Abstract
Det er økende bevis for at funksjonelle crosstalk mellom GPCRs og EGFR bidrar til utviklingen av tykktarm, lunge, bryst, eggstokk, prostata og svulster i hode og hals. I denne studien utførte vi flere analyser av GPCR uttrykk i en gefitinib bestandig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje, H1975, som havner et L858R /T790M mutasjon. For å bestemme uttrykket profilen til mRNA som koder 384 GPCRs i normal human lunge fibroblast (NHLF) og H1975 celler, ble en GPCR spesifikk microarray analyse utført. En varme kart over microarray avdekket betydelige forskjeller i uttrykket av GPCR mellom NHLF og H1975 celler. Fra GPCR uttrykket listen, valgt vi noen GPCR-agonister /antagonister for å undersøke hvorvidt de respektive ligander som kan påvirke veksten av H1975-celler. Blant dem, behandling med enten en selektiv antagonist av adenosin A2a-reseptorer, som var sterkt uttrykt i H1975 celle og en annen gefitinib-resistente NSCLC-celler, HCC827GR celler eller «små interfererende RNA» (siRNA) som målretter adenosin A2a-reseptorer ga en signifikant reduksjon i celle levedyktighet av både H1975 og HCC827GR celler. Blant oppregulert GPCRs i H1975 celler, ble GS, Gi- og Gq-koblede GPCRs uttrykte nesten likt. Blant nedregulert GPCRs, ble Gi-koblede GPCR dominant uttrykt i H1975 celler. De foreliggende resultatene tyder på at flere lag krysstale mellom GPCRs og EGFR kan spille en viktig rolle i orkestre nedstrøms signalmolekyler som er involvert i utviklingen av gefitinib bestandig NSCLC
Citation. Kuzumaki N, Suzuki A, Narita M, Hosoya T, Nagasawa A, Imai S, et al. (2012) Flere Analyser av G-proteinkoblet reseptor (GPCR) Expression i Utvikling av Gefitinib-Resistance i Trans Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (10): e44368. doi: 10,1371 /journal.pone.0044368
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 10 september 2011; Godkjent: 02.08.2012; Publisert: 29 oktober 2012
Copyright: © 2012 Kuzumaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til død av kreft. Mens kjemoterapi kan lett forlenge overlevelsen hos pasienter med avansert sykdom, er det også forbundet med klinisk signifikante bivirkninger [1]. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et viktig mål for molekyl anti-NSCLC terapi [2]. Gefitinib mål ATP kløft i EGFR-tyrosinkinase, som er overuttrykt i 40-80 prosent av NSCLC og mange andre epiteliale cancere [3]. EGFR-signalisering utløses ved binding av vekstfaktorer, slik som EGF, noe som resulterer i enten dimerisering av EGFR molekyler eller heterodimerisering med relaterte reseptorer, slik som HER2. Autofosforylering og transphosphorylation av EGFRs gjennom sine tyrosin kinase domener rekrutterer nedstrøms effektbokser og aktiverer signaler for spredning og celle-overlevelse [4]. Mutasjoner er blitt identifisert i EGFR-genet i prøver fra pasienter med NSCLC som responderer på EGFR-hemmere [5]. Disse mutasjonene består av små slettinger som påvirker aminosyrene 746 gjennom 750 (delE746-A750) eller punktmutasjoner (oftest leucin erstattet av arginin i kodon 858 [L858R]) [6], [7], [8]. Disse mutasjonene modifisere nedstrøms signalisering og antiapoptotic mekanismer, og således formidle onkogene effekter [9]. Begge disse mutasjoner gjør tumor mer følsom for forbindelser som hemmer EGFR, mest sannsynlig ved å flytte kritiske rester som omgir det ATP-bindende kløften i tyrosin kinase domene av reseptoren, noe som stabiliserer interaksjoner med både ATP og dets konkurrerende inhibitorer [6] , [7]. I vårt tilfelle, DNA-sekvensering av EGFR-genet i en tumorbiopsiprøve på tilbakefall viste et andre punkt mutasjon som endret treonin til metionin ved posisjon 790 (T790M) av EGFR [5]. Effekten av gefitinib er av begrenset varighet, hovedsakelig på grunn av resistens overdratt av en andre punktmutasjon.
Aktiviteten av Akt, som også er kjent som proteinkinase B (PKB), stimuleres av forskjellige vekstfaktorer , og dette serin-treonin-kinase spiller evolusjonært konserverte roller i mange cellulære funksjoner, slik som proteinsyntese og cellevekst [10], [11]. Det har blitt rapportert at EGFR-hemmer endrer sterk, forbigående Akt fosforylering til svak, vedvarende Akt fosforylering. På grunn av lav-pass filter karakteristikker av Akt vei, fører dette til den sterkere fosforylering av S6, som er et molekyl nedstrøms for Akt, enn i fravær av inhibitoren. Således kunne EGFR-inhibitor fungere som en aktivator av nedstrøms EGFR [12]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at prosessen med gefitinib-motstand fører til forverring av kreftceller.
