Abstract
feilregulering av den soniske pinnsvin (Shh) signalveien har vært assosiert med kreft stamceller (CSC) og implisert i initiering av kreft i bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelen cscs er sjeldne kreftceller som kjennetegnes ved sin evne til å fornye seg selv, og er ansvarlig for tumorresidiv ledsaget av motstand mot nåværende behandlinger. Dødeligheten av disse uhelbredelige, aggressive og invasive pankreastumorer forblir en skremmende klinisk utfordring. Dermed målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle Shh sti i bukspyttkjertelkreft og for å undersøke de molekylære mekanismer som sulforaphane (SFN), en aktiv forbindelse i cruciferous grønnsaker, hemmer selvfornyelse kapasitet av menneskelige bukspyttkjertelen cscs. Interessant, viser vi her at Hysj veien er sterkt aktivert i bukspyttkjertelen cscs og spiller viktig rolle i å opprettholde stemness ved å regulere uttrykket av stemness gener. Gitt kravet om Hedgehog i kreft i bukspyttkjertelen, undersøkte vi om pinnsvin blokade av SFN kunne målrette stamcelle befolkningen i bukspyttkjertelkreft. I en
in vitro
modellen, er det menneskelige bukspyttkjertelen cscs avledet kuler betydelig hemmet på behandling med SFN, noe som tyder på klonogene utarming av cscs. Interessant, SFN hemmet komponentene Shh sti og Gli transkripsjonen aktivitet. Forstyrrelser av Hysj-Gli signale blokkert betydelig SFN-indusert hemmende effekter demonstrere kravet om en aktiv vei for vekst av bukspyttkjertelen cscs. SFN også hemmet nedstrøms mål for Gli transkripsjon ved å undertrykke uttrykket av pluripotency opprettholde faktorer (Nanog og Oct-4) samt PDGFRα og Cyclin D1. Videre SFN indusert apoptose ved inhibering av BCL-2 og aktivering av kaspaser. Våre data indikerer den avgjørende rollen Hysj-Gli signalering i å kontrollere egenskapene til bukspyttkjertelen cscs. Vi foreslår at bukspyttkjertelen kreft forebyggende effekter av SFN kan skyldes hemming av Hysj veien. Dermed Sulforaphane representerer potensielt en billig, trygt og effektivt alternativ for behandling av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Rodova M, Fu J, Watkins DN, Srivastava RK, Shankar S (2012) Sonic Hedgehog Signa Hemming gir muligheter for målrettet terapi ved Sulforaphane i Regulering Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Stem Cell selvfornyelse. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10,1371 /journal.pone.0046083
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: Mai 10, 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 28.09.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:.. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer .
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) har en av de fattigste prognosene blant alle kreftformer og generelle fem års overlevelse på 3% [1], [2], [3]. Dessverre, i de fleste tilfeller kreft i bukspyttkjertelen er ikke resectable ved diagnosetidspunktet. Det er begrenset behandlingstilbud tilgjengelig for denne sykdommen fordi kjemo- og radioterapi er stort sett ineffektiv, og metastatisk sykdom ofte redevelops selv etter operasjonen [4]. Derfor er det et presserende behov for å oppdage nye og effektive chemopreventive tilnærminger for kreft i bukspyttkjertelen.
Cancer stamceller /kreft initiere celler (tics) er foreslått å være årsaken til kreft initiering, progresjon og kjemoterapi svikt i flere humane maligniteter, inkludert kreft i bukspyttkjertel [5], [6], [7]. CSC hypotese antyder at bare stamcelle i tumorer er i stand til ubegrenset selvfornyelse og at eliminering av disse cellene til slutt vil stanse neoplastisk utvidelse, som bedre differensierte celler har begrenset mitogen kapasitet og vil ikke bidra til langsiktig tumorvekst . Derfor er det viktig å utforme nye strategier basert på en bedre forståelse av de signalveier som kontrollerer aspekter ved selvfornyelse og overlevelse i cscs for å identifisere nye terapeutiske mål i disse cellene. Dermed kan utvikling av terapeutiske strategier som spesifikt retter bukspyttkjertelen cscs være effektive i å utrydde svulster og redusere risikoen for tilbakefall og metastasering.
