Abstract
DNA-metyltransferase (DNMT) 3a som inneholder
DNMT3A1 Hotell og
DNMT3A2
isoformer har blitt foreslått å spille en avgjørende rolle i kreftutvikling og viste avvikende uttrykk i de fleste kreftformer. Akkumulerte bevis også indikert at enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i DNMT gener ble assosiert med følsomhet for ulike svulster. Vi antok at genetiske varianter i
DNMT3A1
promoter regionen er forbundet med magekreft risiko. Vi valgte tagSNPs fra HapMap database for kineserne og genotypet i en case-control studie for å vurdere samarbeid med magekreft (GC) i en kinesisk befolkning. Vi identifiserte at de funksjonelle tagSNP rs7560488 T C forbundet med en betydelig økt risiko for GC.
In vitro
funksjonell analyse av luciferase reporter analysen og EMSA indikerte at tagSNP rs7560488 T C vesentlig endret transkripsjonen aktivitet av
DNMT3A1
genet via påvirke bindingen av noen transkripsjonsfaktorer, selv om et klart transkripsjonen faktor gjenstår å bli etablert. Sammenlignet med TT homozygote, fag som var TC heterozygoter og CC homozygote utstilt et redusert uttrykk for
DNMT3A1
. Videre stratifisert analyse viste at personer som bærer på TC eller CC genotyper mindre enn 60 år var mer utsatt for GC. Våre resultater tyder på at de genetiske variasjonene i
DNMT3A1
promoter bidra til mottakelighet for GC og også gi en innsikt som tagSNP rs7560488 T C kan være en lovende biomarkør for å forutsi GC genetisk mottakelighet og en verdifull informasjon i GC patogenesen
Citation. Wu H, Zhang K, Gong P, Qiao F, Wang L, Cui H, et al. (2014) A Novel Funksjonell TagSNP Rs7560488 i DNMT3A1 Arrangøren er assosiert med Mottakelighet for magekreft ved Moduler Arrangøren aktivitet. PLoS ONE 9 (3): e92911. doi: 10,1371 /journal.pone.0092911
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 22 desember 2013; Godkjent: 27 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (Grant nr 81171915 og nr 91229107) og Scientific Research and Innovation Plan for universitetsutdannet i Jiangsu-provinsen, Kina (Grant No. CXZZ13_0082). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste ondartede svulster i Kina, spesielt i Jiangsu-provinsen med høy forekomst og dødelighet [1], [2]. Det kan spre seg over hele magen og til andre organer, herunder spiserør, lunger, lymfeknuter eller leveren. Derfor er magekreft den andre ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden [3]. I betraktning av den terapeutiske effektivitet, kan kirurgisk fjerning være en primær kurativ behandling for tidligere stadium av GC pasienter [4]. Dessverre er de fleste magekreftpasienter påvist i avansert stadium, i løpet av hvilken periode tumoren er opererbar lenger. Videre er tilbakefall etter kirurgi annen forferdelig hendelse for en dårlig 5-års overlevelse. Tatt i betraktning de pasienter med fremskreden eller tilbakevendende magekreft, er det ingen tvil om at oppdagelsen av biomarkører og deres anvendelse sammen med tradisjonell diagnose kan være en verdifull indikasjon og et omfattende hjelpe å formulere forebygging og behandling strategi. Imidlertid så langt, noen målbare biomarkører for å forutsi GC gjentakelse har blitt identifisert.
tumorgenese er kjent for å være en flertrinns prosess, noe som er et resultat av ikke bare genetiske endringer, men også epigenetiske endringer [5]. DNA metylering er en viktig form for epigenetisk modifikasjon og spiller en viktig rolle i utvikling, differensiering, genomisk stabilitet, X-inaktivering, og imprinting ved spesifikk regulering av genekspresjon. Den mest vanlig studert epigenetisk fenomen er DNA-metylering, en viktig regulator av kromatin transkripsjon og struktur. Avvikende DNA-metylering mønstre i et genetisk mottagelige bakgrunn kan være assosiert med øket risiko for en serie av humane lidelser [6], [7], inkludert GC [8].
