Abstract
Innledning
Myosin-9 (MYH9) tilhører myosin super av aktin-bindende motor protein . Nylig MYH9 har vært antatt å være assosiert med kreft celle migrasjon, invasjon og metastasering. Målet med denne studien var å immunohistochemically undersøke MYH9 uttrykk i kirurgisk reseksjon ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), og evaluere sine sammenhenger med clinicopathological parametere og prognosen for pasienter.
Metoder
MYH9 uttrykk ble immunohistochemically studert i 266 sammenhengende resected NSCLCs, og dets assosiasjoner med clinicopathological parametre ble evaluert. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Cox-modeller ble brukt til å beregne effekten av MYH9 uttrykk på overlevelse.
Resultater
MYH9 uttrykk ble oppdaget i 102 av 266 (38,3%) NSCLCs. MYH9 uttrykk var signifikant korrelert med adenokarsinom histologi (
P
= 0,014), dårligere differensiering ((
P
= 0,033), intratumoral vaskulær invasjon og lymfatisk invasjon ((
P
= 0,013 og p = 0,045 henholdsvis), og en dårligere prognose ((
P
= 0,032) I tillegg multivariat analyse viste at MYH9 uttrykk uavhengig spådd en dårligere overlevelse (HR 2,15;. 95% CI, 1,17 til 3,92, (
P
= 0,01)
Konklusjon
Denne studien viste at MYH9 er uttrykt i en undergruppe av NSCLC med en mer ondartet karakter, og dens. uttrykket er en indikator på en dårligere overlevelsessannsynlighet
Citation. Katono K, Sato Y, Jiang SX, Kobayashi M, Nagashio R, Ryuge S, et al (2015) Prognostic Betydningen av MYH9 Expression i resected Non. . -Liten Cell Lung Cancer PLoS ONE 10 (3): e0121460 doi:. 10,1371 /journal.pone.0121460
Academic redaktør: John Souglakos, Universitetet General Hospital i Heraklion og Laboratorium for Tumor Cell Biology, School of medisin, Universitetet i Kreta, Hellas
mottatt: 29 august 2014; Godkjent: 01.02.2015; Publisert: 31 mars 2015
Copyright: © 2015 Katono et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Primær lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis, med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for nesten 80% av dødsfallene [1]. Prognosen for pasienter med NSCLC er i hovedsak korrelert med tumormetastase. Prosessen med tumormetastaser består av kompliserte trinn: som involverer tumorcellemigrering fulgt av løsrivelse fra den primære tumor, invasjon inn i omgivende vev, intravasation til blod eller lymfekar, spredning i hemolymphatic system, og ekstravasasjon ved sekundærsider [2]. Forstå proteiner relatert til tumor migrasjon, invasjon og metastasering kan være nyttig som nye prognostiske markører eller terapeutiske mål i NSCLC. En nær sammenheng mellom metastaser og chemoresistance ble hyppig observert i menneskelige kreftpasienter, ble noen molekyler som er relatert til metastasering og chemoresistance rapportert [3,4,5]. Derfor fokuserte vi proteiner fra cisplatin bestandig sub-linjer for å oppdage en ny markør som angir aggressiv klinisk atferd i NSCLC.