oppregulering av Sonic pinnsvin pathway er påvist i cscs, hvilken effekt tumorprogresjon inkludert migrasjon , invasjon og metastasering. Upassende aktivitet på Hh signalveien også har vært knyttet til tumortyper som oppstår sporadisk eller i genetisk disponerte individer [8], [9]. Den Hysj veien er en tidlig og sen formidler av tumordannelse i epiteliale kreftformer. Aktivering av Shh signale synes å gå foran transformasjon av bukspyttkjertelen vev stamceller til bukspyttkjertelen kreft stamceller, med Gli transkripsjonsfaktor fungerer som en formidler av miljømessige signaler og i utviklingen av pankreas cscs inn metastatiske tumorceller. Shh signale lansert av binding av utskilt Shh peptid til 12- span trans protein Lappet (ptch), noe som resulterer i tap av ptch aktivitet og påfølgende fosforylering og posttranskripsjonelt stabilisering av 7-span trans protein glattet (Smo), et medlem av serpentin-reseptorer [10], [11]. Som et resultat, blir ekspresjon av målgener Hh initialisert gjennom posttranslational aktivering av Gli familie av sink-finger transkripsjonsfaktorer [12]. Gli-familien er en av målgenet gående induseres når den Shh reaksjonsveien er aktivert, noe som gjør dette transkript en pålitelig markør for både fysiologisk og patologisk Hysj signaleringsaktivitet. Aktivering av Shh signalveien er involvert i reguleringen av spredning av pancreatic cscs. Således ved å målrette signalveiene som er avvikende aktivert og av viktighet for opprettholdelse av kreft stamcelle kan føre til utviklingen av nye behandlingskurer mot kreft i bukspyttkjertelen ved eliminering av kreft i bukspyttkjertelen cscs [13], [14].
Epidemiologiske studier har antydet at økt risiko for kreft i bukspyttkjertelen er forbundet med tobakk, fedme og høyt forbruk av fett, fisk, svinekjøtt eller biff, og at redusert risiko er forbundet med inntak av cruciferous grønnsaker. En viktig gruppe av agenter som har denne egenskapen er organosulfur forbindelser som Isothiocyanates (ITCS), rikelig i cruciferous grønnsaker som forbruket har epidemiologisk vist en invers kobling med kreft i bukspyttkjertelen. ITCS har vist seg å oppvise flere potensielle chemoprotective aktivitet i celle- og dyremodeller [15], [16], [17], [18]. Vi har tidligere vist at oral administrering av Sulforafane hemmet veksten av PC-3-celler orthotopically implantert i prostata av nakne mus ved å indusere apoptose, og inhibering av tumorcellevekst, metastase og angiogenese [19]. Vi har også nylig vist at SFN alene og i kombinasjon med quercetin hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen stamceller hentet fra bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
in vitro
gjennom regulering av FOXO proteiner [20]. Dermed holder SFN store løftet for utvikling som en chemopreventive /terapeutisk middel. På tross av disse funnene, er det ingen studier som viser regulering av bukspyttkjertelen cscs av SFN, og om SFN kan hemme Hysj veien.
Dermed Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle Sonic pinnsvin veien i bukspyttkjertelen kreft og for å undersøke de molekylære mekanismer som Sulforafane (SFN), en aktiv forbindelse i cruciferous grønnsaker, hemmer selvfornyelse kapasitet av pankreatiske cscs. Den understreket molekylære mekanismen i utviser denne effekt var gjennom hemming av Sonic hedgehog signalveien på nivået av transkripsjon Gli, proliferasjon, stamcelle egenskaper og induksjon av apoptose. Disse data tyder på at SFN kan være et nyttig middel for forebygging og behandling av kreft i bukspyttkjertelen. Slik informasjon vil ikke bare tillate rasjonell utforming av SFN-baserte strategier for forebygging og /eller behandling av bukspyttkjertelkreft, men kan også legge til rette for utvikling av mekanisme drevet protokoller for optimal klinisk effekt.