DNMT3A
som inneholder
DNMT3A1 Hotell og
DNMT3A2
er to
de novo
DNA metyltransferaser spiller en avgjørende rolle i fosterutviklingen og avvikende DNA metylering i kreftutvikling. Noen polymorfismer av
DNMT3A
genet kan regulere genuttrykket, påvirke sin enzymatisk aktivitet og kan bidra til faren for kreft. Akkumulerte bevis i molekylær genetikk tilsier at SNP i
DNMT
gener er forbundet med faren for kreft [9], [10]. Nylige fremskritt i genom-wide krets studie (GWAS) også er blitt identifisert nye SNP’er følsomhet for GC, noe som er nyttig for å forstå den underliggende mekanisme av genetiske variasjoner i utviklingen av GC [11] – [14]. Vår tidligere studie fant en funksjonell SNP rs1550117 i
DNMT3A
promoter som kan øke transkripsjonen aktivitet og bidra til genetisk mottakelighet for magekreft i en kinesisk befolkning [15], [16].
GWAS har gitt tallrike SNP’er assosiert med mange kreftformer. I noen tilfeller titalls SNP’er, kalt tagSNPs som representerer SNP’er i en region av genomet med høy koblingsulikevekt kan identifisere genetisk variasjon uten genotyping hver SNP’er i en kromosomal region, så tagSNPs er nyttige i hel-genom SNP assosiasjonsstudier, såsom prostata, bryst, eggstokkene, colorectal og hjernen kreft [17] – [19]. I denne studien, valgte vi en tagSNP rs7560488 fra HapMap database for kinesiske forsøks å vurdere assosiasjoner mellom genetiske varianter i
DNMT3A1
promoter og magekreft risiko i en kinesisk befolkning. Vi identifiserte en risiko-assosiert rs7560488 T . C polymorfisme i
DNMT3A1
promoter, og vårt videre arbeid foreslått at denne varianten kan endre promoter aktivitet og ødelegge bindingsevnen av transkripsjonsfaktorer
materialer og metoder
forsøkspersonene
totalt 405 pasienter med histologisk bekreftet magekreft og 408 kreftfrie kontroller ble rekruttert i denne case-control studie, og egenskapene til de saker og kontroller er beskrevet i Tabell 1. Saker og kontroller ble matchet av alder, kjønn og ble valgt ut fra First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Alle prøvene ble oppnådd med skriftlig samtykke og analysert anonymt. Denne studien ble utført med godkjenning av medisinsk etisk komité Medical School of Southeast University.
TagSNP Utvalg og TF bindingssetet Tippe
Den viktigste hypotesen underliggende dette eksperimentet var at det er en eller flere SNPs i
DNMT3A1
promoter regioner som er forbundet med risiko for magekreft. Avhengig av koblingsulikevekt (LD) struktur ved en bestemt locus, kan tagSNPs være surrogater for mange tusener av andre SNP’er. Vi postulerer at slike tagSNPs er også sannsynlig å merke eventuelle hittil identifisert SNPs i
DNMT3A1
promoter. Derfor har vi valgt ut SNPs i
DNMT3A1
promoter-regionen med en mindre allel frekvens (MAF) i 5% fra både HapMap og dbSNPs databaser. For å gjennomføre potensielt funksjonell tagSNP utvalg, bruker vi data fra International HapMap og fritt nettbaserte tagSNP utvalg verktøy for å velge tagSNPs, og bruke TF-søkealgoritmen (https://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH html) for å forutsi rs7560488 transkripsjonsfaktor (TF) bindingssetet.
