Abstract
Mål
leucine-rik-gjenta-holdige G-protein-koblet reseptor 5 (lgr5 ) er en kandidat markør for kolorektal kreft stamceller (CSC). I denne studien undersøkte vi metylering status innen thelgr5 promoter og evaluert sitt forhold til CSC differensiering, prognose for tykktarmskreft, og dets clinicopathological funksjoner.
Metoder
metylering status innen Lgr5 promoter ble oppdaget med en metylering-spesifikk PCR i seks kolorektal kreft cellelinjer samt 169 primære kolorektal tumorvev. Differensiering av CSC ble undersøkt med immunfluorescens og immunocytochemistry. Nedregulering av lgr5 ble oppnådd med genspesifikke siRNA. Assosiasjonene mellom lgr5 metylering og clinicopathological funksjoner samt overlevelse av pasienter ble analysert med statistiske metoder.
Resultater
lgr5 promoter ble metylert i ulik grad for de seks kolorektal cellelinjer undersøkt, med fullstendig metylering observert i HCT116-celler hvori lgr5 ekspresjon ble delvis gjenopprettet etter DAC behandling. stamcelle sfære formasjon fra HCT116-celler ble ledsaget av økende metylering i lgr5 promoter og minkende uttrykk for lgr5. Knocking ned lgr5 av siRNA førte også til stamcelle kuler formasjon. Blant primær kolorektal tumorer, 40% (67/169) var positive for lgr5 metylering, mens ingen av de vanlige kolon vev var positive for lgr5 metylering. Videre lgr5 metylering signifikant assosiert med høyere svulst klasse, og negativ fjernmetastaser (p 0,05), samt bedre prognose (p = 0,001) hos pasienter med tykktarmskreft
Konklusjoner
Våre data tyder på at lgr5 metylering, gjennom regulering av lgr5 uttrykk og tykktarms CSC differensiering, kan utgjøre en roman prognostisk markør for pasienter med kolorektal kreft
Citation. Su S, Hong F, Liang Y, Zhou J, Liang Y, Chen K, et al. (2015) Lgr5 Metylering i Cancer Stem Cell Differensiering og prognose-Prediction i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10,1371 /journal.pone.0143513
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 20 mars 2015; Godkjent: 05.11.2015; Publisert: 24.11.2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet: Relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet var delvis støttet av National Natural Science foundation of China (NSFC. NO. 81302156), Guangzhou Pilotprosjekt for klinisk og translasjonell Research Center (tidligere gastrointestinal kreft, No.7415696196402), Guangdong Provincial Bio-Engineering Research Center for gastroenterologi sykdommer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Akkumulert bevis støtter hypotesen om at et lite antall udifferensierte stilk eller stilk-lignende celler, såkalte kreft stamceller (CSC), er ansvarlig for startfasen, utvikling, vedlikehold, formidling, regenerering og terapeutisk motstand . Senere ble tilstedeværelsen av CSC bekreftet i en rekke faste cancere som brystcancer [1, 2], glioblastom [3], hepatocellulært karsinom [4], og så videre, som ble oppnådd ved hjelp av, og i sin tur, fremmet identifikasjonen av mange tumorspesifikke antigener på celleoverflater, også kjent som CSC markører. For kolorektal kreft har flere CSC markører blitt identifisert, inkludert CD133 [5, 6], EpCAM /CD44 /CD166 [7], CD24 /CD29 [8] og lgr5 [9, 10]. Men lite er kjent om den biologiske betydningen av disse markørene, som kan ha sterke implikasjoner i multilineage differensiering kapasiteten CSC [8].