I denne studien har vi fokusert på Myosin-9 (MYH9), som er økt i cisplatin-resistente underlinjer. Myosin-superfamilien er representert ved femten timer. Myosin-II, den konvensjonelle tohodet myosin som danner bipolare filamenter, er direkte involvert i å regulere cytokinese, cellemotilitet, og cellemorfologi i nonmuscle celler. Virveldyr uttrykker minst to ikke-muskel myosin tungkjede II isoformer, referert til som myosin-IIA og myosin-IIB. Førstnevnte består av to ikke-muskel myosin IIA tunge kjeder (NMMHC-IIA), referert til som Myosin-9 (MYH9), to regulatoriske lette kjeder (RLC), og to vesentlige lette kjeder. Aktiviteten av myosin-IIA er hovedsakelig regulert ved fosforylering av RLC og MYH9 [6]. Fordi MYH9 bidrar til celle polaritet, adhesjon, divisjon, og migrasjon [7,8], har flere studier indikerte at MYH9 spiller en nøkkelrolle i kreft celle migrasjon, invasjon og metastase [9,10]. I humane MCF-7 brystkreftceller, MCF-7/6 celler som har en evne til invasiv viser en høyere ekspresjon av MYH9 enn MCF-A /Z-celler, som er ikke-invasiv. Invasivitet av MCF-7/6 blir redusert enten ved knockdown av MYH9 eller behandling med Blebbistatin, som hemmer funksjonen av MYH9, noe som indikerer involveringen av MYH9 i migrering og invasjon av kreftceller. Overekspresjon av MYH9 er relatert til en dårlig prognose i esophageal [11], blære [12], og magekreft [13]. Maeda et al. rapportert at scenen I pasienter med lunge adenokarsinom mangler uttrykk for enten MYH9 eller vimentin ha en gunstig utfall uten postoperativ adjuvant kjemoterapi [14]. Men forholdet mellom MYH9 ekspresjon og clinicopathological funksjoner, og pasientenes prognoser må ytterligere studert i en lang rekke tilfeller NSCLC ved forskjellige sykdomsstadier såvel som i lunge-skvamøs celle carcinoma. Denne studien undersøkte MYH9 uttrykk i resected NSCLCs inkludert plateepitelkarsinom av patologisk stadium I-III, og analysert sammenhengen med clinicopathological parametere av pasienter og dens prognostisk betydning.
Materialer og metoder
Etikk uttalelser
studiet ble godkjent av etikkomiteen av Kitasato University School of Medicine (B13-53) og fulgte Helsinkideklarasjonen protokollen. Alle pasientene ble kontaktet basert på vedtatte etiske retningslinjer, enige om å delta i denne studien, og kunne nekte oppføring og avslutte deltakelsen når som helst. Alle deltakerne viste seg skriftlig samtykke. Dyr i denne studien ble håndtert i henhold til retningslinjer for dyreforsøk av Kitasato University School of Allied Health Sciences, og alle dyr eksperimentelle protokollen ble godkjent av Komiteen for etikk av dyreforsøk i Kitasato University School of Allied Health Sciences (14- 16).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
LCN1, avledet fra stor celle nevroendokrin kreft, ble etablert i vårt laboratorium [15]. LC-2 /ad og A549, begge stammer fra en lunge adenokarsinom, ble kjøpt fra Riken Bioresource Senter (Ibaraki, Japan) og japansk Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan), henholdsvis. Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma, Steinheim, Tyskland) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; BioWest, Miami, FL, USA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( GIBCO, Auckland, New Zealand). Etter høsting og vasking to ganger med fosfat-bufret saltoppløsning uten divalente ioner (PBS), ble sub-konfluente celler lagret ved -80 ° C i proteomikk analyse og fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemi. LCN1 celler ble også Amex-fast [16] for immunhistokjemisk screening. De SP2 /O-AG14 celler avledet fra en mus myelom ble kjøpt fra Riken Bioresource Center, og ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 1 x 8-azaguanin (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (GIBCO).
Cisplatin-resistente underlinjer
Cisplatin-resistente underlinjer (LCN1-cis, LC-2 /ad-cis, og A549-cis) ble etablert ved dyrking av cellene i 6 måneder med Cisplatin (Randa inj., Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japan), fra en konsentrasjon på 25 og stiger gradvis til 3200 ng /ml. Cisplatin-resistente underlinjer ble stabilt dyrket ved en konsentrasjon på 3200 ng /ml cisplatin i mer enn 12 måneder i vårt laboratorium [17].
Generering av monoklonale antistoffer
LCN1-cis cellelysat ble utarbeidet med PBS (-) ved hjelp av en ultrasonisk homogenisator (UH-50; SMT Company, Tokyo, Japan). Fem uker gamle hunn BALB /c-mus ble immunisert intra-peritonealt med 50 mg våt-vekten av LCN1-cis cellelysat i 500 ml PBS (-) 3 ganger med et to ukers intervall. Antistofftiteret ble testet ved IHC ved bruk av 100 ganger fortynnet serum fra de immuniserte mus som første antistoff på Amex-faste LCN1-cis celler. Tre dager før cellefusjon, dyret med den høyeste titer ble intra-peritonealt forsterket av den samme mengde av LCN1-cis-lysat. Hybridom forberedelse og IHC screening med Amex-faste LCN1-cis celler ble tidligere beskrevet [18,19].
