Abstract
Interleukin-11 (IL-11) er en pleiotropisk cytokin godkjent av FDA mot kjemoterapi-indusert trombocytopeni. Fra et kombinatorisk utvalg i en kreftpasient, isolerte vi en IL-11-lignende peptid-kartlegging for å domene I av IL-11 (sekvens CGRRAGGSC). Selv om dette motivet har ligand egenskaper, er det ikke i løpet av de tidligere karakteriserte samvirkende områder. Her design vi og validere in-tandem bindingsanalyser, seterettet mutagenese og NMR-spektroskopi for å vise (i) peptid etterligner en reseptor-bindingssete innen IL-11, (ii) binding av CGRRAGGSC til IL-11Rα er funksjonelt relevant, (iii) Arg
4 og Ser
8 er nøkkelrester som medierer interaksjonen, og (iv) den IL-11-lignende motiv induserer celleproliferasjon gjennom STAT3 aktivering. Disse strukturelle og funksjonelle resultater avdekke en ennå ukjent reseptor-bindingssete i human IL-11. Gitt at IL-11Rα er foreslått som et mål i kreft hos mennesker, våre resultater gi ledetråder for rasjonell utforming av målrettede medikamenter
Citation. Cardo-Vila M, Zurita AJ, Giordano RJ, Sun J, Rangel R, Guzman-Rojas L, et al. (2008) en ligand peptidmotiv Valgt fra en kreftpasient er en reseptor-Samhandle Side innen human interleukin-11. PLoS ONE 3 (10): e3452. doi: 10,1371 /journal.pone.0003452
Redaktør: Maxim Antopolsky, Universitetet i Helsinki, Finland
mottatt: 23 juli 2008; Godkjent: 24 september 2008; Publisert: 20 oktober 2008
Copyright: © 2008 Cardo-Vila et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Specialized Program i fremragende forskning (SPORE) av National Cancer Institute (til WA og RP), fra US Department of Defense (til MGK, WA, og RP), og med priser fra Prostate Cancer Foundation , Marcus Foundation og Gillson-Longenbaugh Foundation (til WA og RP). MCV fått et postdoktorstipend fra Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. AJZ fått et postdoktorstipend fra Instituto de Salud Carlos III (Spania); RR er en Scholar fra Odyssey Program for The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. CDA fikk predoctoral fellesskap fra National Research Council (Brasil). FCLA og APV fått støtte fra Rio de Janeiro Forskning Support Foundation og National Research Council (Brasil). Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
fagdisplay muliggjør identifisering av vev-spesifikk eller angiogenese-relaterte molekylære signaturer på blodkar og derved gjør det mulig ligand-dirigert levering [1] – [10]. Tidligere har vi vist, gjennom direkte screening av et kombinatorisk bibliotek peptid i en kreftpasient, at de selektive målsøkende peptider lokaliserte ikke-tilfeldig til bestemte organer [1]; vi også identifisert en syklisk peptid (sekvens CGRRAGGSC) rettet mot prostata blodkar og prostatakreft som interleukin-11 (IL-11) etterligne [1], [2]. I en annen linje med etterforskning, Kang et al. [11] foreslått en sentral rolle for IL-11 reaksjonsveien i den genetiske utviklingen av metastatiske maligne tumorer i ben. Aktivering av medlemmer av signaltransduksjon og aktivator av transkripsjon (STAT) familien, spesielt STAT3, ble avslørt nedstrøms som en konsekvens av bindingen av IL-11 til den tilsvarende reseptor [12].
