Abstract
Micro (mi) RNA er viktige regulatorer involvert i ulike fysiske og patologiske prosesser, blant annet kreft. Den miRNA-302 familien har blitt dokumentert som å spille en avgjørende rolle i kreftutvikling. I denne studien undersøkte vi rollen til miRNA-302a i prostatakreft (PCa). MiRNA-302A uttrykk ble påvist i 44 PCA vev og 10 normale prostata vev, og deres clinicopathological signifikans ble analysert. Celleproliferasjon og cellesyklusanalyse ble utført på PCA-celler som stabilt uttrykte miRNA-302A. Målet genet av miRNA-302a og nedstrøms veien ble videre undersøkt. Sammenlignet med normal prostata vev, ble miRNA-302a uttrykk nedregulert i PCA vev, og var enda lavere i PCA vev med en Gleason score ≥8. Overekspresjon av miRNA-302a indusert G1 /S cellesyklusarrest i PCA-celler, og undertrykt PCa-celleproliferasjon både in vitro og in vivo. Videre, miRNA-302A hemmer
AKT
uttrykk ved direkte binding til sin 3 uoversatt region, noe som resulterer i påfølgende endringer i
AKT-GSK3p-cyclin D1 Hotell og
AKT-p27
Kip1
veien. Disse resultatene viser miRNA-302a som en tumor suppressor i PCA som tyder på at miRNA-302a kan brukes som et potensielt mål for terapeutisk intervensjon ved PCA
Citation. Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL Qin XJ, Zhang HL, et al. (2015) mikroRNA-302a Undertrykker Tumor Cell Proliferation ved å hemme
AKT
i prostatakreft. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10,1371 /journal.pone.0124410
Academic Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA
mottatt: 21 oktober 2014; Godkjent: 13 mars 2015; Publisert: 29 april 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir og dets støtteinformasjon filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (Grant No. NSFC 81202003) (https://www.nsfc.gov.cn . /) og Foundation of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (Grant No. 2,010,145) (https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) til GHS Vitenskap
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
som den mest utbredte malignitet blant menn i utviklede land [1], prostatakreft (PCA) også viser en jevn økning i forekomsten i Kina for over de siste tiårene. Ifølge den kinesiske Kreftregisteret Annual Report (2012), har PCa blitt den sjette vanligste kreftformen og den niende største årsaken til kreft-relaterte dødelighet hos menn, spesielt i byområder [2]. I tillegg opp til 70% av pasienter med PCa ha metastaser på diagnosetidspunktet, noe som resulterer i dramatisk redusert langtidsoverlevelse [3]. Derfor er det et viktig behov for å utforske de mekanismer som PCa generasjon og progresjon er igangsatt.
Økende bevis indikerer at microRNAs (mirnas), en type endogen, små ikke-kodende RNA, delta i ulike cellulære prosesser. Gjennom spesifikt å binde og spalte mRNA eller inhibere deres oversettelses [4,5], mirnas funksjon som enten onkogener eller tumor suppressorer [6]. Den miRNA-302 familien ble først identifisert i humane embryonale stamceller (hESCs) og humane embryonale carcinoma celler i 2004. Siden da har ulike studier på miRNA-302 familie fokusert på sin potensielle rolle i reprograming somatiske celler i indusert pluripotent stamceller samt embryonisk selvfornyelse [syv]. Flere transkripsjonsfaktorer som kommer til uttrykk tidlig i kreftstamcelle utvikling og vedlikehold, slik som
Oct4
,
Sox2
, og
Nanog
, ble funnet avgjørende for transkripsjonen regulering av miRNA-302 familie [8]. Interessant, Fareh et al. viste at stabile uttrykk for miRNA-302 var i stand til å indusere tap på
Oct4
,
Sox1
, og
Nanog product: [9]. Rollen til miRNA-302 i tumorigenesis har vært diskutert nylig, som motstridende konklusjoner har blitt trukket av ulike forskningsmiljøer. For eksempel ble endogen miRNA-302 ikke påvist i cervikale kreftceller, og ektopisk ekspresjon av miRNA-302 hemmet celleproliferasjon og tumordannelse [10]. I kontrast, transfeksjon av miRNA-302b i tykktarm kreft celler resulterte i en økt evne til koloni-formasjon, invasjon og migrasjon in vitro [11]. Men til dags dato, er det få studier har blitt gjennomført for å undersøke hvilken rolle miRNA-302 ved PCA.