Fastsettelse av antistoff isotype
Et antistoff, betegnet som KU-Lu-6, som membranøs viste farging i LCN1-cis-celler, men ikke i sin moder LCN1-celler, ble plukket opp og ytterligere studert. For å bestemme isotypen av den etablerte KU-Lu-6 antistoff, vi brukte IsoStrip
TM monoklonalt antistoff Isotyping Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunpresipitasjon
immunoprecipitation metode som brukes for Pierce Protein L Agarose (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i denne studien ble i henhold til produsentens anvisninger. I korte trekk, ble LC-2 /ad-cis-celler vasket med PBS (-) og behandlet med radio-immunutfelling assay (RIPA) buffer inneholdende Complete mini-EDTA-fri (Roche Diagnostics) på is i 30 min. Etter sentrifugering ved 15 000 rpm i 30 min ved 4 ° C ble supernatanten oppsamlet. Å bøye det primære antistoff, ble 200 ul av primært antistoff (KU-Lu-6 hybridomsupernatant) og 50 ul protein L agarosekuler suspendert i RIPA-buffer inkuberes med rotasjon ved romtemperatur i 30 min. Etter sentrifugering antistoff-agarose-konjugat og 500 ug totalt, cellulært protein fra LC-2 /ad-cis supernatant ble inkubert med rotasjon ved romtemperatur i 30 min. Immunopresipitatene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 5 min ved 4 ° C. Etter vasking tre ganger med RIPA-buffer, supernatanten ble forsiktig fjernet og pelletene ble resuspendert i 20 ul av 1 x Laemmili buffer. Deretter ble alle prøvene kokt og separert ved SDS-PAGE med 10% polyakrylamid-gel. Etter SDS-PAGE, geler var Zn-farget med Negative Gel Stain MS sett (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner.
Identifikasjon av antigen protein
protein flekk ble skåret ut fra SDS-PAGE-gel og hakket til 1 mm
3, avfarget med avfarging oppløsning (Wako Pure Chemical), dehydrert med 100% (v /v) ACN og tørket under vakuumbetingelser. Tryptisk fordøyelse ble utført med et minimalt volum av fordøyelse oppløsning inneholdende 10 ng /mL av trypsin (Trypsin gull, massespektrometri Grade, Promega Madison, WI, USA) og 25 mM NH4HCO3 i 24 timer ved 37 ° C. Etter inkubering ble spaltet proteinfragmenter eluerte i oppløsning ble oppsamlet, og gelene ble vasket en gang i 5% (v /v) trifluoreddiksyre /50% (v /v) ACN og samles opp i det samme rør.
innsamlede peptidfragmenter ble analysert ved hjelp av autoflex III matriks-assosiert laserdesorpsjon /ionisering-flyvetid /flukttiden massespektrometri (MALDI-TOF /TOF-MS: Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland). En engangs tallerken, flekket α-cyano-4-hydroxycinnamic syre matrise for prøver, og PAC Peptide Calibstandard for kalibrering (Prespotted AnchorChip 96 satt for Proteomics, Bruker Daltonik GmbH) ble anvendt. Peptid masse fingeravtrykk (PMF) ble målt, og deretter et par topper hentet fra PMF ble videre målt for deres tandem massespektra som forelder massene. MASCOT (https://www.matrixscience.com) ved hjelp av Menneskelig IPI 3,85 database (89,952 sekvenser; 36,291,020 rester), ble anvendt for å bestemme proteiner fra PMF og tandem masse data
På grunn av at KU-arma. 6 antistoff fungerer ikke for immunblotting, antistoff absorpsjon test for bekreftelse av antigen ved hjelp av renset syntetisk antigen protein ble utnyttet.
en MYH9 uttrykk klon ble konstruert fra CU013414 klone og pINSOL20 reisemålet vektor med Gateway-systemet ( life Technologies, USA). Proteinsyntese ble utført ved anvendelse av fremgangsmåten i vårt tidligere rapport [20]. Kvantifisering av protein ble beregnet som tettheten av band av CBB farging ved SDS-PAGE som BSA standard protein.
En hundre ul hver av ikke-fortynnet hybridomsupernatanter ble pre-absorbert med 0,12, 0,24, og 0,48 ug av syntetiske MYH9 proteiner, respektivt. Deretter ble de inkubert ved romtemperatur i 2 timer og ved 4 ° C over natten. Etter blir sentrifugert ved 20.000 g i 10 minutter, ble hver supernatant samlet opp og brukt som de første antistoffer.