Selv om IL- 11 ble først karakterisert som et cytokin med trombopoietisk aktivitet, ble det senere funnet å ha pleiotrope effekter i flere vev [13]. Rekombinant IL-11 er en FDA-godkjente stoffet (oprelvekin; Neumega®) brukt mot kjemoterapi-indusert trombocytopeni (https://www.fda.gov/cder/biologics/products/opregen112597.htm) [14]. Sammen med mer enn 10 andre fire-heliksbunt cytokiner, inkludert interleukin-6 (IL-6), leukemi inhibitorisk faktor (LIF), ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), onkostatin-M (OSM), og cardiotrophin-1 (CT- 1), representerer IL-11 til gp130 eller IL-6-typen [15], [16]. Disse cytokiner framprovosere reaksjoner ved montering av oligomeric signalkomplekser som inneholder trans reseptoren gp130. Strukturen av IL-11 har vært gjenstand for molekylær modellering og mutagenese-undersøkelser [17] – [21]. Forskning har vist at IL-11 inneholder tre kjente reseptor-bindingsseter (I, II og III). Side I av IL-11 binder seg til det cytokin-reseptoren homologi region (CHR) i domener 2 og 3 (D2-D3) av IL-11Rα, mens områdene II og III samvirke med to separate områder av gp130 homodimer: CHR ( D2-D3, site II) og den Ig-lignende domene (D1, reiser III) [22] – [24]. Imidlertid er ingen direkte strukturanalyse tilgjengelige for enten IL-11 eller signaleringskomplekset. Faktisk, mens røntgenstruktur av IL-6-reseptor-komplekset som et heksa IL-6 /IL-6Rα /gp130 ternære komplekset har blitt innført som en modell for IL-11 [25] – [27], nøyaktigheten av denne ekstrapolering har faktisk blitt utfordret fordi IL-11 og IL-6 andel ingen signifikant likhet i primærstruktur og samhandle med forskjellige reseptorer antagelig gjennom ulike mekanismer [28]. En ligand-indusert overgang fra en aktiv tetramere kompleks (inkludert gp130 en dimer) til en inaktiv heksa komplekset har blitt foreslått for IL-11 [28], [29]. Respons på IL-11 er begrenset til celler som uttrykker IL-11Rα i tillegg til gp130. Analogt med IL-6-reseptor α (IL-6Rα) og IL-6, er det blitt postulert at IL-11Rα «viser» IL-11 til gp130, som er rekruttert som en homodimer og fører til genereringen av en så alarmert høy affinitet IL-11 reseptor kompleks. Denne aktive komplekset er den innledende trinn i aktiveringen av Janus kinase (JAK) /tyk-tyrosin-kinaser, som i sin tur fosforylerer tyrosin-rester i den cytoplasmatiske region av gp130; disse senere tjene som docking sider for medlemmer av STAT familien av transkripsjonsfaktorer, f.eks STAT3 [12], [13], [17].
Selv om in vivo-valgt homing motiv CGRRAGGSC hadde visst ligand- spesifikke attributter [1], [2], tilsvarende plassering i mors cytokin er ikke i et etablert samspill området mellom IL-11 og IL-11Rα [17] – [28]. Vi hypotese og senere bekreftet at dette peptidmotiv fungerer som en ny bindingssetet innen IL-11. Tandem seterettet mutagenese, bindingsanalyser, kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, og signaltransduksjon analyse sterkt støtter konklusjonen om at dette peptid sekvensen er faktisk en tidligere ikke reseptor-samspill stedet innen human IL-11.
resultatene
Valgte sekvens-binding til IL-11-reseptor-komplekset er spesifikk og omfatter ikke gp130
Vi har tidligere etablert at fagen viser motivet CGRRAGGSC spesifikt interagerer med IL-11Rα; denne interaksjonen ble inhibert ved hjelp av rekombinant IL-11 på en konsentrasjonsavhengig måte, men ikke ved IL-1β [1], [2]. Fordi den funksjonelle IL-11-reseptor-komplekset synes å være en multi-heterodimer sammensatt av IL-11, IL-11Rα, og gp130 [15], vi først evaluert hvorvidt den valgte IL-11-lignende motiv [1], [2] ville binde seg til IL-11Rα, til gp130, eller til begge deler. For dette formål vi belagte plater med følgende proteiner: IL-11Rα, gp130, eller leptinreseptoren (et ubeslektet gp130 partner). Bovint serumalbumin (BSA) tjente som en negativ kontroll for bindingsanalysen (figur 1A). CGRRAGGSC-fag ble ikke bundet over bakgrunnsnivå til immobilisert gp130, i forhold til sin signifikant binding til human IL-11Rα (figur 1A), data som indikerer ingen fag-binding til gp130 alene. Videre CGRRAGGSC-fag-binding til leptinreseptoren eller til BSA ble undistinguishable seg fra ikke-målrettet kontroll fagen. Disse resultatene fastslår at CGRRAGGSC peptidet bare bindes til IL-11Rα i reseptorkomplekset når de enkelte underenheter blir analysert. Vi viste ved at CGRRAGGSC-fag-binding til IL-11Rα blir mediert av IL-11-lignende motiv, fordi syntetisk CGRRAGGSC inhiberte bindingen av beslektet fagen på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 1B).