Blant de kolorektal CSC markører, lgr5, også kjent som GPR49, er en foreldreløs G-proteinkoblet reseptor (GPCR) som tilhører leucine-rik gjenta holdig GPCR [11]. Nylig ble det rapportert at lgr5 er positiv i stamceller i tynntarmen, tykktarmen og hårsekken [9, 12, 13], som tyder på potensiell betydning lgr5 i stamcellebiologi. Gjennomgående, de lgr5-uttrykkende stamceller var i stand til å bygge organoid strukturer in vitro, som ble eksperimentelt påvist i tarmen [14-16], mage [17] og leveren [18]. Videre var resipientmus med overfladisk skadet kolon transplantert med organoids avledet fra en enkelt Lgr5
+ tykktarm stamcelle etter omfattende in vitro ekspansjon, og følgelig dannes selv-fornyende krypter som var funksjonelt og histologisk normale [15]. Tvert imot, det lgr5-null-mus oppviste neonatal dødelighet på grunn av ankyloglossia og gastrointestinal distensjon [19]. Den oppregulering av lgr5 har blitt rapportert i mange menneskelige solide tumorer, som levercellekarsinom [20, 21], tykktarm [22], ovarietumorer [22], basalcellekarsinom [23] og magekreft [24]. Funksjonelt, forsterket lgr5 uttrykk fremmet kreftcelle spredning og tumorigenicity [23], mens stanse av lgr5 redusert spredning, migrasjon og kolonidannelse, tumorigenitet [25] og indusert cellulær apoptose [22]. Lgr5 er et nedstrøms mål for den Wnt-β-catenin signalveien [26]. I intakte dyr, lgr5 var en del av en negativ feedback loop finjustere Wnt signal under intestinal morphogenesis. Lgr5 mangel indusert for tidlig differensiering av Paneth celler, som er samtidig med den opp-regulering av Wnt aktivitet, noe som tyder lgr5 er en negativ regulator av Wnt signalisering i progenitorceller av det fremkallende tarmen [27]. I tillegg lgr5 homologer er fakultative Wnt reseptor komponenter som medierer Wnt signalforsterkning av løselige R-spondin proteiner [28].
Økende bevis peker på viktigheten av lgr5, på ulike uttrykks nivåer, i ulike sykdoms paradigmer og utviklingsstadier. Men de underliggende mekanismene for expressional regulering på lgr5 fortsatt unnvikende.
DNA metylering er påvist som en viktig epigenetisk mekanisme for å inaktivere gener under tumorgenesen [29, 30]. Nylig er det stadig økende forskere som avslører at metylering av noen gener regulerer utvikling, progresjon og tilbakefall av svulster [31-33], som inkluderer tykktarmskreft [34]. I den foreliggende studien undersøkte vi metylering status av CpG øyer i umiddelbar promoterregionen av lgr5 genet i kolorektale cancercellelinjer og tumorvev, og analysert sin tilknytning til CSC differensiering, clinicopathological funksjoner, samt prognosen for pasienter med kolorektal kreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og behandling
kolorektal kreft cellelinjer (HCT116, SW480, HT29, LoVo, colo205, SW620, SW1116) ble hentet fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Sijiqing, Beijing, Kina). For demetylering behandling, ble dyrkede celler inkubert med 3 uM 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC, Sigma, St. Louis, MO) i 72 timer med medium endret hver dag. Mock medikamentelle behandlinger ble utført parallelt med PBS (pH 7,4).
Menneskelige vevsprøver og pasientinformasjon
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen of Southern Medical University (Guangzhou, Kina) og skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. 169 pasienter (gjennomsnittsalder 57 ± 22,3 år) ble diagnostisert med sporadisk kolorektal kreft hos Institutt for patologi (Nanfang Hospital, Southern Medical University) mellom 1999 og 2001. Alle diagnoser ble etablert basert på histologiske undersøkelser av standard HE-farget seksjoner etter WHOs retningslinjer. Svulster ble iscenesatt basert på Dukes iscenesettelse system. Disse pasientene fikk ikke neoadjuvant radio kjemoterapi heller ikke de har noen complicattions med andre kjente kreftformer ved diagnosetidspunktet. Pasienter døde innen seks måneder etter kirurgisk reseksjon ble ekskludert.
Western blot-analyse
25 ug av det totale protein ble inkubert med denaturerende buffer (0,3 M Tris pH 6,8, 10% 2-merkaptoetanol, 40% glycerol, 20% SDS, 0,02% bromfenolblått) i 5 minutter ved 95 ° C, fylt på en 10% SDS-polyakrylamidgel for elektroforese, overført til PVDF-membraner, blokkert i 5% ikke-fettholdig melk /TBS-Tween i 1 time ved romtemperatur og inkubert over natten ved 4 ° C i et primært antistoff mot lgr5 (1: 500, Abcam, Cambridge, MA) eller en mus alfa-tubulin-antistoff (intern kontroll, 1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA). Membranene ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Immunreaktiviteten ble påvist kjemiluminescens (Pierce, Rockford, IL).
RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 2 ug total RNA ble underkastet første-cDNA syntese (Fermentas, Ontario, Canada) i henhold til produsentens anvisninger. Primer sekvenser for RT-PCR ble oppført i tabell 1, med GAPDH brukt som en intern kontroll.