I denne studien fant vi at sammenlignet med normal prostata vev, PCA vev uttrykt lavere miRNA-302A nivåer, og miRNA-302a uttrykk ble omvendt assosiert med Gleason score (GS). Vi viser også at overekspresjon av miRNA-302a i PCA celler kan indusere cellesyklus arrest og hemme celledeling in vitro og tumordannelse in vivo. I tillegg har vi identifisert
AKT
som et mål gen gjennom hvilke miRNA-302a utøver sin inhibitoriske rolle ved PCA.
Materialer og metoder
Pasientprøver
PCa vev og godartet prostatavevet ble oppnådd fra vevet banken ved Fudan University i Shanghai Cancer Center. Clinicopathological funksjoner av disse pasientene ble hentet fra Institutt of Urology database. Studien protokollen ble godkjent av Institutional Forskning Review Board ved Fudan University i Shanghai Cancer Center og signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne.
Cell kultur
Menneskelig PCA cellelinjer, humane embryonale nyre 293T celler (HEK293T) og normale prostata epitelceller (RWPE-1) ble kjøpt fra Institute of Cell Research av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Folkerepublikken Kina). LNCaP og 22Rv1, PC 3, DU145, og HEK293T Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium, F-12K medium, MEM medium, og DMEM-medium, henholdsvis, alt supplert med 10% føtalt bovinserum. RWPE-1-celler ble dyrket i K-SFM-medium supplert med bovint hypofyseekstrakt og human rekombinant epidermal vekstfaktor. Celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2.
RNA, miRNA ekstraksjon, og kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler og tumor vev ved hjelp Trizol reagens. Første kjede cDNA ble syntetisert ved bruk av RevertAid First Strand cDNA-syntese-sett (Liv teknologi, Carlsbad, CA), som deretter ble anvendt for sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR), sammen med forover og revers primere, og strøm SYBR grønn PCR master Blande.
β-aktin
ble brukt som
transkripsjonsnivåer en intern kontroll for
AKT. Primersekvensene var som følger:
AKT
-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, omvendt: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actin-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, omvendt. CTTAATGTCACGCACGATTTCC
I henhold til produsentens instruksjoner, miRNA fra vev og celler ble ekstrahert med Mirvana miRNA isolasjon kit (Livet teknologi, Carlsbad, California), og uttrykket nivåer av miRNA-302a ble oppdaget av TaqMan miRNA analyser (Livet teknologi Carlsbad, California), ved hjelp av U6 liten kjernefysiske RNA som en intern kontroll.
Vector konstruksjon, lentivirus produksjon og celle transfeksjon
den modne hSA-miRNA-302a-sekvensen ble syntetisert og innført i PLKO.3G vektoren for å fremstille PLKO.3G-MIR-302a. En AKT restaurering vektoren ble konstruert ved å introdusere den
AKT
CDS som ble forsterket fra PC-3 cDNA inn i pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vektor. Luciferase-3 uoversatt region (UTR) reporter vektor ble generert gjennom konstruksjon av
AKT
3UTR, som bærer en antatt miRNA-302a bindingssete i vektor MT01. Alle de konstruerte vektorer ble verifisert ved sekvensering.
PLKO.3G-MIR-302a blandet med psPAX2 og PMD2-G ble transfektert inn HEK293T celler ved hjelp lipofektamin 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll . Førti-åtte timer senere, lentivirus ble høstet og brukt til å infisere PC-3 og DU145 cellene. Deretter ble cellene sortert ved strømningscytometri (Coulter Beckman, Brea, CA) for å etablere stabile cellelinjer som konstitutivt uttrykker miRNA-302a (PC-3-302a og DU145-302a celler).