( A) CGRRAGGSC-fag binding til de individuelle reseptor komponenter av IL-11-reseptorkomplekset: IL-11Rα og gp130. Leptin receptor og BSA tjente som negative kontroller for binding. (B) konsentrasjonsavhengig binding inhibering av CGRRAGGSC-fag til IL-11Rα av den beslektede syntetiske peptid. Stolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
NMR-spektroskopi av den målrettede peptid-reseptorinteraksjon
NMR er en spesielt egnet metode for å studere middels til lavt affinitetsbinding [30], [31], noe som ofte er tilfellet for interaksjonen mellom peptid-ligander som er identifisert av fagdisplay (slik som CGRRAGGSC peptid og IL-11Rα). Ved å måle små forandringer i NMR-parameterne for den ligand (for eksempel kjemisk skift og relaksasjonstider) kan man undersøke bindings hendelser som oppstår på uM å mM konsentrasjonsområdet på grunn av den raske utveksling mellom den bundne konformasjon og fri form av liganden. Når den raske utveksling regimentet er nådd et overskudd av ligand (mM) over reseptor (pM) kan anvendes for målingene. Rask utveksling tilstand er ofte tilstede i bindingsstudier som involverer peptider valgt fra fag banner biblioteker på grunn av deres iboende middels til lav affinitet intervallet [30] – [32]. Derfor, for å karakterisere den strukturelle basis av interaksjonen mellom peptidet CGRRAGGSC og IL-11Rα, søkte vi NMR-spektroskopi [30], [32]. Vi begynte med å analysere den strukturelle oppførsel av gratis syntetisk peptid CGRRAGGSC av proton NMR. Den en-dimensjonale (1D-
1H-NMR) spektrum som vises brede linjer ved 25 ° C (figur S1A) indikerer nærværet av konformasjonell veksling mellom flere CGRRAGGSC konformere. Selv om resonanslinje ble mer definert ved 5 ° C, konformasjonell utveksling vedvarte ved lave temperaturer (figur S1A); ja, er forekomsten av flere konformasjoner ikke uvanlig i denne innstillingen og har ikke utelukket studiet av ligand-reseptor interaksjoner [30]. I tilfelle av CGRRAGGSC peptid nesten alle resonanser i spektrene ble entydig tilordnet de enkelte rester av peptidet basert på to-dimensjonale proton-spektra (2D
1H-NMR) TOCSY og NOESY (tabell S1 og S2).
etter å ha preget den strukturelle oppførsel av CGRRAGGSC peptid i løsning og tildelt sine resonanser i NMR spektra, vi neste satt opp bindingsanalyser [30] for å få innsikt i grunnlaget for reseptor binding til liganden peptid. Spekteret av fri CGRRAGGSC ble sammenlignet med de av CGRRAGGSC i nærvær av IL-11Rα (under et molart overskudd av peptidet i ~16-, 33- og 66-ganger), og forandringer i kjemisk skift (Δδ) ble analysert (figur 2A). Selv om den nøyaktige kartlegging av rester i CGRRAGGSC ikke kunne oppnås fra 1D-
1 H-NMR-spektrene på grunn av reseptor peak overlapping, samspillet mellom CGRRAGGSC og IL-11Rα resulterte i kjemiske skift endringer og nye ringsystemer (Tall 2A C). Slike endringer er en indikasjon på binding og antyder at multiple rester bidrar til interaksjonen. Dessuten, bindingen likevekt var avhengig av peptidkonsentrasjon og i samsvar med en rask kursen (ps strekker) på grunn av resonansen av frie og bundne former av peptidet ble påvist som et snitt av bånd (figur 2A).