IHC med absorbert antistoffer ble beskrevet i 2.8.
Pasienter og vevsprøver
totalt 266 sammenhengende NSCLC pasienter som gjennomgikk komplett reseksjon fra januar 2002 til desember 2005 på Kitasato universitetssykehus ble inkludert i denne retrospektive kohortstudie. De som fikk preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling ble ekskludert. Ti prosent av formalinfiksert og parafininnstøpte vev ble behandlet i tre-mikrometer tykke seksjoner og farget med hematoxylin og eosin. Den histologiske diagnosen var basert på kriteriene til Verdens helseorganisasjon /International Association for Study of Lung Cancer klassifisering av lunge og pleural svulster [21]. Hver pasient ble revurdert i henhold til syvende utgaven av TNM klassifikasjon [22]. De kliniske og patologiske parametre i ettertid anmeldt inkluderte alder ved kirurgisk reseksjon, kjønn, røykevaner, histologisk type svulst differensiering, patologisk TNM (p-TNM) og scene, lymfeknutestatus, intratumoral vaskulær invasjon, intratumoral lymfatisk invasjon, pleural invasjon, mottak adjuvant kjemoterapi, levedyktighet status, og overlevelse etter operasjonen. Levedyktighet status ble fastsatt basert på hvorvidt NSCLC relaterte inntraff døden, og overlevelsestiden ble definert som varigheten fra datoen for operasjonen til datoen for død eller slutten av oppfølging. Tilfeller av død av andre årsaker eller tapt for oppfølging ble behandlet som sensurerte tilfeller.
Immunhistokjemisk farging av KU-Lu-6 antistoff
Etter deparaffinizing i xylen, 3-mikrometer tykke seksjoner eller cellepreparater ble rehydrert i en avtagende etanol serie, og deretter behandlet med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. De ble antigen-hentet ved autoklavering i 10 minutter i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) med 0,1% Tween 20. Etter blokkering med 2% normalt svineserum /Tris-buffret saltvann (0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) i 10 minutter, ble de omsatt med ikke-fortynnet supernatant av KU-Lu-6 antistoff over natten ved romtemperatur . Etter å ha blitt renset i Tris-bufret saltvann tre ganger i 5 minutter hver, ble de omsatt med ChemMate ENVISION reagens (DAKO, Glostrup, Danmark) i 30 minutter ved romtemperatur. De ble deretter visualisert med Stabil DAB-løsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og kontra med Mayers hematoksylin. Negative kontroller ble utarbeidet ved å erstatte fosfat-bufret saltvann for KU-Lu-6 antistoff.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
Membranous farging av tumorceller ble ansett å være positivt for KU-Lu -6 antistoff. Den fargeintensitet ble kategorisert i tre grupper: 0 = negativ; 1 = svakt positiv; 2 = sterkt positiv. Tumorceller med en farging score på 2 ble bedømt som positive. Vi har observert i alle tumorceller i prøven, ble en svulst med positiv farging i mer enn 25% av dets tumorceller betraktet som positiv. Alle immunostained seksjonene ble gjennomgått av to etterforskere (K.K. og S.Y.) uten kjennskap til kliniske data. Uharmoniske saker ble gjennomgått og diskutert før en enighet ble nådd.
Statistisk analyse
Kontinuerlige variabler er presentert som median (spredning), mens numeriske variablene er gitt som N (%). Sammenhengene mellom NMIIA uttrykk og clinicopathological parametere ble vurdert med Pearsons χ
2 test eller Fishers eksakte test, som passer. Den kumulative overlevelsen av pasienter ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og betydningen av overlevelse forskjeller mellom MYH9-positive og -negative grupper ble testet ved hjelp av log-rank test. Den 5-årige kumulativ overlevelse sannsynlighet ble estimert ved hjelp av liv tabellen metoden med intervallet lengden satt til 1 måned. Multivariabel analyse ble utført ved å benytte Cox regresjonsmodell for å undersøke samspillet mellom MYH9 uttrykk og andre clinicopathological variabler, og anslå uavhengig prognostisk effekt av MYH9 på overlevelse ved å justere for konfunderende faktorer. Den konvensjonelle
P
-verdi på 0,05 eller mindre ble anvendt for å bestemme nivået av betydning. Alle rapporterte
P
-verdier er tosidig. Analyser ble utført uavhengig ved vårt klinisk forskningssenter ved hjelp av SPSS versjon 17,0 programvare. (SPSS, Chicago, IL, USA)
Resultater
Karakterisering av KU-Lu-6 antistoff
Ved hjelp av Amex-faste LCN1-cis celler for immunhistokjemisk screening, vi endelig valgt en klone utpekt som KU-Lu-6, som viste membran flekker på LCN1-cis celler, men ikke på LCN1 celler (Fig. 1).