Resultater
uttrykk av soniske pinnsvin signalveien gener i bukspyttkjertelen cscs
The Hedgehog (Hh) signalveien er viktig for utviklingen av vev og organer [8]. Men avvikende aktivering av Sonic pinnsvin (Shh) signalveien spiller viktige roller i tumorigenesis og progresjon av flere svulster [8], [9]. For å evaluere muligheten for at Hh-signalering er aktiv på humane pankreatiske cscs vi sammenlignet mRNA-ekspresjon av forskjellige komponenter i Shh reaksjonsveien i humant pankreatisk CSC (PanCSC) til humane pankreatiske normale ductal epitelceller (HPNE) og humane normale pankreatiske stamceller ( HNPSC), i en
in vitro
cellekultur modell og som kvantifisert ved QRT-PCR. Som vist på fig. 1.A-C, observerte vi en robust uttrykk for sentrale deler av Hysj-Gli veien i bukspyttkjertelen CSC i forhold til sine normale counter deler. Proteinet ekspresjon av disse komponentene ble ytterligere bekreftet ved Western-blotting som er vist på fig. 1.d. Interessant, viser vi her at Sonic pinnsvinet veien er sterkt aktivert i bukspyttkjertelen cscs tyder på at hyperaktive Hysj-Gli signale kan regulere uttrykket av stemness gener i bukspyttkjertelen cscs og spille en rolle i celleproliferasjon og progresjon av bukspyttkjertelen cscs.
(A-C), Relativ uttrykk for ulike komponenter i Shh veien ble kvantifisert i menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (PanCSC), menneskelige bukspyttkjertelen normale stamceller (HNPSC) og menneskelige bukspyttkjertelen normale duktale epitelceller (HPNE). Den ekspresjon av shh gener ble kvantifisert ved bruk av kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon sanntids analyse (q-RT-PCR), og normalisert til GAPDH uttrykk. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. %, Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), Immunoblotting av Gli1 /2, Smo og β-aktin av menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (PanCSC), menneskelige bukspyttkjertelen normale stamceller (HNPSC) og menneskelige bukspyttkjertelen normale duktale epitelceller (HPNE).
Sulforaphane hemmer pinnsvin signalveien i bukspyttkjertelen cscs
in vitro
Vi har derfor søkt å undersøke effekten av SFN på uttrykk for Shh reseptor (Smothened) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR i menneskelige bukspyttkjertelen cscs. Som vist i (fig. 2.a-C), SFN hemmet ekspresjon av Smo, Gli1 og Gli2. Siden vi tidligere har vist Shh sti aktivering i et panel av menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer [21], vi også søkt å undersøke effekten av SFN på uttrykk for Shh reseptor (Smothened) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR i kreft i bukspyttkjertelen celler ASPC og Panc-1. Som vist på fig. 3, SFN hemmet ekspresjon av Smo, Gli1 og Gli2 i disse cellelinjer så vel som tyder på at SFN kan hemme aktiveringen av Shh signalisering i bukspyttkjertelkreft.
(A-C) Hemming av komponenter av soniske pinnsvin veien. Bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med Sulforafane (0-20 mm) i 24 timer. Ekspresjonen av Gli1, Gli2 og Smo ble målt ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH uttrykk. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. *, @ Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05; (D), Immunoblotting av Gli1 /2, Smo og β-aktin av menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (PanCSC) behandlet med Sulforaphane (0-20 mm).
(A-B), Hemming av komponentene i sonisk pinnsvin veien. ASPC1 og PANC1 ble behandlet med Sulforafane (0-20 uM) i 24 timer. Ekspresjonen av Gli1, Gli2 og Smo ble målt ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH uttrykk. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. $, @ Og = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05.