DNA Extraction og HRM Genotyping
for å studere
DNMT3A1
promoter tagSNP rs7560488, genomisk DNA ble isolert fra 1 ml av perifert blod fra pasienter og friske individer og ble ekstrahert fra hvite blodlegemer i løpet av en uke etter prøvetaking av proteinase K-fordøyelse, som tidligere beskrevet [20]. TagSNP rs7560488 ble genotypet ved hjelp av dsDNA fargestoff LC Grønn i kombinasjon med høy oppløsning Smelte (HRM) analyse. I detalj ble de PCR-primere designet av den LightScanner primerutforming programvare (Idaho Technology) (forover-primer: 5′-AGGCAGACACAAATGCATAAAT-3 «, Revers primer: 5′-GTCATAAGTACAACCACCACCG-3») som produkt et enkelt 208 bp fragment. Hver PCR-reaksjon ble først utført i et endelig reaksjonsvolum på 10 ul, ved anvendelse av 25 ng genomisk DNA, 0,2 pmol av hver primer og 0,8 ul 2,5 mM dNTP, 1 pl 25 mM MgCl
2, 1 pl 10 x Taq-buffer med (NH4)
2SO
4, 0,4 U Taq DNA Polymerase (Fermentas), 1 mL 1X LC Green Plus (Idaho Technology) og 0,4 mL dimetylsulfoksid (DMSO). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 95 ° C i 5 minutter og deretter underkastet 40 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 72 ° C i 7 min ved hjelp en PTC-200 termosykler (Bio-Rad). PCR-reaksjonene ble overført til 96-brønners plater (Bio-Rad) og analysert på lyset skanner (Idaho Technology). Fluorescens data ble samlet inn over et temperaturområde på 70-97 ° C, og smeltekurve analyse ble utført i henhold til produsentens programvare. HRM kan direkte diskriminere den heterozygote (TC) og homozygot (CC eller TT) genotyper av tagSNP rs7560488 T C gjennom smelte skanning. Etter blanding homozygot DNA med en lik mengde kjente PCR-produkter (for eksempel, CC), det videre skilles mellom CC og TT genotyper. For ytterligere bekreftelse, ble 5% av prøvene fra hver gruppe oppdaget av HRM tilfeldig valgt og utsatt for DNA-sekvensering for å sikre pålitelighet og reproduserbarhet.
Bygging av luciferaserapportørplasmid Plasmid
Å konstruere DNMT3A1 tagSNP rs7560488 reporter plasmid, forsterket vi det 948 bp-fragmentet 25.422.345 til 25.422.345 av
DNMT3A1
promoter-regionen, som inneholder T og C-allel av SNP ved PCR fra genomisk DNA. Primerne anvendt for PCR-amplifikasjoner var: (Forward: 5′-TACGCTAGCATACCAAGTCCCCATTCCCC-3 «, omvendt: 5′-GTATAAGCTTTCGGCTTCTACACCCCTCAC-3»). PCR-produktene ble subklonet inn i NheI og Hindlll restriksjonsseter for pGL3-Basic vektor (Promega, Madison, WI). Vi bekreftet alle rekombinante kloner av DNA-sekvensering.
Transient Transfeksjon og Dual luciferaserapportørplasmid Analyse
Menneskelig magekreft AGS og BGC-823 celler (ATCC) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin-løsning (10 000 U /ml og 10 mg /ml, henholdsvis). AGS og BGC-823 celler (1 x 10
5) ble sådd i 24-brønners kulturplater. Etter 24 timers dyrkning ble AGS, BGC-823-celler transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 0,8 mg av hver konstruerte vektor, enten med T-allel eller C-allelet. Samtidig, 10 ng PRL-TK plasmider (Promega) per brønn ble også transfektert som en intern kontroll for å korrigere transfeksjonseffektivitet. Før det ble cellene sådd ut på 24-brønners plater over natten for å sikre at 90% -95% konfluens på tidspunktet for transfeksjon. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble luciferase-aktivitet målt ved hjelp av Dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) og uttrykt som forholdet mellom ildflueluciferase til Renilla luciferase-aktivitet. Alle celler ble utført i tre eksemplarer med de samme betingelser. Tre uavhengige eksperimenter ble transfeksjon utført, og hver luciferase-analysen ble utført i tre eksemplarer.