Membranous farging ble observert i LCN1-cis-celler, men ikke i LCN1 celler. (Opprinnelig forstørrelse: A, B x 400).
Av immunhistokjemisk farging av KU-Lu-6 antistoff med formalin-fikserte cellelinjer, intensiv farging ble observert i cisplatin-resistente cellelinjer, spesielt i LC2 /ad-cis-celler (fig. 2A).
KU-LU-6 antistoff supernatanten ble pre-absorbert med ingen (A), 0,12 ug (B), 0,24 ug (C), og 0,48 ug (D) av syntetiske MYH9 proteiner. Hver absorbert antistoff ble immunostained med formalinfiksert LC2 /ad-cis celler. Den stainability av KU-Lu-6 antistoff ble gradvis redusert avhengig av konsentrasjonen av MYH9 protein.
For å identifisere antigenet protein gjenkjent av KU-Lu-6 antistoff, utførte vi IP med lysat fra LC-2 /ad-cis celler. Resultatene av IP-er vist i fig. 2. Det antigene protein ble observert ved omtrent 250 kDa i felt 2 (Fig. 3). Ikke noe signal ble observert i felt 3 og 4 som en negativ kontroll (Fig. 3). For å bestemme antigen protein gjenkjent av KU-Lu-6 antistoff, vi skåret ut og samlet stedet fra Zn-farget gel, og fortsatte med i-gel fordøyelsen. Etter analyse ved anvendelse av et MALDI-TOF /TOF MS og MASCOT søk, ble proteinet bestemt som en isoform av myosin-9 (MYH9, tiltredelse: IPI00019502), som er sammensatt av 1,960 aminosyrer med en antatt molekylvekt på 226 532 Da. Den immunoglobulin isotype av KU-Lu-6 antistoff ble bestemt som IgM, k. Av antistoffet absorpsjon forsøk ble stainability av KU-Lu-6 antistoff gradvis redusert, avhengig av konsentrasjonen av MYH9 protein. Den stainability av KU-Lu-6 antistoff ble helt borte med 0,48 ug MYH9 protein (fig 2).
Lane. 1: molekylvekt markør, felt 2: LC-2 /ad-cis lysat kombinert med KU-Lu-6 antistoff, felt 3: LC-2 /ad-cis lysat kombinert med protein L, kjørefelt 4: KU-Lu-6 antistoff kombinert med protein L, spor 5: LC-2 /ad-cis lysat. Kolonnene 3 og 4 er negative kontroller, og spesifikt immunoutfelt produkt med KU-Lu-6 antistoff ble påvist i kolonne 2 (pil).
MYH9 ekspresjon i NSCLC
MYH9 ble uttrykt i membranen og cytoplasma av noen tumorceller. Spesielt ble den fargeintensitet som er merket i cellemembranen. Av de 266 kirurgisk resected NSCLCs, inkludert 203 adenokarsinomer, 51 plateepitelkarsinom, 10 store karsinomer, og 2 adenosquamous cellekreft, positiv MYH9 uttrykk i tumorceller ble observert i 102 tilfeller (38,3%) (Fig. 4). MYH9 ekspresjon ble også observert i fibroblaster i tumoren stroma og i normale bronkiale epitelceller. MYH9 uttrykk ble ikke påvist i de normale alveolære epitelceller. Ingen ekspresjon ble observert i de negative kontrollene
A:. MYH9 ble sterkt uttrykt på membranen av tumorceller i adenokarsinom. B: MYH9 ble sterkt uttrykt i membranen og cytoplasma av tumorceller i squamous cell carcinoma. (Original forstørrelse: A, B × 400)
Clinicopathological kjennetegn ved pasientene
clinicopathological kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell 1. I alt 168 menn og 98 kvinner. ble inkludert, med aldre, fra 34 til 85 år (median, 64 år), hvorav 166 (62,4%) var røykere. Den samlede oppfølging varighet varierte fra 3 til 129 måneder (median, 84 måneder). Totalt 142 pasienter var i live ved slutten av oppfølgingen, 88 pasienter døde av lungekreft, hadde 19 pasienter døde av andre årsaker, og 17 pasienter ble ikke fulgt opp. Årsakene til de 19 ikke-lungekreft dødsfall ble lungebetennelse (n = 11), cholangiocellular karsinom (n = 2), kronisk obstruktiv lungesykdom (n = 1), sepsis (n = 1), cerebral infarkt (n = 1) , akutt hjerteinfarkt (n = 1), magekreft (n = 1), og leukemi (n = 1). Ingen av disse 19 pasientene hadde kirurgi relaterte dødsfall. I 17 tapte til oppfølging pasienter, alle ble ikke fulgt opp på grunn av avvikling av sykehus oppmøte og klarte ikke å bli kontaktet. Oppfølgings varigheten av de 17 pasientene tapt for oppfølging varierte fra 15 til 92 måneder (median, 61 måneder).