Videre, siden tilstedeværelsen av atom Gli uttrykk er en indikasjon på aktiv Hh signalering, undersøkte vi effekten av SFN på kjernefysisk translokasjon av Gli transkripsjonsfaktorer ved bruk immunocytochemistry (ICC). Pankreas cscs ble behandlet med SFN (0-20 uM) i 24 timer. Cellene ble deretter farget med anti-Gli og Gli2 antistoff (grønn fluorescens), og DAPI (rød fluorescens). Flettede bilder blir vist, som indikerer gul-orange farging av Gli 1 og Gli2 lokalisert i kjernen på grunn av fusjon av grønn og rød fluorescens. Som vist på fig. 4A, SFN hemmet den kjernefysiske translokasjon av Gli1 og Gli2, målt ved ICC. Disse data antyder derfor at SFN hemmer sonisk pinnsvin reaksjonsvei på nivå med Gli aktivering.
(A), Den nukleære translokasjon av Gli1 og Gli2, ble målt ved immunocytokjemi. Bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med Sulforafane (0-20 mm) i 24 timer. Cellene ble deretter farget med anti-Gli og Gli2 antistoff (grønn fluorescens), og DAPI (rød fluorescens). Flettede bildene er vist, som viser gul-oransje farging av Gli en og Gli2 ligger i kjernen på grunn av samlokalisering av grønn og rød fluorescens. (B) Inhibering av Gli transkripsjon. Bukspyttkjertelen cscs ble omformet med Gli-responsive GFP /ildflue luciferase viruspartikler (pGreen Fire1-Gli med EF1, System biovitenskap). Etter transduksjon, ble kulturmediet skiftet ut og cscs ble behandlet med Sulforafane (0-20 uM) i 24 timer. Gli-responsive reporter-aktiviteten ble målt ved anvendelse av et luciferase-assay (Promega Corporation). Data representerer middelverdi ± SD. @,%, Og * = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05.
Brudd Shh signalering av Sulforaphane hemmer Gli reporter aktivitet i bukspyttkjertelen cscs
Siden Gli transkripsjonsfaktor medierer effekten av Shh som spiller viktige roller i å opprettholde stemness og tumorigenesis, vi Deretter ble Gli transkripsjonen aktivitet (fig. 4B). Bukspyttkjertelen cscs ble omformet med Gli-responsive GFP /ildflue luciferase viruspartikler (pGreen Fire1-Gli med EF1, System biovitenskap). SFN inhiberte Gli transkripsjonen aktivitet på en doseavhengig måte. Disse data tyder på at SFN kan regulere bukspyttkjertelen carcinogenesen som er formidlet gjennom hemming av Hysj signalering.
Hemming av Gli forsterker effekten av sulforaphane på spheroid dannelse i bukspyttkjertelen cscs
I tillegg til å bestemme effekten av SFN på Shh signal hemming på bukspyttkjertelen CSC spredning og selvfornyelse, utførte vi sfære formasjon analysen. Bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med SFN (0-20 mm) for en uke og vurderes for sin iboende evne til å danne primære kuler i kultur. Ved slutten av en uke ble det totale antallet kuler målt og evne til å danne sekundære sfærer ble videre undersøkt etter en uke. Humane pankreatiske cscs avledet sfærer ble signifikant inhibert ved behandling med SFN, noe som antyder den klonogene nedbryting av cscs (Fig. 5A).