luciferase assays
Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon, ble cellene lysert ved anvendelse av 50 ul av passiv lysebuffer. Deretter ble en dual-luciferase assay utført som anvist av produsenten (Promega, Madison, WI). Forholdet mellom ildflue til Renilla luciferaseaktivitet ble anvendt for å gi uttrykk for luciferase-aktivitet. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Protein avling og western blot
Totalt proteiner ble høstet ved hjelp av CelLytic Extraction kit (Roche, Basel, Sveits) som inneholder proteasehemmere og kvantifisert ved hjelp av BCA Protein analyse~~POS=TRUNC Reagens kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter separering av proteiner ved anvendelse av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, ble proteinet overført til polyvinylidenfluorid membraner og deretter blokkert i 5% fettfri melk. Ved hjelp av de primære antistoffer og anti-kanin knyttet til pepperrotperoksidase (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) som det andre antistoffet, ble målproteinene probet og deretter visualisert ved anvendelse av ECL PlusWestern Blotting System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
β-aktin
var bruk som en lasting kontroll. De primære antistoffer omfattet følgende:
AKT product: (1: 1000), fosforylert
AKT product: (
Pakt
)
(Ser473) product: (1: 500 ),
GSK3p product: (1: 500),
pGSK3β (Ser9) product: (1: 500),
cyclin D1 product: (1: 1000),
p27
Kip1 product: (1: 1000),
PI3K product: (1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) og
β-actin
(1: 2000). (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)
celleproliferasjon og cellesyklusanalyser
CCK-8 og edu analysene ble utført for å påvise celleproliferasjon. Kort sagt ble CCK-8-analyser utføres som følger: celler ble sådd i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler /brønn. Etter tilslutning, cellene ble dyrket i friskt medium blandet med CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Shanghai) i 2 timer, før absorbansen ble målt med en mikroplateavleser ved 450 nm. For Edu analyser, ble cellene inkubert i Edu oppløsning (1: 5000) i 2 timer, deretter ble høstet og farget med Cell-Light Edu Apollo 643 In vitro flowcytometrisystemer Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner . Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri
A cellesyklusanalyse ble også utført ved anvendelse av strømningscytometri:. I korthet ble cellene fiksert med 75% kaldt etanol over natten, og deretter vasket med fosfatbufret saltløsning. Deretter ble propidiumjodid (50 ug /ml) innehold RNase tilsatt til cellene for DNA-farging før strømningscytometri-analyse.
kolonidannelse assay
Isolerte celler ble sådd i 60 mm plater ved en konsentrasjon på 500 celler /godt og så inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C. Tyve dager senere ble cellene farget med 0,5% krystallfiolett i 30 min. Colony tallene i hver plate ble telt ved hjelp av en invertert mikroskop.
In vivo tumorigenicity
PLKO.3G-Scr-transfekterte PC-3 celler (PC-3-Scr celler) og PC- 3-302a celler ble injisert subkutant i enten bakre flanken av samme 4-6 uker gamle BALB /C naken mus, som ble kjøpt fra Shanghai SLAC forsøksdyr Co., Ltd (Shanghai, Kina). Tumorstørrelsene ble målt ved bruk av målepunkter minst tre ganger ukentlig. Musene ble avlivet med CO
2 på dag 44. Tumorvolumet ble beregnet, og tumorvekten ble målt etter avliving. Tumorer ble deretter i to deler, hver del fiksert med 10% formalin eller oppbevart i -80 ° C. De dyreforsøk ble utført med godkjenning av dyrestudier Ethics Committee of Fudan University i Shanghai Cancer Center.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry (IHC) farging av parafininnstøpte prøvene ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],12]. I korthet, kanin anti-
AKT
-antistoff og anti-mus /kanin pepperrot peroksidase-merket-antistoff (Univ-bio, Shanghai) ble anvendt som primær og den andre antistoff, respektivt.
Statistisk analyser
forskjellen mellom kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av Student
t
-test eller analyse av varians. Tosidig
P
-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 20.0 (IBM Corporation, NY).
Resultater
miRNA-302a uttrykk undertrykkes i PCA vev og er lavere med høyere GS
PCa vev ble kjøpt fra totalt 44 mannlige pasienter med en gjennomsnittsalder på 67 år (fra 49 til 77 år) med nylig diagnostisert, patologisk bekreftet PCa. Blant dem, hadde 32 pasienter fikk radikal prostatektomi og 12 pasienter hadde mottatt transuretral reseksjon av prostata. Patologisk bekreftet normal prostata vev ble kjøpt fra 10 mannlige pasienter med blærekreft som hadde fått radikal cystektomi. De kliniske og patologiske trekk ved alle pasienter er beskrevet i S1 tabell.