Skift elektroforetiske mobilitet analyse (EMSA)
5′-biotinylerte oligonukleotidene 25 bp i lengde ble oppnådd fra Beijing Genomics Institute (BGI). Oligo-sekvensene var rs7560488 [T] Forward: 5′-TAGTCAGACTCATAGAGACAGAAG-3 «, rs7560488 [T] Omvendt: 5′-CTTCTGTCTCTATGAGTCTGACTA-3». rs7560488 [C] Forward: 5′-TAGTCAGACTCACAGAGACAGAAG-3 «, rs7560488 [C] Omvendt: 5′-CTTCTGTCTCTGTGAGTCTGACTA-3». For gløding konsentrert komplementære oligonukleotider ble blandet ved et 1:01 molforhold og inkubert ved 95 ° C i 5 min og deretter gradvis redusert i løpet av timer inntil oligonukleotidene nådde romtemperatur. Glødet oligos ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 10 fmol. Kjerneproteiner ble hentet fra BGC-823 celler ved hjelp av NE-PERTM atom og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Pierce, Rock-ford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den LightShift Chemiluminescent EMSA kit (Pierce /Thermo Fisher Scientific) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, ble bindingsreaksjoner utført som følger: nukleære ekstrakter (8 ug protein) og 1 x bindingsbuffer med 2,5% glycerol, 5 mM MgCl2, 50 ng /ul poly (di-dC), 0,05% NP-40, og 60 fmol biotinmerkede rs7560488 T /rs7560488 C-prober ble inkubert på is i 30 minutter i et volum på 20 ul. For konkurrerende studier ble det nukleære ekstrakter inkubert med ikke-merket oligonukleotid i 30 minutter før tilsetningen av merket oligonukleotid. For en supershift, ble AP-1 antistoff tilsatt (BOOSTER, Kina). Komplekser ble separert ved elektroforese på mors 6% PAGE i 0,5 × TBE buffer på 110 V. Gels ble overført til biodyne B pre-cut modifiserte nylonmembraner (Pierce /Thermo Fisher Scientific) ved hjelp av en Trans-Blot SD semi-tørr overføring celle ( Bio-Rad Laboratories). Membraner ble tverrbundet (UVC-508 UV Cross-linker, Ultra LUM) og signalet ble oppdaget med en kjemiluminescerende deteksjonssystem (Pierce /Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner.
Påvisning av DNMT3A1 Avskrifter ved kvantitativ RT-PCR (Q-PCR)
for ytterligere å påvise sammenhengen mellom DNMT3A1 mRNA nivåer og rs7560488 polymorfisme, de 44 mage kreft vev med ulike genotyper ble utsatt for utvinning av det totale RNA ved hjelp Trizol Reagens ( Invitrogen, Inc.). Den DNMT3A1 mRNA nivået ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR etter revers transkripsjon på en Prism 7900 Real-Time PCR maskin (Applied Biosystems, Foster City, California). β-aktin ble benyttet som intern kvantitativ kontroll for hver prøve. Primerne anvendt for DNMT3A1 forsterkning var F: 5′-GAACAGAAGGAGACCAACATCGAA-3 «og R: 5′-GCGCTTGCTGATGTAGTAGGG-3′; de primere for β-actin ble F: 5»-GACCTCTATGCCAACACAGT-3 «og R: 5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3». Relativ kvantifisering av DNMT3A1 mRNA ble beregnet ved hjelp av to-ΔΔCT metoden, og hver analyse ble gjort i tre eksemplarer.
Statistiske analyser
Alle data ble analysert med
SPSS
versjon 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Pasienter og kontroller ble sammenliknet med Student
t
-test for kontinuerlige variabler og chi-kvadrat (χ2) test for kategoriske variabler. Allel og genotypefrekvensene mellom kontroll og GC-fagene ble oppnådd ved hjelp av chi-kvadrat test, og standard godhet-of-fit test ble brukt for å teste Hardy-Weinberg likevekt. En
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Kjennetegn på forsøkspersonene
De frekvensfordelinger av tilfellene og kontroller er presentert i Tabell 1, var det ingen signifikant forskjell i frekvensfordeling mellom tilfeller og kontrollene (p = 0,243 for alder og p = 0,355 for sex). Gjennomsnittet av pasienter og kontroller var 59,8 år (spredning 20~93 år) og 60,6 år (spredning 25~90 år), henholdsvis. Ingen signifikant forskjell ble funnet i gjennomsnittlig alder og kjønn, noe som tyder på at matching basert på disse to variablene var tilstrekkelig.