(A), Inhiberende virkninger av SFN på CSC sfæroide levedyktighet. Pankreas cscs ble sådd ut som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0 og 20 uM). Etter 7 og 14 dager, ble primære og sekundære sfæroider dissosiert og levedyktige celler ble telt ved trypanblått-analyse. Data representerer middelverdi ± SD. @ Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), ble bukspyttkjertelen cscs transduced med enten egge shRNA eller Gli1 og Gli2 shRNA uttrykke lentiviral vektorer (pLKO.1), og cellelysatene ble samlet og Western blot analyse ble utført ved hjelp av anti-Gli1 eller Gli2 antistoff. (C), CSC /kryptert og CSC /Gli shRNA ble sådd ut som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0-20 uM). Etter 7 dager ble kulene oppsamlet og cellesuspensjoner ble fremstilt og levedyktige celler ble telt ved trypanblått-analyse. Data representerer middelverdi ± SD. @,%, Og * = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), øker Gli shRNA de inhiberende virkninger av SFN på CSC sfæroide levedyktighet. CSC /scrambled og CSC /Gli shRNA ble sådd ut som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0 og 20 uM). Etter 7 dager, ble kulene photomicrographed.
Gitt kravet om Hedgehog signalisering i kreft i bukspyttkjertelen, undersøkte vi om Hedgehog blokade av sulforaphane kunne målrette stamcelle befolkningen i bukspyttkjertelkreft. For å forstå hvilken rolle Shh signalering i SFN indusert hemming av bukspyttkjertelen CSC spredning, forsøkte vi å hemme Shh signalisering i bukspyttkjertelen cscs ved å banke ned Gli transkripsjonsfaktor ved hjelp lentiviral formidlet transduksjon av Gli shRNA hemme både Gli1 og to uttrykk. Uttrykket av Gli i bukspyttkjertelen CSC ble undertrykt av nesten 100% ved hjelp av Gli1 og Gli2 målretting shRNAs som kvantifisert ved Western blotting (fig. 5B). Som vist i (fig. 5C-D), ble prosentandelen av sfæren dannende evne av pankreas cscs betydelig redusert i Gli knock-down-celler i forhold til kontrollcellene. Videre forstyrrelser av Shh- Gli signaliserer gjennom lentiviral – mediert stanse betydelig blokkert SFN indusert hemmende effekter demonstrere kravet om en aktiv vei for vekst av kreft i bukspyttkjertelen stamceller
SFN hemmer uttrykk for pluripotency opprettholde transkripsjonsfaktorer.
Vi har nylig vist at bukspyttkjertelen CSCs uttrykker stamceller markører CD133, CD44, CD24, ESA, uttrykker høye nivåer av pluripotency opprettholde faktorer og resistensgener MDR1 og ABCG2 i forhold til normale bukspyttkjertelen celler og kreft i bukspyttkjertelen celler [22]. Vi karakterisert derfor cscs isolert fra humane pankreatiske tumorer ved strømning cytometery anvendt i denne studien. Som vist i (Fig. 6A-D), bukspyttkjertelen cscs uttrykke stamcellemarkører CD44, ESA, CD133, og CD24. Interessant, bukspyttkjertelen CD44
+ ESA
+ CD133
+ CD24
+ cscs også uttrykt CK19 (bukspyttkjertelkreft bestemt epitel markør) og ABCG2 medikament resistensgener (Fig. 6E-F).
(A-D), Expression of pancreatic stamcellemarkører. Flowcytometrisk analyse av bukspyttkjertelen cscs uttrykke ble utført ved hjelp av stamcellemarkører CD44 -PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC og hensiktsmessige kontroller. (E-F), Expression of pancreatic epiteliale markører og narkotika resistensgener. Flowcytometrisk analyse av bukspyttkjertelen CD44
+ ESA
+ CD133
+ CD24
+ cscs også uttrykt henholdsvis CK19-PE og ABCG2-PE.