DNA-ekstraksjon, metylering spesifikke PCR (MSP) og bisulfite sekvensering PCR (BSP)
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellelinjer eller primære tumorer etter en standard fenol-kloroform-ekstraksjon metode (Qiagen, Valencia, CA). Bisulfite modifikasjon av genomisk DNA ble utført ved hjelp av EZ DNA metylering kit (Zymo Research, Orange, CA). Metyleringen mønster i CpG øyene i lgr5 promotoren ble bestemt ved hjelp av MSP bisulfitt-behandlet DNA som templat og MSP primere er oppført i tabell 1. MSP-primere ble utformet etter prinsippet som er beskrevet tidligere [35] og testet for ikke å forsterke ikke- bisulfited DNA. MSP ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 38 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, deretter med en 5-minutters forlengelse ved 72 ° C. MSP produkter ble deretter separert på 1,5% agarosegeler farget med ethiium bromid og visualisert under UV-spektrofotometer. Vann blanks ble anvendt som negativ kontroll.
For bisulfitt-sekvensering, BSP primere (tabell 1) ble brukt til å amplifisere et 428 bp-fragment som dekker den promoter-ekson 1 (-362 til 96) region av lgr5 genet. BSP primere ble utformet for ikke å dekke eventuelle CpG nettsteder. PCR-produktene ble deretter subklonet inn i pCR2.1-TOPO (Invitrogen) plasmider og plasmid-DNA fra fem bakterielle kloner ble valgt ut for DNA-sekvensering i henhold til tidligere beskrevet [36].
Stamcelle sfære dannelse og differensiering
For å undersøke stamcelle sfære formasjon, 5 × 10
5 HCT116-celler ble dyrket i 60-mm kulturskål i suspensjon i serumfritt DMEM /F12 (Gibco, Carlsbad, California), supplert med B27 ( 01:50, Invitrogen), 40 ng /ml EGF (Sigma) og 20 ng /ml FGF-2 (Chemicon, Billerica, Massachusetts), 100 U /ml penicillin G, 100ug /ml streptomycin (Gibco, Australia). CSC kuler begynte å danne omtrent to uker senere. For å indusere differensiering CSC ble CSC kulene vasket med PBS tre ganger, og deretter dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin G, 100ug /ml streptomycin. Nuclear syre og proteiner ble ekstrahert fra disse celler på dag 0, 1, 3 og 7, henholdsvis som beskrevet [37-39]. Alle celler ble dyrket ved 37 0C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO2.
immunfluorescens (IF) og immunhistokjemi (IHC)
For IF, ble CSC kuler festet med 4% formaldehyd i PBS i 10 min ved romtemperatur og deretter permeabilisert med PBS inneholdende 0,1% Triton X-100. Etter blokkering med 1% bovint serumalbumin i 20 min ved værelsestemperatur ble CSC kuler inkubert med primært monoklonalt museantistoff CK20 (1: 300, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C over natten og deretter med FITC-konjugert anti-kanin IgG (Santa Cruz).
For IHC beskrevet som våre tidligere metoder [40], formalinfiksert parafin-vevssnitt ble avvoksede i xylen og rehydrert med destillert vann., og ble utført varme mediert antigen henting med citrat-buffer pH 6,0 og blokk med 3% BSA. Platene ble deretter inkubert med lgr5 antistoff (1: 300, # 137484, Abcam) ved 4 ° C over natten, med signalet som forsterkes og utviklet ved hjelp av ABC-system og DAB substrat kromogen (Maixin Bio, Kina), henholdsvis, etter av haematoxylin kontra. Expression ble ansett å være «positive» når 10% eller mer kreftceller ble farget.
Transfeksjon av små interfererende RNA (siRNA)
målretting sekvens for lgr5 spesifikke siRNA nukleotider var 5 « -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 «og den krypt siRNA sekvensen 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3» ble anvendt som kontroll. Begge siRNA tomannsboliger ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
For å vurdere uavhengig korrelasjon av lgr5 metylering med andre variabler, ble utført multivariate logistisk regresjonsanalyse. For overlevelsesanalyse, ble Kaplan-Meier metoden som brukes for å vurdere overlevelsestiden fordeling i forhold til lgr5 metylering.