Kandidat tagSNP Utvalg og Genotyping
Blant søker SNPs i
DNMT3A1
fokuserte vi på tagSNPs i formidler av
DNMT3A1 Hotell og spådde deres potensial funksjon på bindende transkripsjonsfaktorer som påvirker den kvalitative og kvantitative uttrykk for
DNMT3A1
. Vi har anvendt en LD-baserte tagSNP seleksjonsalgoritmen (R «> 2≥0.80, MAF≥5%), som identifiserte to tagSNPs som representerer felles genetisk variasjon i CHB befolkningen, inkludert kandidaten tagSNPsrs7560488 og rs1550117 som er en funksjonell polymorfisme som endrer mottakelighet i magekreft vi bekreftet før [15], [16]. TFSEARCH algoritme spådd at rs7560488 T skaper et bindingssete for AP-1 (figur 1). Prøvene for genotyping av HRM og sekvensering av ABI henholdsvis 3730 automatisert sequencer (figur 2).
(A) HRM direkte diskriminert av heterozygoter (TC) og homozygote (TT eller CC), homozygot PCR-produkter (TT eller CC) ble målt ved LightScanner etter å ha blitt blandet med en lik mengde av et kjent produkt (TT), som utmerker seg vill homozygot prøvene (TT) fra variant de (CC), som mutasjons homozygoter (CC) ble omdannet i heterozygoter (TC). (B) Stikkprøver fra rs7560488 T C testing ble sekvensert for bekreftelse, indikerer Den svarte pilen nucleotide polymorphism på rs7560488 loci
TagSNP rs7560488 Variant T . C i DNMT3A1 Arrangøren signifikant øker risikoen av GC
genotypen distribusjoner og allelfrekvenser av rs7560488 er presentert i tabell 2. genotypefrekvensene i kontrollene var enige med Hardy-Weinberg modell (P = 0,274). Som vist i tabell 2, genotypefrekvensene av rs7560488 var 68,9%, 27,4% og 3,7% for TT, TC, og CC genotyper blant de tilfellene og 79,9%, 18,4% og 1,7% blant kontrollene, henholdsvis forskjellen mellom de tilfeller og kontroller var statistisk signifikant (P 0,05). I tillegg har t-allelet frekvens var signifikant lavere hos tilfeller enn kontrollene (82,6% mot 89,2%, p = 0,000). I tillegg er den kombinerte TC /CC-genotype frekvens var høyere hos tilfeller enn kontrollene (31,1% mot 20,1%, p = 0,002). Når du tar TT genotype og T-allelet som referanse, har vi funnet at variant genotyper (TC og CC) var assosiert med økt risiko for GC (OR = 1,653, 95% KI = 1,194 til 2,287; p = 0,002). På samme måte, observerte vi også at C-allel frekvensene var statistisk signifikant høyere enn kontrollene (OR = 1,744, 95% CI = 1.310-2.321; p = 0,000). Samlet utgjør disse dataene antydet at TC og CC genotyper ble forbundet med genetisk disposisjon for GC;
DNMT3A
en rs7560488 T allel kan være en antatt beskyttende allel. Det var ingen signifikante forskjellige frekvenser av rs7560488 i GC på aldersgruppe 60 år versus ≤60 år (p = 0,756), og mannlig versus kvinnelig (P = 0,459) (tabell 3)
.