Nanog er avgjørende for pluripotency, sammen med andre ES som signatur faktorer, slik som OCT4 er også kritisk for pancreatic cscs og andre kreftformer [23], [24]. De er akseptert Hh målgener også. Faktisk kan nivåene av OCT4 indusere epitel dysplasi hos mus, og har vært innblandet i en rekke humane tumorer som også er regulert av Hh-Gli signalering. Vi har derfor søkt å undersøke effekten av SFN på uttrykk for disse faktorene
in vitro
. Som vist i (fig. 7A-B), SFN hemmet mRNA-ekspresjon av Nanog, og Oct-4 i bukspyttkjertelen cscs. Videre, som bekreftet ved Western-blotting i (fig. 7C), SFN hemmet protein ekspresjon av Nanog, og Oct-4 i bukspyttkjertelen cscs. Disse dataene indikerer at Shh signale kan fremme bukspyttkjertelen cscs spredning gjennom økt celle selvfornyelse.
(A-B), Effekter av SFN på uttrykket av Hh målgener i bukspyttkjertelen cscs. Real time PCR (q-RT-PCR) ble utført for å undersøke uttrykket av Nanog og Oct4 og data ble normalisert med GAPDH. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. @ Og% = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med SFN (0-20 uM), og cellelysater ble oppsamlet og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av anti- Nanog, Oct4 eller β-aktin-antistoff. (D-E), Effekter av SFN på ekspresjon av målgener Hh som er involvert i celleformering i de pankreatiske cscs. Real time PCR (q-RT-PCR) ble utført for å undersøke uttrykket av PDGFRα og cyclin D1, involvert i vedlikehold av spredning ble analysert og normalisert med GAPDH. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. @,%, Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (F), bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med SFN (0-20 mm), og cellelysatene ble samlet og Immunobloted for anti- PDGFRα, Cyclin D1 eller β-actin antistoff.
Hedgehog signale blockadge av Sulforafane hemmer celleproliferasjon og induserer apoptose i bukspyttkjertelen cscs
ved siden undersøkte effekten av SFN på mRNA-ekspresjonen av gener nedstrøms for Gli transkripsjon som er involvert i celleformering. Som vist i (Fig. 7D-E), SFN hemmet nedstrøms mål for Gli transkripsjon Cyclin D1 og PDGFRα i bukspyttkjertelen cscs som er kjent Hh målgener involvert i spredning. Videre ble hemningen av protein ekspresjon av disse målene ved SFN i pankreas cscs bekreftet ved Western-blotting i (fig. 7F). Disse data tyder på at SFN kan regulere bukspyttkjertelen karsinogenese ved å hemme Shh reaksjonsvei og nedstrøms mål.
Videre har vi vist at SFN indusert apoptose i pankreas cscs ved inhibering av Bcl-2-ekspresjon og ved aktiveringen av caspase 3 /7 (fig. 8A-B). Inhibering av protein ekspresjon av BCL2 og oppregulering av spaltet Caspase-3, ble bekreftet ved Western-blotting, slik som vist i (fig. 8C). Videre flowcytometrisk analyse med PI farging av SFN-behandlede celler i (fig. 8D), viser at økende doser av SFN forbedret apoptose i bukspyttkjertel cscs på en doseavhengig måte. Disse data tyder på at SFN kan hemme celleproliferasjon og indusere apoptose i bukspyttkjertelen cscs ved å målrette Shh sti og dets målgener.
(A), Effekter av SFN på BCL-2expression. Q-RT-PCR ble utført for å undersøke ekspresjon av Bcl-2. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. Data representerer middelverdi ± SD. @,% Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), Effekter av SFN på kaspase-3/7-aktivitet. Bukspyttkjertelen cscs behandlet med SFN (0-20 mm) i 24 timer, og caspase-3/7 aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner. Data representerer middelverdi ± SD. @,%, Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med SFN (0-20 uM), og cellelysater ble oppsamlet og Immunobloted for anti- BCL-2, spaltes Caspase 3 eller β-aktin-antistoff. (D), Effekter av SFN på apoptose. Bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med SFN (0-20 mm) i 48 timer, og apoptose ble målt ved PI flekker ved hjelp av flowcytometri.