( A) Virkning av den CGRRAGGSC peptidkonsentrasjonen ved avventende til IL-11Rα. Amid region av 1D-
1H-NMR-spektra av økende molare konsentrasjoner av peptidet CGRRAGGSC binding til IL-11Rα (6 uM) får (blå). CGRRAGGSC peptid alene (400 uM) og spekteret av IL-11Rα alene er også vist (i rødt og sort, henholdsvis). Utseendet av arginin sidekjede resonanser (ikke sett i spekteret for det peptid alene) indikeres (*). (B) Kjemisk skift endringer indusert på CGRRAGGSC resonanser ved binding til IL-11Rα. Den 2D
1H-NMR-spektra av TOCSY CGRRAGGSC (400 uM), enten alene (sort) eller i nærvær av 6 pM IL-11Rα (rød) er vist. Enkelt-ledet og tohodet piler indikerer kjemiske endringer skift og utseendet av nye spin-systemer, henholdsvis. (C) Sammensetning av amid region av 1D-
1H-NMR og tilsvarende 2D-
1H-NMR TOCSY spektrene til CGRRAGGSC peptidet ved 5 ° C (til venstre), ved 25 ° C (i midten) og ved 25 ° C i nærvær av IL-11Rα (til høyre). De sirkler med stiplede linjer og pilen indikerer arginin resonanser.
For å beregne endringene enkelte kjemiske skift (Δδ) indusert av IL-11Rα på hver av hydrogenatomene i CGRRAGGSC, sammenlignet vi den enkelte 2D –
1H-NMR-spektra TOCSY erholdt i fravær og nærvær av IL-11Rα (molart overskudd peptid ~66-fold) (figur 2B og tabell 1). Disse spektra ble også brukt for analyse av nye ringsystemer (figurene 2B og 2C). I 2D
1H-NMR TOCSY reseptoren NMR-signalet ble filtrert i løpet av 80 ms spinn lås, noe som resulterer i en renere analyse av kjemisk skift forstyrrelse. Vi har observert at de fleste individuelle resonanser i CGRRAGGSC viste signifikant Δδ ved binding til IL-11Rα (figur 2B og tabell 1), et resultat som indikerer at nesten alle aminosyrerester i CGRRAGGSC delta i binding til reseptoren på en direkte eller indirekte måte. Den mest fremtredende Δδ ( 10 Hz) som er involvert i α-hydrogenatomer i Gly
7 og av Cys-rester (som ikke kan bli entydig tilordnet, og her er referert til som Cys
1/9). Men Δδ 5 Hz for rester Cys
1, Gly
2, Gly
6, Ser
8, og Cys
9 var også bemerkelsesverdig. De nye spin-systemer observert i 1D-
1 H-NMR spektra (figur 2A) også dukket opp i TOCSY spektra, og ble tildelt Cys
1/9, Arg
3/4, og Ala
5 (figur 2B, tohodet piler). Disse nye ringsystem tilordnes til peptidet regionen som gjennomgår en komplisert konformasjonell likevekt i fri tilstand. Dette resultatet tyder på at, ved binding til IL-11Rα, blir segmentet Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala i CGRRAGGSC konformasjonelt begrenset, noe som resulterer i en forsterkning-av-struktur og tilsvarende tap-av-frihet for CGRRAGGSC i bundet tilstand. Konsekvent, ble lignende resultater observert ved sammenligning av 1D-
1H-NMR og 2D
1H-NMR-spektra av TOCSY CGRRAGGSC ved 5 ° C og 25 ° C (figur 2C). Arg
3, Arg
4 og Ala
5 resonanser kunne bare påvises i spektrene ved 5 ° C (figur 2C, venstre panel), men ikke i spektrene ved 25 ° C (figur 2C, midtre panel), igjen en indikasjon på at konformasjonelle variasjon spiller en rolle ved detektering av slike ringsystemer som har nylig blitt rapportert [31], [33] – [35]. Imidlertid, ved binding til IL-11Rα, resonanser svarende til Arg
3, Arg
4 og Ala
5 ble også observert i spektrene ved 25 ° C (figur 2C, høyre panel).
til sammen våre NMR-data tyder på at konformasjonelle variasjon spiller en strukturell rolle i CGRRAGGSC peptid interaksjon med IL-11Rα og antyder at: (i) de fleste rester i CGRRAGGSC endre sin konformasjon ved binding til IL-11Rα, ( ii) Cys-ss-Cys-Gly-Arg-Arg-Ala domene av peptidet gjennomgår en reseptor-avhengig gain-of-struktur, (iii) motivet Gly-Gly-Ser-Cys-P-Cys omfatter en kandidat stedet for direkte interaksjon av peptidet med IL-11Rα, og (iv) at rester Gly
7 og Tjen
8, i samråd med mutasjonsstudier (beskrevet nedenfor), er også relevant for binding.