personer Mindre enn 60 år ble mer utsatt for magekreft med tagSNP rs7560488 Variant T C
Alder og kjønn var viktige faktorer i tumorkreft inkludert magekreft. Når analysene ble fordelt etter alder og kjønn av pasientene, fant vi at signifikant sammenheng ble observert, enkeltpersoner bærer TC /CC genotyper ble forbundet med genetisk disposisjon for GC både mannlige og kvinnelige gruppen. Derfor rs7560488 C allele var en betydelig økt risiko faktor sammenlignet med T-allelet (tabell 4). Ytterligere fordeling evaluert foreningen av rs7560488 T C med magekreft i ulike aldre. TC /CC genotyper ble forbundet med genetisk disposisjon for GC i aldersgruppen ≤60 år (OR = 1,794, 95% KI = 1,118 til 2,877; p = 0,015) enn eldre enn 60, på samme måte, vi også observert at C allelfrekvenser var statistisk signifikant høyere enn kontrollene (OR = 1,720, 95% KI = 1.127-2.622; P = 0,011). Resultatene antydet at TC og CC genotyper ble forbundet med genetisk disposisjon for GC, spesielt hos personer ikke mer enn 60 år (tabell 4)
The rs7560488 T . C Variant Påvirker DNMT3A1 transkripsjonen aktivitet
for å evaluere biologisk funksjonelle effekten av rs7560488 polymorfisme på DNMT3A1 transkripsjon, bygget vi luciferaserapportørplasmid vektorer (pGL3), som strekker seg over 4389823-4390770 base
DNMT3A1
promoter, med enten villtype (T allel) eller mutant type (C-allelet) og transfektert dem i BGC-823, AGS celler (figur 3A). Som vist på fig. 3B, fant vi at transkripsjon aktiviteten til T-allelet var høyere enn C-allelet med en ca. 2 ganger i over to cellelinjer, noe som tyder på at rs7560488 T-allelet jobbet som forsvarer for magekreft ved å øke transkripsjon av
DNMT3A1
.
(A) Skjematisk representasjon av rapportør plasmider som inneholder rs7560488 T eller rs7560488 C-allel, som ble satt inn oppstrøms for luciferase reporter-genet i den grunnleggende pGL3-plasmid. (B) De to konstruksjonene ble transient transfektert inn i AGS og BGC-823 celler henholdsvis. Luciferase-aktivitet av hver konstruksjon ble normalisert mot den interne kontroll av Renilla luciferase. Kolonner mener fra tre uavhengige forsøk; barer, SD. *, P 0,01 sammenlignet med konstruksjonen motstykke
The rs7560488 T . C Variant demper transkripsjonsfaktor Affinity
I lys av tagSNP rs7560488 ligger i
DNMT3A1
promoter regionen; vi hypotese at det kan endre binding av transkripsjonsfaktor (TF). Faktisk, ved hjelp av TF-søkealgoritme (www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), spådde vi at rs7560488 T skaper en TF bindingssetet for AP-1. For å finne ut om denne polymorfisme har en effekt på bindingsevnen av transkripsjonsfaktoren, gjennomførte vi den elektroforetiske mobilitet skift-analyse (EMSA) for å analysere bindingen av oligo-prober inneholdende enten T eller C-allelet til kjerneproteiner ekstrahert fra AGS cellen. Som vist på fig. 4A, en spesifikk forskjøvet DNA /kjerneprotein sammensatt bånd ble generert av både C- og T-allel prober (fig. 4 en baner 2, 5). Imidlertid T allele ennå ikke blitt fullt ut konkurransedyktig inhibert (fig. 4A spor 4), selv om den forskyves båndet ble opphevet med 50-gangers-merkede C-prober (figur 4A lane 1.), Noe som tyder på at bindingsaktiviteten av sekvensen inneholdende rs7560488 T allel var sterkere sammenlignet med C-allel og transkripsjonsfaktoren kan fortrinnsvis bindes til T-allelet i stedet for C-allelet. Videre super-EMSA ved hjelp av AP-1-antistoff ikke forårsaket en supershift av den biotin-merkede probe /kjerneprotein (fig. 4 B, kolonne 2, 5) som indikerer at AP-1 kan ikke transkripsjonsfaktor som binder seg til promotor-regionen inneholder T eller C-allelet. Disse resultatene indikerte at rs7560488 C-allel kan redusere kjerneproteinbindingsaktivitet, selv om effekten ikke påvirkes av transkripsjonsfaktor AP-1.
