesen» [21]. De data som er samlet her indikerer at en utstøtingen av MHC-I skjer etter mekanisk påkjenning fra tumorcelleoverflaten, er dette ikke tilfelle for friske celler. Våre funn indikerer en immunologisk relevant effekt av mekanisk stress på svulsten mottakelighet for cytotoksiske angrep
NK celle anerkjennelse av forskjellige tumorcelle mål på forskjellige E /T (effektor /mål) ratio. 59c, 42a, 66b ( melanomcellelinjer), 293T (nyrekreft) og IM9 (lymphoblastoidcell linjer) før (grå) og etter (sort) mekaniske påkjenninger. Den Mel 42a, 66b Mel, fibroblaster-celler (panel B, E og F) ble behandlet med mikropumpe, Mel 59c, IM9, ble 293 T-celler (panel A, C og D) understreket med de sjokkbølger. Som friske målceller, i dette tilfellet fibroblaster er vist. Representative eksperimenter er angitt for hver celletype. Paneler G og H viser erfaringstall fra tre ulike funksjonelle analyser, ved hjelp av NK-lymfocytter som Effektor celler (E) og IM9 og melanom celler som mål (T). De IM9 målceller ble behandlet med sjokkbølger (panel G: n = 3, p = 0,0325), mens melanom målcellene ble understreket med den mikropumpe (panel H, n = 3, p = 0,0186). E /T-forholdet 12/1, p. 0,05
Den økte celle cytotoksisitet observert i klassisk NK cytotoksisitetsassayer var ikke på grunn av passiv mål celledød indusert av mekaniske stressbehandlinger, men heller ved aktiv NK celler cytolitic program som vitne av reduksjon av mekaniske stresset målceller drap etter NK celle aktivering reseptorer blokade.
Deretter undersøkte vi mekanismen som mekanisk stress, forårsaket enten med mikropumpe som med sjokkbølger, kan føre til MHC klasse i nedregulering.
fig.