Diskusjoner
Bukspyttkjertelkreft blir klinisk tydelig på sen stadier og det motstår alle former for konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling [1], [2]. Vi har nylig vist at cscs dele molekylære egenskaper med normale stamceller (SCS) og spiller avgjørende roller i legemiddelresistens og kreft metastasering. Bukspyttkjertelen cscs også demonstrere oppregulering av molekyler viktige i utviklingssignalveier, inkludert Sonic pinnsvin (Hysj) veien. Ukontrollert aktivering av Shh veien har vært implisert i progresjon og opprettholdelse av pankreas adenocarcinomer [25], [26]. Pathway aktivering via Smo dermed kan forekomme enten ved Hh-protein stimulering eller ved tap av ptch aktivitet, som vist i sporadiske kreft eller de som oppstår i den familiær kreft predisposisjon syndrom, BCNS (basalcelle nevus syndrom, forbundet med heterozygot mutasjon av det menneskelige ptch genet). Aktivering av Shh signalveien er involvert i regulering av proliferasjon av de pankreatiske cscs [27]. Således, midler som hemmer Shh bane har potensial for å forebygge sykdomsutvikling og metastatisk spredning [28]. I tillegg til legemidler som selektivt rettet mot cscs tilby en større løftet for kreft forebygging og behandling. Dette prosjektet er basert på premisset om at SFN, et naturlig stoff fra cruciferous grønnsaker, kan brukes til forebygging og /eller behandling av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. Dermed Hovedmålet med denne studien var å undersøke hvilken rolle Sonic pinnsvin veien i bukspyttkjertelkreft og undersøke de molekylære mekanismer som sulforaphane hemmer bukspyttkjertelen CSC egenskaper, og vurdere sin chemopreventive /terapeutisk potensial mot bukspyttkjertelkreft ved å målrette cscs.
SFN er en naturlig forekommende isothiocyanate med lovende chemopreventive aktivitet [29]. Epidemiologiske studier har vist at personer som spiser cruciferous grønnsaker har redusert forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen og andre kreftformer. Test med dyr har vist at mate SFN redusert frekvens, størrelse og antall av tumorer av forskjellig opprinnelse. Det var godt og raskt absorbert og vises en absolutt biotilgjengelighet på 82% [30]. Det er en fase to enzyminduserende [31], og hemmer benzo [a] pyren-DNA og 1,6-dinitropyrene-DNA-addukter formasjonen. Den virker som en antioksidant, antiproliferativ, antitumor, og anti-angiogent middel, og således en ny kandidat for kjemoprevensjon [19], [32], [33], [34]. Noen nylige studier på bukspyttkjertelkreft stamceller avledet fra humane cellelinjer er blitt rapportert, hvor de har vist at SFN kan hemme deres vekst gjennom hemming av NFkB [35]. Disse studiene antyder sterkt at SFN kan modulere ekspresjonen av gener som er kjent for å spille roller i karsinogenese prosess, og derfor kan være et potensielt middel for kjemoprevensjon mot kreft i bukspyttkjertelen. Så langt vi kjenner til er dette den første studien som viser at sulforaphane kan hemme veksten av primære bukspyttkjertelen cscs avledet fra humane tumorer
in vitro
gjennom hemming av Sonic pinnsvin sti og blir dermed ansett som svært roman.