(A) kjerneproteiner bindende aktivitet av forskjellige alleler av DNMT3A1 rs7560488 polymorfisme. biotinylerte prober (60 fmol) ble inkubert med kjernefysiske utdrag fra BGC-823 celler. I konkurrerende eksperimenter, 50-ganger molart overskudd av umerket T eller C-prober ble anvendt for å demonstrere spesifisiteten til hvert bindingsreaksjonen. (B) Den super-shift-analyse utført ved bruk av 20 ng anti-AP-1 antistoff (spor 2, 5).
Sammenhengen mellom DNMT3A1rs7560488 Polymorphism og uttrykket nivåer av
DNMT3A1
mRNA
Førti-fire mage kreft vev med ulike genotyper av DNMT3A1 rs7560488 var tilgjengelig i vår nåværende studie. På grunn av den lave frekvens av CC genotype, vi tilsettes det til prøvene med TC genotype for analyse. Som vist på fig. 5, uttrykket nivåer av DNMT3A1 mRNA var lavere hos personer med TC eller CC genotype enn i de med TT genotype (P 0,05)..
TT versus TC /CC genotyper
diskusjon
Genome-wide hypometylering og formidler hypermethylation er kjennetegnene ved en god rekke kreftformer som bidrar til tumorigenesis og DNA metylering spiller sentrale roller i regulering av genekspresjon og opprettholde genomisk stabilitet [21], [22]. DNA metylering er utført av DNA metyltransferaser (DNMTs)
DNMT1
,
DNMT3B Hotell og
DNMT3A product: [23], [24].
de novo
metyltransferaser
DNMT3A
er sterkt uttrykt under tidlig embryoutvikling og nedregulert i de fleste differensierte somatiske celler [25]. Rollen som
DNMT3A
i human kreft ble understreket av rapporter om
DNMT3A
mutasjoner i ca 20% av pasienter med akutt myelogen leukemi [26], [27]. Forekomsten av disse mutasjonene korrelerte med redusert enzymatisk aktivitet og genomiske regioner med redusert metylering.
DNMT3A
mutasjoner ble også identifisert i 8% av pasienter med myelodysplastisk syndrom [28].
DNMT3A
også spiller en avgjørende rolle i epigenetisk stanse av stamcelle (HSC) regulatoriske gener og muliggjør effektiv differensiering [29].
DNMT3A
genomisk locus produserer to transkripsjoner gir opphav til to proteiner, jo lenger
DNMT3A1 Hotell og kortere
DNMT3A2
, som varierer i at en 219-aminosyre-amino (N) terminale halen er bare til stede i
DNMT3A1 product: [30], [31]. Den N-terminale domenet til
DNMT3A1
kalles en «regulatorisk» domene fordi den ikke har enzymatisk DNA metyltransferase aktivitet. Dette domenet deler ikke signifikant homologi med noen annen kjent protein.
DNMT3A1
er konsentrert i heterochromatin, som regnes for å være transkripsjonelt stille, og fungerer primært som en transkripsjons undertrykkelse [30]. Men annen forskning viser at
DNMT3A1
ble effektivt rekruttert til taushet Oct3 /4 og aktivert vitronectin (VTN) genet arrangører via sin unike N-terminale domenet [32].