Funksjonell analyse av villtype og seterettet IL-11 mutanter
i tidligere arbeid, har andre forskere produsert rekombinante proteiner som inneholder punktmutasjoner å avduke funksjonelle egenskaper av den innfødte IL-11; spesielt, har punktmutasjoner på nettstedet som inneholder CGRRAGGSC sekvensen ikke blitt rapportert [17] – [21]. Følgelig, for ytterligere å demonstrere at rester 112-117 representerer et protein-veksel stedet, vi først forsøkte å generere en serie av rekombinante seterettet alanin-scan-mutanter av motivet RRAGGS innenfor humant IL-11.
betraktninger DNA-sekvensering (data ikke vist) og SDS-PAGE-analyse (figur 3A) viste at villtype og mutante IL-11 rekombinante proteiner ble produsert med den forventede molekylvekt, et antall av IL-11 mutanter presentert sterisk hindring og misfolding aberrances . En slik teknisk iboende begrensning i alle mutasjons studium fremgår av mangelen på epitopen tilgjengeligheten observert i studier med anti-IL11 antistoff (figur 3B og data ikke vist). Til tross for disse potensielle problemene, siden vi brukte ELISA for å bedømme egenskapene til IL-11-punkts-mutanter (rester 112-117) for deres evne til å binde til IL-11Rα. Mutasjon av restene Arg
113 (R113A), Gly
115 (G115A), og Ser
117 (S117A) markert redusert binding av IL-11 til reseptoren, i forhold til villtypesekvensen ( 86, 71, og 86% binding inhibering, henholdsvis), mens mutasjonen av rester Arg
112 (R112A) og Gly
116 (G116A) produserte bare en moderat effekt (43 og 29% binding inhibering, henholdsvis) ( Figur 3C). Disse data indikerer at mesteparten av restene innen RRAGGS motivet delta i binding til IL-11Rα; imidlertid, Gly
115 og Ser
117 er sannsynlig nøkkelrester som medierer den ligand-reseptor-interaksjon. Dermed, i samsvar med vår arbeidshypotese, de alanin-scan mutanter gjorde viser redusert, om enn bestemt, binding til det tilsvarende reseptor, IL-11Rα (Figur 3C).
(A) Purified rekombinante proteiner ble analysert ved Coomassie farging. (B) Western blot analyser med polyklonalt anti-IL-11 og anti-GST-antistoffer. (C) Rekombinant GST fusjonsproteiner (alanin-scan-mutanter av residuer 112-117 av IL-11, villtype-IL-11, GST alene, eller rhIL-11) ble belagt i tre eksemplarer natten over og inkubert med IL-11Rα. Binding ble påvist med anti-Fc-antistoff. Stolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
rolle Residuet Arg
113 er noe problematisk å evaluere fra ELISA, fordi denne mutasjonen påvirket reaktiviteten av anti-IL -11 antistoffer. For å utelukke muligheten for at den observerte reduksjon i bindingen av IL-11-mutanter til IL-11Rα var sekundært til uriktig folding av full-lengde protein og /eller sterisk hindring, har vi utviklet en alternativ ligand-reseptor-assay basert på område- mutagenese av peptid-målrettet fag. Single-rest alanin-scanning mutagenese av CGRRAGGSC fag ble produsert og binding av hvert fag til immobilisert IL-11Rα ble testet i et funksjonelt assay (tabell 2). Mutasjon av Arg
4, Gly
7 og Ser
8 rester i CGRRAGGSC fagen avskaffet binding til reseptoren (tabell 2), mens mutasjonen av rester Arg
3 og Gly
6 ikke gjorde inhibere binding men redusert CGRRAGGSC-reseptor-interaksjon med over 70%. Disse dataene er i samsvar med NMR og IL-11 seterettet mutagenese studier og indikerer at de fleste rester innenfor RRAGGS motiv delta i samspill med IL-11Rα. Videre er data identifisere en sentral rolle for Ser
8 rest i CGRRAGGSC (svarende til Ser
117 av IL-11) i binding til reseptoren, og tyder på at både glycin-rester er viktige for interaksjon med IL- 11Rα. I konklusjonen, restene 112-117 i human IL-11 utgjør et strukturelt og funksjonelt nettsted for interaksjonen av proteinet med sin reseptor.