p
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Lgr5 ble forskjellig metylert i kolorektal kreft cellelinjer
For å teste potensialet i DNA-metylering i å regulere lgr5 uttrykk vi først undersøkt ekspresjonen av lgr5 i syv kolorektale cancercellelinjer og dens endring som respons på 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC), den klassiske metylering inhibitor. Som vist i figur 1A og 1B, for HCT116, SW480 og SW620-celler, lgr5 ekspresjon på begge steady-state-mRNA og proteinnivå ble oppregulert i respons til DAC behandling, noe som tyder lgr5 ekspresjon kan bli inhibert i disse cellene via DNA-metylering. I motsetning til dette uttrykk i SW1116, LoVo, HT29 og colo205-celler ble ikke dramatisk endret ved DAC behandling, noe som tyder på en irrelevanse til metylering-involverte mekanismer. I samsvar med disse observasjonene, vi har oppdaget fullstendig metylering av arrangøren regionen CpG øyer i HCT116 cellene, delvis metylering i SW480 og SW620 celler og ingen metylering i HT29, colo205, SW1116 eller LoVo celler (figur 1C) ved MSP analyse. Nøyaktigheten av MSP analysen ble ytterligere bekreftet med sekvensering bisulfitt (Fig 1 D). Derfor er uttrykket av lgr5 i disse kreftcellelinjer godt korrelert med metylering status for promotor CpG øyene, som støtter DNA-metylering som en mekanisme for å regulere lgr5 nivå.
A. Total RNA ble ekstrahert fra angitte celler uten (-) eller med (+) DAC behandling og RT-PCR ble utført for å undersøke lgr5 steady-state mRNA nivå, med GAPDH som en intern kontroll. B. Proteininnholdet av lgr5 ble målt i alle syv kolorektal kreft-celler behandlet som i A med western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en intern kontroll. C. DNA-metylering status av et CpG øy innenfor den proksimale promoterregionen av lgr5-genet ble bestemt med MSP analyse. M, metylering signal; U, unmethylation signal.
dd
H2O, vann som ikke inneholder genomisk DNA. D. Metylering tettheten i den proksimale promoterregionen av lgr5 genet i syv tykktarmskreftcellelinjer ble bestemt ved BSP analyse. Øvre panel, diagram av fordelingen av CpG områder innenfor den 5 «UTR av lgr5 genet. Hver loddrett strek representerte en CpG nettsted. Nedre panel, BSP av 14 CpG områder innen -150 til 42 region i forhold til transkripsjon stjerners hotellet (TSS) i syv kolorektal kreft cellelinjer. Hver rad representerer et individuelt klonet allel som ble sekvensert følgende bisulfit DNA modifikasjon. Sirkler representerer CpG nettsteder og deres avstand nøyaktig gjenspeiler CpG tetthet av regionen. Svart sirkel, metylert CpG nettstedet; hvit sirkel, unmethylated CpG nettstedet.
Lgr5 metylering korrelert med CSC- differensiering in vitro
Som rapportert tidligere, lgr5 uttrykk var høyere i udifferensierte celler i forhold til differensierte celler i tykktarmskreft [9]. For å undersøke involvering av lgr5 DNA metylering i CSC differensiering, avledet vi kreft stilk eller stilk-lignende celler fra HCT116 cellelinje etter en sfærer modell som beskrevet [41] hvor brystkreft stamceller ble beriket av dyrking i suspensjon som ikke-festede kuler. To uker etter kultur i serumfritt medium inneholdende EGF og FGF-2, erholdt vi CSC kuler fra HCT116-cellelinjen (figur 2A, første panel). Ingen uttrykk for cytokeratin 20 (CK20), en markør for epitelcelledifferensiering, kunne påvises i CSC sfærer av IF (figur 2B, første panel). Deretter kan disse CSC kuler vokse med suspensjon tilstand, og ble etter hvert tett og sammenslått (fig 2, øvre panel). Men disse kulene ble inkubert med serumholdig medium hvor de gradvis klebet til overflaten av kulturplaten, som var karakteristisk for differenation cellsby dissosiasjon av celler fra kulene (figur 2A, ned panel), og opp-regulering av CK20 (Fig 2B) fra dag 0 til dag 7. Samtidig med denne differensieringsprosessen ble lgr5 uttrykk også reduseres ved qPCR og western blot (figur 2C og 2D). Nedregulering av ekspresjon lgr5 også godt korrelert med en betydelig økning i tettheten av promoteren metylering (figur 2E).