Forholdet mellom MYH9 uttrykk og clinicopathological egenskaper
relasjoner mellom MYH9 ekspresjon og clinicopathological karakteristika er oppsummert i tabell 2. MYH9 ekspresjon ble hyppigere detektert i adenokarsinom enn i squamous cell carcinoma og andre histologiske undertyper (
P
= 0,014). MYH9 uttrykk ble også knyttet til dårligere differensiering (
P
= 0,033), intratumoral vaskulær invasjon (
P
= 0,013), og intratumoral lymfatisk invasjon (
P
= 0,045) . Det var ingen signifikant sammenheng mellom MYH9 uttrykk og alder, kjønn, røykevaner, p-TNM stadium, lymfeknutestatus, eller pleural invasjon
Kaplan-Meier estimatet for overlevelse i MYH9-positive og. – negative pasienter
Alle pasienter ble inkludert i overlevelsesanalyse. De overordnede oppfølgingsperioder varierte fra 3 til 129 måneder (median, 84 måneder), og 5-års kumulativ overlevelse sannsynlighet var 70% for alle pasienter. Fordi en kumulativ overlevelse sannsynlighet på 50% ennå ikke var nådd, ble den totale midlere overlevelsestid ikke bestemt. Den 5-årige kumulativ overlevelse sannsynlighet var 66% for MYH9-positive gruppen og 78% for MYH9-negative gruppe. Mens median overlevelse ikke var tilgjengelig, overlevelsen av MYH9-positive gruppen var vesentlig dårligere gruppe (
P
= 0,029) (fig. 5A). I videre analyser, ble MYH9 uttrykk signifikant korrelert med dårligere overlevelse hos pasienter med adenokarsinom (
P
= 0,007) (fig. 5B) eller plateepitelkarsinom (
P
= 0,032) (fig . 5C). Den 5-års overlevelse sannsynlighet var 69 og 85% for MYH9-positive og -negative adenokarsinom pasienter, henholdsvis, og 43 og 74% for MYH9-positive og -negative plateepitelkarsinom pasienter.
(A ) for alle pasienter; (B) for pasienter med adenokarsinom; (C) for pasienter med plateepitelkarsinom, behandle alle andre dødsårsaker og ikke fulgt opp som sensurerte tilfeller. MYH9 uttrykk var signifikant korrelert med dårligere overlevelse i resected NSCLCs.