Den syntetiske peptid CGRRAGGSC induserer celleproliferasjon
Etter å ha vist at motivet RRAGGS representerer et aktuelt område i humant IL-11, fortsatte vi å bestemme hvorvidt den tilsvarende syntetiske peptid er biologisk aktivt. IL-11 induserer konsentrasjonsavhengig proliferasjon når inkubert med humane TF-1-leukemiceller ([36], og data ikke vist). Således vi evaluert hvorvidt de tilsvarende syntetiske CGRRAGGSC peptid etterligner IL-11 og dens stimulering av disse celler ved binding til IL-11Rα. Vi først utsatt TF-1 celler til CGRRAGGSC peptidet i nærvær eller fravær av enten IL-11 eller GM-CSF (positiv kontroll) under forutbestemte tilstander hvor IL-11 induserer optimal celleproliferasjon. Løselig CGRRAGGSC peptid induserte en kraftig vekst-stimulerende effekt på TF-1-celler, alene og i nærvær av IL-11 (figur 4A, venstre panel) eller GM-CSF (data ikke vist), mens ingen virkning ble observert på kontroll ( ikke-IL-11Rα-uttrykkende) celler (figur 4A, til høyre panel) [2]. Dette peptid-indusert proliferativ effekt var mer uttalt for CGRRAGGSC pluss IL-11 eller CGRRAGGSC alene enn for CGRRAGGSC pluss-GM-CSF (data ikke vist); et urelatert syklisk kontroll peptidet viste ikke påviselige effekter av seg selv eller i kombinasjon med IL-11. Neste, for å vurdere om CGRRAGGSC-indusert spredning er avhengig av celleoverflaten IL-11Rα, brukte vi den tilsvarende løselige reseptor, sIL-11Rα, som en molekylær lokkedue for peptid binding. Celleformering som induseres av CGRRAGGSC var lavere i nærvær av sIL-11Rα (t-test, P 0,005), men ikke i nærvær av en styre oppløselig reseptor (figur 4B). Av notatet, ble mindre hemming observert når cellene ble dyrket med CGRRAGGSC, sIL-11Rα og IL-11, data som indikerer at CGRRAGGSC kan samhandle med den komplekse IL-11-Sil-11Rα (figur 4B). Disse resultater viser at det syntetiske peptidet CGRRAGGSC kan indusere celleproliferasjon av seg selv, muligens virker som et IL-11Rα-stimulerende ligand.
(A) Konsentrasjon avhengig proliferative respons til CGRRAGGSC er vist på IL-11Rα-uttrykk humane TF-1-leukemiceller i fravær eller nærvær av IL-11 (venstre panel). Ingen respons er observert på ikke-IL-11Rα-uttrykker kontrollceller (panel høyre). (B) Oppløselig IL-11Rα-mediert inhibisjon av den proliferative virkning indusert ved 150 uM CGRRAGGSC peptid (og av IL-11). * T-test, p 0,005. Barer representerer gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
STAT3 fosforylering formidler CGRRAGGSC celleproliferering
IL-11 binding til IL-11Rα og glykoprotein 130 (gp130) medierer signaltransduksjon gjennom STAT3 aktivering; Derfor, ved evaluert vi hvorvidt den CGRRAGGSC peptidet kan stimulere celleproliferasjon ved aktivering av samme bane. For dette formål, undersøkte vi ligand-mediert aktivering STAT3 i serum-sultet TF-1-celler inkubert i nærvær av IL-11, CGRRAGGSC peptid, eller ikke-relaterte cykliske kontroll peptid. Til tross for serum sult, ble svak STAT3 (P-Tyr
705) baseline aktivering påvist i ikke-stimulerte TF-1-celler (figur 5). Tyve minutter inkubasjon med enten CGRRAGGSC eller IL-11 (positiv kontroll) førte til STAT3 fosforylering (figur 5A), som økte på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 5B). Lignende effekter ble observert for IL-11 i kombinasjon med CGRRAGGSC eller et ubeslektet cyklisk peptid (men ikke for kontroll peptid alene) (figur 5A). Disse data avdekke en potensiell molekylære mekanismen bak CGRRAGGSC-indusert spredning via aktivering av IL-11 reseptor kompleks gjennom STAT3 og indikerer at dette området i løpet av IL-11 er funksjonelt aktiv for binding og signaloverføring.