A. CSC kuler fra HCT116 cellelinjer vokste med CSC medium uten serum (øvre panel); Eller, CSC kuler endret til normal medium med 10% FBS (ned panel). Observasjonstid Punkt: en dag, 3 dager. Og 7 dagers og fotografert under lett mikroskop. B. Immunofluorescent farging av CK20 i CSC sfærer; Grønn indikert ck20 farging. C. RNA ble oppsamlet på forskjellig tidspunkt, og ble analysert ved qPCR i medium med 10% FBS-gruppe. D. Proteinet ble oppsamlet i forskjellig tidspunkt i medium med 10% FBS gruppe, ble lgr5 påvist med western blot.westernblot α-tubulin ble benyttet som intern kontroll. E. BSP analyse av lgr5 promoter metylering tetthet i CSC kuler og tidspunkt i i medium med 10% FBS-gruppe. Svart sirkel, metylert CpG nettstedet; hvit sirkel, unmethylated CpG nettstedet.
Knocking ned lgr5 indusert differensiering av CSC kuler
For å undersøke årsakssammenheng mellom nedsatt lgr5 uttrykk og differensiering av CSC kuler, transfektert vi CSC kuler med lgr5 spesifikke siRNA. I forhold til egge kontroll siRNA, lgr5 spesifikke siRNA betydelig redusert lgr5 uttrykk (fig 3A, p 0,001). SiRNA behandling førte også til oppregulering av CK20, samt dissosiasjon av CSC kuler (figur 3B). Dette er konsistent med fenotypene assosiert med CSC differensiering, noe som tyder på at nedregulering av lgr5 var tilstrekkelig til å indusere differensiering av CSC kuler.
A. B.Expression av lgr5 mRNA og protein i CSC kuler transfektert med enten krafse eller lgr5 spesifikke siRNAwas undersøkt av qPCR og western blot (øvre panel) C. Immunofluorescent farging av CK20 (grønn) i CSC sfærer transfekterte som i A. Blå: DAPI kjernefysiske flekken.
lgr5 metylering påvises i kolorektal kreft, men ikke normale kolon vev
Deretter undersøkte vi promoter metylering av lgr5 genet i normale kolon vev versus kolorektal kreft vev. Som vist på fig 4A og 4B, positiv metyleringen var bare påvisbar i kolorektal kreft vev, men ikke normale tykktarm vev. MSP analyse på totalt 169 kolorektal kreft avdekket at 67 prøver (40%) var positive for lgr5 promoter metylering. I tillegg har vi også undersøkt lgr5 uttrykk ved IHC.Lgr5 negative uttrykk var assosiert med lgr5 metylering i samme kreftpasienter vev av MSP. Og lav metylering eller unmethlation lgr5 uttrykk var åpenbart høyere i lav metylering eller unmethlation gruppe av MSP (fig 4C). Det data antydet at lgr5 metylering ble stengt for sitt uttrykk.
A. MSP ble utført på normale vev kolon (A) eller primær kolorektal kreft. M, metylering signal; U, unmethylation signal. B. Lgr5 ekspresjon var i normalt vev og kreftvev, mørke piler representerte lgr5 positive celle i ved immunohistokjemisk farging. N1 representerte en av de normale vev kolon; T5 og T22 representerte henholdsvis tykktarmskreftpasienter.
Lgr5 metylering negativt korrelert med tumor grad, tumormetastase og positivt med god prognose for tykktarmskreft
For å evaluere den kliniske betydningen av lgr5 metylering, analyserte vi sammenhengen mellom lgr5 promoter metylering status, som bestemmes av MSP, med en rekke clinicopathological funksjoner i pasienter med kolorektal kreft (tabell 2). Vi har registrert en betydelig omvendt korrelasjon mellom positiv lgr5 metylering og høyere svulst grad (p 0,001), positiv lymfeknuteaffeksjon (p = 0,04) og positiv fjernmetastaser (p = 0,024), men vi identifiserer ikke andre funksjoner som for eksempel pasientens alder , kjønn, tumor posisjon eller Dukes stadieinndeling. Omvendt korrelasjon antydet at lgr5 metylering var relatert til kreft i en mindre invasiv fenotype,
i
.
e
., Høyere svulst klasse, negativ lymfeknute og fjernmetastaser, som ble videre støttet av Kaplan-Meier overlevelsesanalyse (figur 5). Blant de 169 pasientene som ble analysert, 100-måneders overlevelse var signifikant høyere i tilfeller med lgr5 metylering enn de unmethylation (
p =
0,001). Resultatene indikerte at lgr5 metylering var en selvstendig prediktiv biomarkør for god prognose av tykktarmskreft.
Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasienter gruppert basert på lgr5 metylering status. Heltrukken linje: tykktarmskreft positivt for lgr5 metylering, n = 67; stiplet linje: tykktarmskreft negativ for lgr5 metylering, n = 102. HR: Hazard Ratio; 95% KI: 95% konfidensintervall
Diskusjoner
Tissue selvfornyelse blir vedlikeholdt av stamcelle nisjer.. Metylering mønster i de nisjene regulerer stamcelle omsetning, påvirker celle skjebne, heterogenitet, og så videre. Når balansen av dette mønsteret er opprørt, stamceller med fenotypiske og genetiske endringer kan gjennomgå tumorigenesis. En stor mengde bevis har vist at epigenetiske endringer, for eksempel hypermethylation av CpG øyer i promoter regioner av ulike gener, er sannsynlige store bidragsytere til tumorigenesis i et bredt spekter av kreft [42] og CpG Island Shores i sekvenser opptil 2 kb fjernt var sterkt assosiert med genuttrykk i tykktarm kreft [43]. I tillegg ble flere kreft stilk celleoverflatemarkører også regulert av genet metylering. Furhtermore, Hypermethylation status var relatert til lav eller ingen ekspresjon og celledifferensiering, for eksempel, CD133 i tykktarmskreft og gliom [44, 45], og EpCAM i brystkreft [36]. I denne studien hypotese vi at Silenced eller redusert lgr5 uttrykk relatert til CpG island metylering. Til støtte for denne hypotesen, behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine restaurert lgr5 uttrykk i et par kolorektal tumorcellelinjer, med dramatiske oppregulering i HCT116 cellene som inneholder fullstendig denaturert lgr5, og midtre eller ingen oppregulering i annen celle linjer som inneholder delvis eller nesten metylert lgr5. Videre behandling av DAC endret ikke lgr5 uttrykk i Melo publisert studie [34] i SW620 cellelinje, men en liten økning i vår nåværende studie. Vi analyserte lgr5 metylering i ca ~ 1 kb formidler av lgr5, og det kan være noen CpG øyer i andre 1 kb fragment. Så vi kan ikke påvise lgr5 metylering i SW620 cellelinje, men lgr5 uttrykk var en liten økning etter DAC behandling eller annen uklar årsak. Disse data antydet at DNA metylering spilt en viktig rolle i å regulere lgr5 uttrykk.
Tidligere studier viste at lgr5 spilte en nøkkelrolle i å opprettholde egenskapene til tarm og tykktarm stamceller. Lav eller ingen lgr5 uttrykk ble påvist i differensierte celler. I motsetning til dette en høy ekspresjon av CK20, en differensiert celle-markør, ble også funnet i forskjellige krefttyper [38, 46]. I samsvar med disse funn våre resultater indikerte at lgr5 ekspresjon var høy i kolorektal CSC, og redusert differensiering, som ble ledsaget av økt DNA-metylering og CK20 opp-regulering. Videre slå ned lgr5 i CSC sfærer indusert CSC differensiering. Disse resultatene antydet at nedregulering av lgr5, noe som resulterte fra DNA metylering, var ansvarlig for den differensierte fenotype av CSC.
Vi undersøkt videre den kliniske betydningen av lgr5 metylering i sporadisk kolorektal kreft. Vi la merke til at dette ikke var den første studien ser inn epigenetisk modifikasjon av CSC markører. Det har blitt rapportert at hypermethylation av CPG øyene ligger i promoterregionen av stammen /forløper-cellemarkør CD44, en av kolorektal og andre kreftstamcelleoverflatemarkører, kan forutsi biokjemisk tilbakefall i prostatakreftpasienter som gjennomgår radikal prostatektomi [47] . Den hypometylering av CpG områder i tre proksimale arrangører bestemt CD133 uttrykk i glioblastomas [42, 48] (DELET: og hypermethylation av CD133 i HCT116 førte til xenograft tumordannelse i hårløse mus sammenlignet med celler uten CD133 metylering). Interessant, vi også observert at lgr5 ble oftere metylert i kolorektal kreft kolon enn i normale kolon, og at lgr5 uttrykk ble strengt regulert ved metylering. Clinicopathological analyse raknet det motsatte sammenslutning av positive lgr5 metylering med høyere svulst klasse og invasivitet, i samråd med den oppfatningen at overuttrykk av lgr5 var assosiert med mer ondartede og invasiv kreft. I tillegg fant vi også at lgr5 metylering var signifikant assosiert med bedre prognose blant pasienter med kolorektal kreft.