Vi har oppdaget miRNA-302A uttrykk nivåer i 44 PCA vev og 10 normale prostata vev og funnet ut at, sammenlignet med normal prostata vev, uttrykt lavere PCA vev nivåer av miRNA-302a (fig 1A). Videre analyserte vi forholdet mellom miRNA-302A nivåer og clinicopathological funksjoner i PCA pasienter. Det var ingen signifikant sammenheng observert mellom miRNA-302a nivåer og alder, prostataspesifikt antigen nivåer, eller klinisk stadium (S1 tabell). Imidlertid sammenligning av miRNA-302a ekspresjonsnivåene i forskjellige PCA-vev viste at ekspresjon av miRNA-302a betydelig redusert når GS 7 (figur 1B). Kollektivt, postulerer vi at nedregulering av miRNA-302a uttrykk kan spille en viktig rolle ved PCA progresjon.
(A) miRNA-302a uttrykk ble nedregulert ved PCA vev sammenlignet med normal prostata vev. (B) miRNA-302a uttrykk var lavere i PCA vev med GS 7 sammenlignet med de med GS = 7. (C) Lavere nivåer av miRNA-302a ekspresjon ble påvist i fire humane PCA-cellelinjer sammenlignet med normale prostata epitelceller. (D) Høye nivåer av miRNA-302a uttrykk ble påvist i PCA-celler som stabilt uttrykker miRNA-302a (*
P
0,05).
Overuttrykte miRNA-302a hemmer PCa cellevekst i vitro og in vivo
for å undersøke funksjonen av miRNA-302a i PCA målte vi uttrykk for miRNA-302a i fire menneske PCA cellelinjer (LNCaP, 22Rv1, PC-3, og DU145) og normal prostata epitelceller (RWPE-1) ved kvantitativ real-time PCR. Som vist i figur 1C, var lavere ekspresjon av miRNA-302a i alle fire cellelinjer sammenlignet med RWPE-1-celler. Fordi vi spekulert i at overekspresjon av miRNA-302a kan hemme PCa cellevekst, vi stabilt overexpressed miRNA-302a i PC-3 og DU145 cellene, som ble bekreftet av kvantitativ revers-transkriptase (QRT) -PCR (fig 1D).
CCK-8, edu og kolonidannende analyser ble gjennomført for å undersøke om miRNA-302a overekspresjon berørt PCa celleproliferasjon in vitro. Som vist i Fig 2, var det en signifikant lavere (
P
0,05) vekst i PC-3-302a og DU145-302a celler sammenlignet med kontrollene. Flowcytometrisk analyser indikerte at prosenter av Edu-positive celler i både PC-3-302a og DU145-302a celler var lavere enn i kontrollene. I tillegg, sammenlignet med kontrollene, både PC-3-302a og DU145-302a celler utviklet færre kolonier på det 20. og 15. dager, henholdsvis. Derfor in vitro eksperimenter demonstrerer at miRNA-302a som utøves en undertrykkende rolle i PCa celleproliferasjon.
A CCK-8-analyse ble utført for å måle proliferasjon i (A) PC-3 og (B) DU145-celler. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik for den optiske tetthet (OD) verdien detektert ved 450 nm fra tre uavhengige eksperimenter. Celleproliferasjon ble oppdaget i (C) PC-3 og (D) DU145 cellene ved hjelp av Edu analysen analysert ved flowcytometri. (E, F) kolonidannelse analyser indikerte færre kolonier i miRNA-302a overekspresjon PCA celler. (*
P
0,05).
For ytterligere å bekrefte våre observasjoner i vivo, PC-3-Scr celler og PC-3-302a celler ble injisert i venstre og høyre bakre flanke av fem nakne mus, respektivt. Tumor volum ble målt ved hjelp calipers på ulike tidspunkter etter vaksinasjonen, og tumor vekter ble målt etter avliving. Både volum og masse var særlig lavere i PC-3-302a svulster enn i PC-3-Scr tumorer (
P
0,05; fig 3). Til sammen ble tydelig hemming celledeling observert etter overekspresjon av miRNA-302a i PCA celler.