(A) proliferasjonen av humane TF-1-leukemiceller indusert ved CGRRAGGSC er forbundet med STAT3 fosforylering, som målt med et anti-STAT3-P-Tyr
705 antistoff. (B) CGRRAGGSC peptid-indusert aktivering av STAT3 er konsentrasjonsavhengig. Ingen effekt er observert med en kontroll peptid. For å unngå inter-eksperimentell variasjon, ble lysatet delt i to: en halvdel av lysatet ble immunoblottet med et anti-STAT3-P-Tyr
705-antistoff, mens den andre halvparten tjente til å bestemme den totale mengde av STAT3 (så et surrogat for lasting protein) med et spesifikt anti-STAT3 antistoff. Legg merke til at de kommersielle HeLa celleekstrakter tjener som kontroller vise bare α-STAT3 band.
Diskusjoner
Gjennom direkte valg av peptid bibliotekene i pasienter [1], [37], [38], ble det isolert en ligand peptid som etterligner IL-11 fra prostata vaskulaturen [1] og foreslått IL-11Rα som et mål i løpet av utviklingen av prostatakreft [2]. Her har vi valgt å utforske de strukturelle og funksjonelle egenskaper av denne antatte protein-protein interaksjon fordi de for tiden kjente bindingsseter i humant IL-11 [22] – [24] omfatter ikke det valgte peptid-sekvens innenfor det native proteinet (figur 6) .
Pilspisser indikere humant IL-11 rester spådd (gjennom seterettet mutagenese) for å være ligand-reseptor bindingssteder; solide farger angir rester som er kritiske for binding [17] – [21]. Rester 112-117 svarende til IL-11-lignende motiv [1], [2] som er beskrevet i dette arbeidet er merket med gult. Den grunnleggende ordningen med humant IL-11, som vist her, har blitt modifisert fra referanse [47].
Vi brukte komplementære strategier som seterettet mutagenese og NMR-baserte studier for å fastslå at alle seks rester av RRAGGS motivet er sannsynligvis nødvendig for binding til IL-11Rα. For NMR-analyse ikke entydig indikerer hvilken av de argininrester (Arg
3 eller Arg
4) er med i reseptorbinding, ble studier basert på målrettet fag-alanin-skanning og IL-11 seterettet mutagenese indikert. I begge tilfeller Arg
4 viste seg å være nøkkelen rest. Alle tre fremgangsmåter har også foreslått at Gly og Ser-rester bidrar til nivået av IL-11Rα binding av ligandene. Faktisk Ser
8 mutasjon avskaffet bindingen av CGRRAGGSC til IL-11Rα; den Δδ observert i Ser
8 indusert ved binding til IL-11Rα bekreftet dette resultatet.
Vi har forsøkt å generere og tolke molekylære modeller av IL-11 basert på høy oppløsning strukturelle studier tilgjengelig for andre gp130 -type cytokiner, inkludert IL-6 [21], [39] og CNTF [21], [40] og videre mutagenese av IL-6, CNTF og LIF [41] – [43]. I tilfelle av bindingssetet for IL-11Rα eller område I, rettet mutagenese av spesifikke rester ved den C-terminale ende av heliks D og den AB sløyfe fastslått at disse regionene delta i reseptorbinding og cytokin-mediert bioaktivitet [17] – [ ,,,0],21], analogt med IL-6 [39]. Begge steder er plassert nær hverandre i disse modellene og oppta den C-terminale ende av den fire-heliksbunt struktur, som ligger på motsatt side av sløyfen BC. Lignende strukturelle og mutagenese baserte studier på gp130-type cytokiner (Vil-6, CNTF og LIF) impliserte rester innenfor BC sløyfe i reseptor anerkjennelse og bioaktivitet [44] – [46]. Men slike rester var en del av området II eller III området (for interaksjon med gp130 eller gp130 /LIF-reseptoren), og ikke reiser I. Spesielt, krystallstrukturen av IL-6-reseptor-komplekset heksamer viste ingen rolle for IL-6 reseptor bindende for BC løkke, som er vendt mot den N-terminale region av D2 i den andre gp130 molekylet [47]. Våre data viser at CGRRAGGSC er et peptid som etterligner av IL-11, og som sådan er i stand til å gjenkjenne og binde til IL-11Rα for å aktivere cellesignalisering og proliferasjon. Selv om det er generelt antatt at modellen for det cellemembranbundne IL-11-reseptor-komplekset vil være lik den for IL-6 [26], [47], visse strukturelle egenskaper i de komplekse subenhetene kan faktisk avvike betraktelig. For eksempel, la vi merke til at det finnes fire urapporterte leucine-glidelåser i IL-11 (tre av dem strekker seg fra BC sløyfe gjennom helix C, figur 6). De har ingen klar parallell blant de fleste andre gp130-type cytokiner (kun OSM og CT-en ser ut til å inneholde en av slike regioner). Videre er det to IL-11Rα membranbundne isoformer som avviker ved nærvær eller fravær av et cytoplasmatisk domene, mens IL-6Rα har kun én form med en lengre cytoplasmatisk hale [48]. Slike isoformer kan delta i dannelsen av en reseptor-komplekset i motsetning til det som ble observert i IL-6Rα kompleksdannelse. Future detaljert røntgen-krystallografi av IL-11-reseptor-komplekset vil ytterligere belyse disse fine strukturelle trekk.