i den foreliggende undersøkelse har vi påvist for første gang, at kreft preventivt middel SFN inhiberer ekspresjonen av komponenter av Shh reaksjonsveien i humane pankreatiske cscs. SFN hemmet uttrykk for reseptoren molekylet Smo, samt effekt Gli 1 og 2, noe som tyder på det kliniske betydningen av Hysj veien i bukspyttkjertelkreft progresjon. Den tvangs aktivering av Shh eller inhibering av Gli1 pluss Gli2 ekspresjon av shRNA blokkert de inhiberende virkninger av SFN, noe som tyder på at effektene av SFN blir mediert gjennom hemming av Shh svei. SFN hemmer selvfornyelse kapasitet på menneskelige bukspyttkjertelen cscs ved å hemme pluripotency opprettholde faktorer og Shh sti. Nærmere bestemt inhiberer SFN den selvfornyelse kapasitet av pankreatiske cscs ved å inhibere ekspresjonen av pluripotency å opprettholde transkripsjonsfaktorer (Nanog og Oct-4), komponentene i Shh vei, og induserer apoptose ved inhibering av Bcl-2, Cyclin D2, og aktivering av caspase -3 og 7. til sammen våre nåværende studier sterkt at SFN er en potent biologisk hemmer av human bukspyttkjertelkreftutvikling, noe som reduserer deres proliferative og invasive aktiviteter. Disse studiene øker perspektiv som sulforaphane kan være et nyttig middel for forebygging og /eller behandling av bukspyttkjertelkreft ved å målrette cscs.
Siden cscs /stamceller spille viktige roller i kreft initiering, progresjon, tilbakefall og resistens hemming av CSC vekst og deres selvfornyelse kapasiteten med Sulforafane kunne ha betydning for forvaltningen av kreft i bukspyttkjertelen og har nylig blitt anmeldt i flere aviser som chemopreventive strategi av kosttilskudd agenter for målretting kreft stamceller [36], [37]. Opplysning av mekanismen (e) for antiproliferative aktivitet av SFN er kritisk til totalvurdering for dens potensial klinisk nytte. Slik informasjon vil ikke bare tillate rasjonell utforming av sulforaphane, basert strategier for forebygging og /eller behandling av bukspyttkjertelkreft, men kan også legge til rette for utvikling av mekanisme drevet protokoller for optimal klinisk effekt.
Konklusjoner
Vi har vist her for første gang, at SFN hemmet selvfornyelse kapasitet av pankreas cscs isolert fra humane primære tumorer og hemmer pancreatic CSC egenskaper. De inhiberende virkninger av SFN blir mediert gjennom hemming av Shh svei. SFN hemmet ekspresjon av transkripsjonsfaktorer (Nanog og Oct-4) som er nødvendig for å opprettholde stamcelle-pluripotency. SFN potent eliminerer bukspyttkjertelen cscs egenskaper ved å påvirke clonogenecity, spheroid formasjon sammen med signale involvert i apoptose motstand og spredning. Således regulering av Shh signalveien i cscs ved ikke-toksisk middel Sulforafane, kan anses som en ny strategi for behandling og /eller forhindring av kreft i bukspyttkjertelen. Siden avvik Shh signalering oppstår i bukspyttkjertelen tumorigenesis, kan therapeutics som er rettet mot Shh pathway forbedre resultatene av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen ved å målrette cscs og også legge til rette for utvikling av mekanisme drevet protokoller for optimal klinisk effekt.
Materialer og metoder
Reagenser
Antistoffer mot GAPDH og Gli ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). SFN ble kjøpt fra LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Forbedret Chemiluminescence (ECL) Western blot gjenkjenning reagenser var fra Amersham biovitenskap Inc. (Arlington Heights, IL). Alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO).
Cell kultur
Menneske normale bukspyttkjertelen stamceller (HPSC) og menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (CD133
+ /CD44
+ /CD24
+ /ESA
+) ble hentet fra Celprogen Inc. (San Pedro, California). De ble isolert fra primære tumorer og er blitt beskrevet tidligere [38]. Disse cscs består av en bulk kreft i bukspyttkjertelen stilk cellepopulasjon, og således kan ikke betraktes som en cellelinje. De cscs ble dyrket i DMEM supplementert med 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml human blodplatevekstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (Invitrogen) og ett % antibiotikum-antimykotisk (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. Menneske bukspyttkjertelen normale duktale epitelceller (HPNE) ble hentet fra
Lonza, Clontetics og vedlikeholdes i DMEM supplert med vekstfaktor kule kit.
Tumor spheroid analysen
spheroid forming analyser ble utført som beskrevet andre steder [22], [39].