PC-3-GFP celler og PC-3-302a celler ble injisert i venstre og høyre bakre flanke av BALB /c nakne mus, henholdsvis (A, B). Tumorvolumet (C) og massen (D) i det PC-3-302a gruppen var særlig lavere enn i PC-3-GFP-gruppe. (*
P
0,05).
Overuttrykte miRNA-302a induserer cellesyklus arrest i PCA celler
Nå som veksthemming ble observert i PCA celler utførte vi cellesyklus analyse for å undersøke om overekspresjon av miRNA-302a resulterte i cellesyklus endringer. Som vist i figur 4, øker andelen av celler i G1-fase bemerkelsesverdig seg på PC-3-302a celler, mens andelen av celler i S-fasen var betydelig mindre enn i kontrollgruppen. Tilsvarende resultater ble observert i DU145-302a celler, noe som tyder på at miRNA-302a effektivt indusere G1 /S cellesyklus arrest i PCA celler.
Andelen av celler i G1-fasen har økt betydelig i PC-3-302a celler (A, C) og DU145-302a-celler (B, D) sammenlignet med kontroller, mens andelen av celler i S-fasen var betydelig mindre enn kontrollene. (* P 0,05).
miRNA-302A undertrykker
AKT
uttrykk ved direkte rettet mot sin 3UTR
For å oppdage de molekylære mekanismer som miRNA- 302a utøver sin posttranskripsjonelt regulatoriske funksjoner, vi brukte bioinformatikk algoritmer (https://www.targetscan.org) for å søke mulige målgener, og fant at 3UTR av
AKT
mRNA havner en konservert bindingssete for miRNA-302A. Deretter undersøkte vi uttrykket av
AKT
på mRNA og protein nivået i PC-3-302a og DU145-302a celler og kontrollene. Som vist i figurene 5A og 6, sammenlignet med kontroller,
AKT
uttrykk signifikant redusert i PC-3-302a og DU145-302a celler, både på mRNA og proteinnivå. Videre
AKT
uttrykk i PC-3-302a svulster var betydelig lavere enn i PC-3-Scr svulster, som bestemmes av real-time PCR og IHC flekker (Fig 5B 5C). Disse resultatene tyder på at
AKT
uttrykk er nedregulert av miRNA-302a ved PCA.
AKT
mRNA uttrykk ble bemerkelsesverdig undertrykt i (A) PC-3-302a og DU145 -302a celler, og (B) PC-3-302a svulster (fem uavhengige tumorer ble oppdaget). (C) Immunohistochemistry flekker indikerte lavere uttrykk for
AKT
i PC- 3-302a svulster. (D) Relativ luciferaseaktivitet særlig undertrykt i villtype
AKT
-3 uoversatt region (UTR) transfekterte celler. (E) Skjematisk representasjon av luciferase reporter, som bæres villtype eller mutant
AKT
3 «UTR. (* P 0,05).
Western blot analyser viste downregulated AKT, fosforylert AKT (Pakt) og cyclin D1 nivåer, og oppregulert GSK3p, pGSK3β og p27
Kip1 nivåer i miRNA-302A overekspresjon PCA celler. PI3K nivåer ble ikke påvirket.
For å teste om miRNA-302A regulerer
AKT
av direkte binding til sin 3UTR, et luciferase reporter vektor som inneholder menneske
AKT
3UTR som fraktet villtype miRNA-302a binding sekvensen ble subklonet. En luciferase vektor som bærer den muterte 7-bp-region som er komplementær til fem frø region av miRNA-302a ble generert som kontrollen reporter (figur 5E). Sammenlignet med kontrollgruppen, ble den relative luciferaseaktiviteten undertrykket med 36% (
P
0,05) i villtype
AKT
3UTR transfekterte celler (figur 5D). Derfor hemmer miRNA-302a PCA celler via direkte rettet mot
AKT
.