Det har blitt rapportert at genetiske variasjoner i
DNMT3A
gen bidra til kreftutvikling, spesielt i forbindelse med GC [15], [33] – [36]. Deretter videre utforskning av forholdet mellom SNPs og translasjonsforskning regulering til sine målgener foreslått. Men konstatere biologisk funksjon for hver SNP krever ofte tidkrevende, molekylærbiologi eksperimenter. Dermed analysere store tall SNPs knyttet til noen bestemt locus i praksis krever en systematisk bioinformatikk evaluering og prioritering for å begrense det sett av sannsynlige funksjonelle kandidat varianter. Fordi de fleste av SNPs er i LD, er haplotype-baserte foreningen studier anses kraftigere enn én SNP-analyse for å identifisere årsaks genetiske varianter underliggende etiologien av komplekse sykdommer som kreft [37], dessuten bruk av tagSNPs som fanger det meste av haplotypic mangfold i assosiasjonsstudier har blitt foreslått [38]. Selv GWAS har gitt mange SNPs eller tagSNPs signifikant assosiert med kreft, er de fleste av tagSNPs funnet i ikke-proteinkodende regioner (intergeniske og intron regioner), identifisere deres funksjonelle og /eller årsaks varianter har en viktig begrensning av GWAS tolking tross av tildele antatte funksjonalitet til mange andre GWAS tagSNPs har bare vært vellykket når finkartlegging rundt en kjent risiko regionen ble utført [39] -. [41] Hotell
i denne studien har vi valgt en antatt funksjonelle tagSNP rs7560488 som kan representerer SNPs av
DNMT3A1
arrangøren med høy koblingsulikevekt, er det mulig å identifisere genetisk variasjon uten genotyping hver SNP i
DNMT3A1
promoter-regionen og forbedre effektiviteten i foreningen. Vi observerte at personer som bærer tagSNP rs7560488 TT genotyper utstilt betydelig redusert magekreft risiko sammenlignet med personer med TC eller CC genotype, som indikerer at allelet T er en beskyttende effekt potensielt utstilt av denne tagSNP. Videre analysene vi har utført gitt ytterligere bevis som viser at TC og CC genotype assosiert med redusert uttrykk nivåer av
DNMT3A1
mRNA i mage kreft vev, resultatene tyder på at
DNMT3A1
tagSNP rs7560488 T C var assosiert med en betydelig økt risikoen for GC. Deretter utførte vi en EMSA eksperiment for å analysere de biologiske konsekvensene av tagSNP rs7560488 polymorfisme i BGC-823 celler. Både T-allel og C-allel probene viste to gel-skift-bånd, men konkurrerende eksperimenter viste bindingsaffiniteten til kjerneproteiner ved T-allel variant proben var større enn det som sees med det C-allelen sonde motstykke. Så den forbedrede DNA-proteinbinding evne T allel kan være ansvarlig for den økte
DNMT3A1
promoter aktivitet som vi observerte i vår promoter analyser. Super-EMSA eksperiment brukte AP-1-antistoffer ikke fikk en super-gel-skift indikerte at transkripsjonsfaktorene AP-1 kan ikke involvere i dannelsen av transkripsjonelle komplekser ved tagSNP rs7560488 området. En annen roman resultat kommer fra sammenhengen mellom alder og rs7560488 T C polymorfisme i stratifisert analyse antydet at mindre enn 60 år gammel var mer utsatt for magekreft med tagSNP rs7560488 T C. Det er sannsynlig at
DNMT3A1
påvirker transkripsjon av spesifikke gener spesielt og endringer i visse gener øker risikoen for GC. Disse resultatene viser også at jo sterkere risikofaktor for GC er tagSNP rs7560488 T C, spesielt i ung alder
Til sammen denne studien gir den første mekanistisk innsikt i hvordan denne nye funksjonelle tagSNP rs7560488 T . C variant er signifikant assosiert med risiko for magekreft i en kinesisk befolkning. Vi har funnet at T til C forandring vesentlig endret transkripsjonen aktivitet av
DNMT3A1
genet via påvirke bindingen av noen transkripsjonelle faktorer og så endre DNMT3A1 ekspresjonsnivået, selv om et klart transkripsjonelle faktorer som gjenstår å bli etablert. Våre funn gir en innsikt som
DNMT3A1
promoter rs7560488 T . C variasjon er en lovende biomarkør for å evaluere befolkningen utsatt for GC og gi verdifull informasjon mot fremtidig forskning på magekreft patogenesen
Takk
Vi takker professor Yaping Wang, Dr. Zhenming Cai, Lili Cao (Nanjing University, Nanjing, Kina) og Zhenghao Zhang (Sørøst-universitetet, Nanjing, Kina) for HRM genotyping.