Funksjonelt, IL-11 mimic peptid CGRRAGGSC viste biologiske effekter mediert av IL-11Rα (konsentrasjonsavhengig stimulering av celleproliferasjon) både i nærvær og i fravær IL-11. Videre CGRRAGGSC-mediert celle proliferasjon i nærvær av sIL-11Rα ble redusert, og i større grad i nærværet av nativt IL-11, men ble ikke påvirket av et ubeslektet kontroll reseptor. Basert på disse funnene, kan man spekulere på et samspill mellom peptid CGRRAGGSC og komplekset IL-11 /IL-11Rα. Faktisk ble det løselige peptid CGRRAGGSC funnet å indusere STAT3 fosforylering på samme måte som IL-11 innfødt cytokin. Disse resultatene har biologisk presedens i andre systemer. Wrighton et al. [49] isolerte peptider som binder seg til og aktiverer erythropoietin receptor (Epor); krystallografisk analyse av reseptor-komplekset viste et peptid som genererte en funksjonell symmetrisk arrangement av Epor [50]. Cwirla et al. [51] valgt peptid-agonister for trombopoietin reseptoren og foreslo en aktiveringsmekanisme. Nyere studier har også vist at orientering og oppholdstiden i ligand-reseptorer må anses for aktivering [52], [53]. Videre peptider valgt for å binde seg til visse reseptorer binde seg til flere steder på reseptoren og aktivisering kan skje gjennom konformasjonsendringer fremfor multimerization [54].
Fra en supra-molekylære synspunkt, er IL-11 reseptor kompleks formasjon etter all sannsynlighet intrikate: liganden cytokin (IL-11) kan være nødvendig å binde seg til en første presentere reseptor-underenheten (IL-11Rα) og deretter rekruttere en dimer av signalerings subenheter (dvs. gp130). Studier av den tilhørende IL-6-reseptor-komplekset støtte den påstand om at på forhånd dannede inaktive dimerer av reseptorsubenheter finnes i cellemembraner [28], [55], [56]. Tidligere rapporter fastslått at gp130-dimerisering ikke er tilstrekkelig for reseptoraktivering og som aktiv conformational justering er nødvendig for en biologisk reaksjon [14], [57] – [59]. Derfor er det mulig at løselig peptid CGRRAGGSC i kompleks med IL-11Rα kan styrke gp130-dimerisering og /eller indusere en signal-kompetent konformasjon.
Styrken i å kombinere ulike funksjonelle analyser (seterettet mutagenese av native proteiner i tandem med ELISA pluss peptid-alanin-skanning i tandem med målrettet fag-bindings-forsøk) med strukturelle studier (NMR-baserte spektroskopi av den peptid-reseptorinteraksjon) kan overvinne noen av begrensningene ved mutasjonsstudier i bestemmelse av bindingssetene av ligand-reseptor-interaksjoner (for eksempel vanskelig gen /protein-ekspresjon, og mutante proteinet misfolding eller sterisk hindring).
Oppsummert har vi vist at (i) den RRAGGS sekvens (svarende til et område innenfor human IL-