miRNA-302A indusert cellesyklus endringer i PCA celler ved å hemme
AKT-GSK3p-cyclin D1
og
AKT-p27
Kip1
trasé
for ytterligere å evaluere effekten av miRNA-302a på
AKT
signalveien, vi har oppdaget uttrykk for oppstrøms (
PI3K
) og nedstrøms (
GSK3p
,
cyclin D1 Hotell og
p27
Kip1
)
AKT
effektorer av western blot. I tillegg ble nivået av fosforylert AKT (pakt) og pGSK3β også undersøkt. Sammenlignet med tilsvarende kontrollcellene, både GSK3p og pGSK3
β
nivåer, samt p27
Kip1 nivåer, var særlig forhøyet, mens Pakt og cyclin D1 var merkbart redusert i miRNA-302a transfektert PC-3 og DU145 cellene. Men uttrykk for
PI3K
ble ikke påvirket av miRNA-302a transfeksjon (figur 6). For ytterligere å bekrefte disse funnene, vi restaurert
AKT
uttrykk ved transient transfeksjon av en
AKT
ekspresjonsvektor som bærer
AKT
CDS til PC-3-302a og DU145-302a celler (kalt henholdsvis PC-3-AKT-CDS og DU145-AKT-CDS). Som indikert i Fig 7, etter restaurering av AKT uttrykk, både GSK3p og p27
Kip1 ble redusert, mens cyclin D1 uttrykk ikke ble reddet i både PC-3-AKT-CDS og DU145-AKT-CDS celler. Gitt de kritiske rollene til
AKT-GSK3p-cyclin D1 og AKT-p27
Kip1
signalveier i cellesyklusen overgang, våre resultater tyder på at miRNA-302a kan indusere G1 /S cellesyklus arrest i PCA celler ved samtidig å hemme
AKT-GSK3p-cyclin D1 Hotell og
AKT-p27
Kip1
vei, og dermed undertrykke PCa celle spredning.
Western blot analyser viste reddet uttrykk for AKT, og hemmet uttrykk for GSK3p og p27
Kip1 nivåer av AKT restaurering. Men cyclin D1 nivåer ble ikke reddet.
Diskusjoner
I denne studien har vi observert at miRNA-302a ble nedregulert i PCA vev. Videre analyser avslørte lavere uttrykk i PCA vevet med GS ≥8 enn de med GS 8. Overekspresjon av miRNA-302a indusert G1 /S arrest i PCA-celler, og bemerkelsesverdig undertrykket PCa celleproliferasjon in vitro og in vivo. Videre
AKT
ble avslørt som en direkte og funksjonell target gen av miRNA-302a.
I løpet av det siste tiåret, mest forskning som involverer miRNA-302 har fokusert på sin rolle i hESCs, som er preget av selvfornyelse og pluripotency. Studier analysere miRNA-302 funksjon i kreftutvikling er begrenset og inkonsekvent. Lin et al. fant at miRNA-302 kan hemme tumordannelse og indusere apoptose i humane brystkreft MCF7 celler, embryo teratokarsinomceller Tera-2 celler og leverkreft HepG2 celler [13]. Tilsvarende ble celleproliferasjon undertrykket i livmorhalskreft Hela og Siha celler, i tillegg til leverkreft SMMC-7721-celler, via cellesyklusregulering [10,14]. Imidlertid, Zhu et al. observert en invers fenomen i tykktarmskreftceller: overekspresjon av miRNA-302b førte til forbedret kolonidannende evne in vitro [11]. Augmented kolonidannelse evne ble likeledes validert i kreftstamceller fra hode og hals plateepitelkarsinom [15]. For første gang, avslørte vi trykkes miRNA-302a-ekspresjon i PCA vev sammenlignet med normale vev prostata, og lavere ekspresjon i PCA vev med høyere GS. Derfor spekulerer vi at miRNA-302a kan spille en viktig rolle ved PCA utvikling og progresjon.
I vår studie ble det observert en hemmende effekt av miRNA-302a på celleproliferasjon i PCA PC-3 og DU145 cellene, gjennom hindrer G1 til S faseovergang, som anses som en viktig hendelse i løpet av celleproliferasjon. I samsvar med tidligere studier [8,10,14], også fant vi bemerkelsesverdige nedregulering av
cyclin D1
i miRNA-302a overekspresjon PCA celler. Interessant er miRNA-302 spådd å målrette mange cellesyklus regulatorer. For eksempel Lin et al. demonstrerte at miRNA-302 samtidig undertrykkes både
syklin E-CDK2 og
cyklin D-CDK4 /6
signalveier [13] og dette målet blokkering ble regulert av flere transkripsjonelle faktorer, såsom
Oct4 Hotell og
Sox2 product: [8]. Men kort et al. rapporterte at miRNA-302a fremmet en økning i S-fasen, og en reduksjon i G1 fase i hESCs, selv om
cyklin D1
ble også undertrykt [8]. Åpenbart videre forskning å belyse de nøyaktige mekanismer for miRNA-302 funksjon er nødvendig.