Det var tidligere rapportert at tap av lgr5 uttrykk er sett hos ca. 40% kolorektal kreft [22]. I vår studie har vi også observert positiv lgr5 promoter metylering hos omtrent 40% av kolorektal kreft, og bekreftet at negative lgr5 uttrykket ble signifikant assosiert med arrangøren DNA metylering. Disse resultatene antyder at lgr5 gir en balanse mellom kreft celledeling og CSC differensiering. Derfor kan deregulert lgr5 uttrykk spissen balansen mot en mer transformert og onkogene fenotype, som observert i en annen stilk-cellemarkør, Oct4 [49] På samme måte vil, lgr5 mangel på normal tynntarm fører til for tidlig Paneth celler differensiering i tynntarmen [ ,,,0],27]. I denne studien har vi identifisert en ny mekanisme for å kontrollere uttrykk for lgr5,
i
.
e
. via promoter metylering. Vi har vist at nedregulering av lgr5, som et resultat av enten siRNA behandling eller promoter metylering, var tilstrekkelig til å indusere differensiering CSC. Lignende regler har blitt observert i andre stamcellemarkører, slik som Oct4 [49]. Det har blitt foreslått at effektiv DNA-metylering er på plass for å sikre stanse av denne potente kreft genet under utvikling. Hypermethylation av lgr5 resultater i kreftstamcelledifferensiering. Som vi vet, differensierte celler er ikke i stand til potent selvfornyelse og aresensitive til tradisjonelle kjemoterapi narkotika, så lgr5 metylering kan øke kjemoterapi som er følsomme for kolorektal kreftcelle. Men det er verdt å merke seg at DNA metylering er ikke den eneste molekylære mekanismen som regulerer kreftstamcelle heterogenitet. Andre mekanismer, som for eksempel histonmodifikasjonene, mikroRNA, kromatin remodelers og så videre [50], kan også fungere under kreftutvikling, noe som er utenfor rammen av denne studien. Hva mer er at DNA metylering kan ha en crosstalk med andre signalveier eller regulering av andre genekspresjon. Melo [34]
et al
. rapportert at arrangøren metylering av Wnt målgener er en sterk prediktor for tilbakefall av tykktarmskreft, og at en meget mulig mekanisme er at hemming av disse genene resultat av metylering kan saklig forbedre Wnt aktivitetsnivå og føre til sykdomsutvikling og tilbakefall via aktivering av ennå uoppdagede positive mål. Derimot Lgr5 høy ekspresjon var relatert til dårlig prognose i tykktarmskreft [51, 52]. Dempe lgr5 uttrykket kan fremme tykktarmskreft celle apoptose og redusert metastase [22]. Metyleringen av promoteren reduserte lgr5 ekspresjon i humane colon cancer vev og cellelinjer i Melo et al. rapportere og i vår studie. Det virket som lgr5 metylering indikerte god prognose og mindre invasjon, og våre resultater var som ligner på dette. Det var noe annerledes med Melo et al. resultater, kan det være forspenningen fra våre prøver. De metastaseprøver er 31 (kun 18,3%, 31/169) i vår studie, men prøvene nesten var stadium II i Melo`s artikkelen.
Totalt vår studie viste at lgr5 metylering isresponsible for lgr5 genet Slå og kreft stamcelle differensiering i tykk- og endetarmskreft. Videre er lgr5 metylering også omvendt forbundet med høy tumor klasse og positiv fjernmetastaser. Videre kan det tjene som en markør for å forutsi bedre overlevelse hos pasienter med primær kolorektal kreft. Disse dataene antyder at silencingof lgr5 genet via CpG island metylering kan være involvert i utviklingen av CRC og kan potensielt tjene som et terapeutisk mål (et supplement til tradisjonell cellegift for tykktarmskreft). Videre studier er nødvendig for å belyse de detaljerte reguleringsmekanismer in vivo.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 data. Data for overlevelsesanalyse (utvidet figur 5)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0143513.s001 plakater (XLSX)
Takk
Vi ønsker å takke Dr. Shunhua Jin (Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University) for MSP teknisk assistanse.