Effekt av MYH9 uttrykk på overlevelse med uni- og multivariable analyser
Univariable analyse ble utført i henhold til Cox proporsjonal risikomodell for å evaluere effekten av MYH9 ekspresjon og andre clinicopathological faktorer på overlevelse. Resultatene indikerte at histologisk type (HR 1,94; 95% CI, 1.23 til 3.6;
P
= 0,004), p-TNM stadium (HR, 4,58; 95% CI, 2,89 til 7,26;
P
0,001), adjuvant kjemoterapi (HR 2,81, 95% KI, 1,73 til 4,57;
P
0,001), tumor differensiering (HR 2,45; 95% CI, 1.53- 3,92
P
0,001), vaskulær invasjon (HR 5,67, 95% KI, 3,25 til 9,90;
P
0,001), lymfatisk invasjon (HR 4,43 95% CI, 2,65 til 7,40;
P
0,001), pleural invasjon (HR 2,64, 95% KI, 1,73 til 4,03;
P
0,001), og MYH9 uttrykk (HR , 1,57; 95% CI, 1,03 til 2,39;
P
= 0,03) var signifikant prediktor for kreftspesifikk overlevelse. Videre ble MYH9 uttrykk og andre clinicopathlogical variabler inkludert histologisk type p-TNM stadium, adjuvant kjemoterapi, tumor differensiering, vaskulær invasjon, lymfatisk invasjon, og pleural invasjon inngått multivariabel analyse ved hjelp av Cox regresjonsmodellen. Resultatene indikerte at MYH9 uttrykk var en betydelig selvstendig prediktor for et dårligere overlevelse. (HR 2,15, 95% KI, 1,17 til 3,92;
P
= 0,01) (Tabell 3)
diskusjon
i denne studien, MYH9 ble uttrykt i 102 av 266 (38,3%) NSCLCs, og dens uttrykk var signifikant korrelert med adenokarsinom histologi, dårligere differensiering, og intratumoral vaskulær og lymfatisk invasjon. I samsvar med tidligere rapporter om esophageal [11], blære [12] og magekreft [13], denne studien viste at MYH9 uttrykk er en uavhengig prognostisk faktor og assosiert med dårligere prognose for pasienter med resected NSCLCs. Selv om Maeda et al. rapportert at pasienter med stadium I lunge adenokarsinom mangler uttrykk for enten MYH9 eller vimentin viser et positivt resultat uten postoperativ adjuvant kjemoterapi [14], denne studien viste at MYH9 uttrykk er en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse hos pasienter med resected NSCLCs inkludert patologisk stadium i-III og lunge squamous cell carcinoma.
i den foreliggende undersøkelse, MYH9 farging ble påvist i både membranen og cytoplasma av noen tumorceller, selv om fargeintensitet var markert sterkere i cellemembranen. I MDA-MB-231 brystcancerceller spredning på fibronectin, er MYH9 observert ved den marginale spredning lamellær region av cellene [9]. Fordi MYH9 er rapportert å bidra til celle polaritet og lamellipodia på celle periferien og ledende kant, sterk fargeintensitet på cellemembranen kan gjenspeile MYH9 aktivitet i kreftcelle migrering og invasjon.
Lokal mikro invasjon, så som intratumoral lymphovascular gjennomtrengning, er et viktig skritt i den tidlige fasen av tumormetastaser. MYH9 bidrar til cellemigrering som er påkrevet for invasjon av den lokale mikromiljøet.
In vitro
, flere studier har rapportert at MYH9-utarmet celler viste defekt migrasjon [10,11]. Videre er lamellipodia dannelse ved den fremre kanten av cellen som er nødvendig for migrasjon [23], og en slik formasjon er kontrollert av Rac, WAVE kompleks, og Arp2 /3complex [24]. Nylig, Morimura et al. rapporterte at MYH9 er også nødvendig for lamellipodia formasjon ved å binde seg til WAVE2 [25]. Dermed kan MYH9 uttrykk være forbundet med oppkjøpet av migrasjon og invasjon egenskapene til kreftceller, som senere resulterer i svært intratumoral lymphovascular invasjon, og dårligere prognoser i denne studien.
I denne studien, MYH9 uttrykk var signifikant korrelert med dårligere tumor differensiering. Dårlig differensiert karsinom er preget av tilrettelegging av cytokinese. I cytokinese, celler bygge en kontraktile ring som innsnevrer plasmamembranen til å generere to dattercellene er forbundet med en cytoplasmisk bro. MYH9 bidrar til sammentrekning av kontraktile ring og spiller en nøkkelrolle i cytokinese [26,27]. Videre er en tidligere studie rapportert at behandling med Blebbistatin, en inhibitor av MYH9, fører til svikt i cytokinese [28]. Dermed er det ikke overraskende at MYH9 uttrykket er assosiert med dårligere tumor differensiering i denne studien.
Konklusjon
Vi har rapportert at MYH9 er uttrykt i en undergruppe av NSCLC, og dens uttrykk er relatert til adenokarsinom histologi, dårligere differensiering, intratumoral vaskulær invasjon, intratumoral lymfatisk invasjon, og en dårligere prognose. MYH9 uttrykk er en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse hos pasienter med resected NSCLCs, selv om dens prognostisk betydning fremdeles krever bekreftelse med større pasientpopulasjoner.