Våre observasjoner at overekspresjon av miRNA-302a i PCA-celler indusert hemming av cellevekst in vitro og in vivo antyder at miRNA-302a kan post- transkripsjonelt regulere en svinge gen som er involvert i celleproliferasjon. Som et viktig onkogen,
AKT
påvirker et bredt spekter av fysiologiske funksjoner, inkludert metabolisme, proliferasjon, overlevelse, angiogenese, migrering og invasjon [16]. Likeledes
AKT
ble påvist å drive PCa dannelse in vivo [17]. Våre resultater indikerer at miRNA-302a trykt spredning og tumorgenisiteten av PCA celler gjennom
AKT-GSK3p-cyclin D1 Hotell og
AKT-p27
Kip1
vei, og ved direkte binding til 3UTR på
AKT
. Videre uttrykk for
PI3K
, som er rektor oppstrøms effektor av
AKT Hotell og har også vist seg viktig ved PCA utvikling, var ikke påvirket av miRNA-302. Det regulatoriske rolle miRNA-302 i
AKT
ble også demonstrert av Cai et al: etter miRNA-302s transfeksjon inn livmorhalskreftceller, de observerte forhøyet uttrykk for cyclin-avhengig kinase hemmere
p27
Kip1 Hotell og
p21
Cip1
, sammen med downregulated
AKT
nivåer. Videre har de også vist at
cyclin D1
er et annet mål gen av miRNA-302s, som utgjorde vår observasjon at cyclin D1 uttrykket ikke ble reddet etter at AKT restaurering [10]. Derfor som et mål av miRNA-302,
AKT
var spesielt undertrykt og utløste endringer i mange nedstrøms signalveier.
Våre funn også gi visse ledetråder med hensyn til mirnas-målrettet kreftbehandling. Tidligere studier viser at enkelte mirnas ble ofte overuttrykt i tumorer, mens de fleste mirnas ble nedregulert [18,19]. Global miRNA undertrykkelse ble funnet å øke kreftutvikling i både in vitro og in vivo-modeller [20], fremhever protumorigenic effekter etter miRNA tap-av-funksjon. Liang et al. observert en sensibiliserende rolle miRNA-302 erstatningsterapi hos brystkreftceller for ioniserende stråling [21.]. En annen fersk studie rapporterte at viral levering av la-7 miRNA kan hemme tumorvekst i et adenokarsinom modell mus lunge [22]. Likeledes våre resultater validert den hemmende effekten av miRNA-302a erstatning i PCA celler. Samlet utgjør disse studiene tyder på at overekspresjon av en eneste miRNA i kreftceller kan gi betydelig terapeutisk effekt.
I sammendraget, vår studie viser at miRNA-302a er avgjørende for PCa celle vekst ved å regulere G1-S-fasen overgang. MiRNA-302A uttrykk undertrykkes i PCA vev, og er enda lavere i PCA vev med høyere GS. I tillegg, gjennom direkte binding til sine 3UTR, miRNA-302A hemmer
AKT
uttrykk, noe som resulterer i påfølgende endringer i
AKT-GSK3p-cyclin D1
og
AKT-p27
Kip1
veier. Selv om det er klart at miRNA-302a er med i PCa, videre studier er nødvendig for å forklare de nøyaktige mekanismer som ligger under dens rolle i progresjon PCa, og dermed bestemme den potensielle verdien som en biomarkør og /eller mål for terapeutisk intervensjon.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Demografiske og clinicopathological karakteristikker av 44 pasienter med prostatakreft (PCA)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0124410.s001 plakater (docx)
bekreftelser
Forfatterne takker våre institusjonelle medlemmer, spesielt Dr. Sheng-Lin Huang for teknisk assistanse.