En stor mengde bevis tyder på at G protein-koblede reseptorer (GPCR) spiller en avgjørende rolle i tumorigenesis, og er innblandet i viktige skritt i kreft progresjon fra transformasjon, vekst og overlevelse for metastasering. En annen viktig måte som GPCR bidra til tumorigenesis innebærer intensiv crosstalk med en kanonisk sti. Det er mye som tyder på at agonister av enkelte GPCR, gjennom en prosess kalt transaktivering, kan aktivere vekstfaktor-reseptor-tyrosin-kinaser (RTK) i fravær av tilsatt vekstfaktor [13], [14], [15]. Dette er en viktig vei som bidrar til den vekstfremmende aktiviteten til mange GPCR-ligander. På den annen side har nylige funn indikerte at RTK’er transduce signaler ved bruk GPCR signalmolekyler og RTK ligander selv kan transactivate GPCR. For å megle svulst overlevelse og spredning, kan GPCR samhandle med EGFR nedstrøms signalveier, inkludert phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt, og Janus kinase /signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon (Jak /Stat3) veier. Faktisk, den funksjonelle crosstalk mellom GPCRs og EGFR bidrar til utviklingen av tykktarm, lunge, bryst, eggstokk, prostata og hode og hals svulster [16], [17]. Dermed GPCR kan være et utmerket sted for å blokkere tumorigen signaler, noe som ville gjøre GPCR-mediert funksjoner lovende terapeutiske mål i utvikling av legemidler for å oppnå innovative intervensjon i NSCLC. I denne studien har vi utført flere analyser av GPCR uttrykk i en gefitinib bestandig NSCLC cellelinje, H1975.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige ikke- liten kreftcelle celle lunge (NSCLC) linjer HCC827, NCI-H1975 (H1975, American Type Culture Collection Co., MD, USA) og HCC827GR ble dyrket i RPMI 1640 medium HEPES Modification (Sigma-Aldrich, MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen Life Technologies Co ™, CA, USA) og 1% penicillin-streptomycin (PS; Invitrogen Life Technologies ™ Co.). Normale menneskelige lunge fibroblaster (NHLF; Lonza Inc., NJ, USA) ble dyrket i fibroblast basal medium med insulin, rhFGF-B, GA-1000 og FBS (alle fra Takara Bio Inc., Tokyo, Japan). Alle celler ble opprettholdt under en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C.
Etablering av gefitinib-resistent cellelinje, HCC827GR
HCC827 celler ble eksponert til 1 pM av gefitinib i 48 timer i medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. De ble deretter vasket og dyrket i stoff-fri medium til overlevende celler var 80% sammenflytende. Disse cellene ble deretter re-eksponert for økende konsentrasjoner av gefitinib (fra 1 til 5 uM). Cellene var endelig i stand til å vokse i 5 mikrometer gefitinib ble oppnådd 1,5 måned etter første eksponering. De etablerte resistente celler ble opprettholdt i medium inneholdende 1 pM av gefitinib. For alle in vitro-studier ble resistente celler dyrket i stoff-fri medium for minst en uke for å eliminere gefitinib. Gefitinib-resistente celler kalles HCC827GR
Reagenser
De reagenser som brukes i denne studien var gefitinib (Toronto Forskning Chemicals Inc., Canada), [Arg
8]. – vasopressin acetatsalt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), angiotensin II (Sigma Chemical Co.), 2- (metyltio) adenosin-5′-trifosfat-tetranatriumsalt-hydrat (Sigma Chemical Co.), beraprost natrium ( Toray Industries Inc., Tokyo, Japan), a-metyl-5- (2-thienylmethoxy) -1H-indol-3-etanamin-monohydroklorid (BW723C86; Sigma Chemical Co.), 2-
p
– ( 2-karboksyetyl) fenetyl-amino-5′-N-etylkarboksamidoadenosin-hydroklorid-hydrat (CGS- 21680; Sigma Chemical Co.), 7- (2-fenyletyl) -5-amino-2- (2-furyl) – pyrazol [4, 3-e] -1,2,4-triazolo [1,5-c] pyrimidin. (SCH-58261, Sigma Chemical Co.)
Celleviabilitet analysen
Celler levedyktighet ble bestemt av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay. Tyve ul av MTT-løsning (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn i dyrkningsmediet. Etter inkubering i ytterligere 2 timer ble mediet fjernet, og 100 ul DMSO ble tilsatt for å løse formazankrystaller. Optisk tetthet ble målt ved bruk av en mikroplateavleser ved en bølgelengde absorpsjon 600 nm. I hvert forsøk ble tre replikater fremstilt for hver prøve. Andelen av levende celler ble bestemt basert på forskjellen i absorbans mellom prøver og kontroller.
GPCR TaqMan Array
En kommersielt tilgjengelig TaqMan Array Menneskelig GPCR kort (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) som tillater oss å kvantifisere uttrykk for mRNA som koder GPCRs fra 50 underfamilier (343 reseptorer, ikke inkludert odorant, olfactory, gustatory og feromon-reseptorer), ble brukt sammen med RNA hentet fra NHLF og H1975 celler. Total RNA, hentet fra NHLF og H1975 celler, ble hentet med Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems Inc.). For denne analysen ble cDNA fremstilt med en høy kapasitet RNA til cDNA-sett (Applied Biosystems Inc.). Hver port var lastet med cDNA (fra 1,5 mikrogram av RNA) og TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems Inc.) i henhold til produsentens instruksjoner. Platen ble analysert ved hjelp SDS2.3 og RQ manager 1.2 programvare levert av Applied Biosystems. Syklustider ble normalisert aaato husholdningsgenet GAPDH. En sammenlignende Ct tilnærmingen ble anvendt for å kvantifisere de relative nivåer av mRNA ved hjelp av RQ 1,2 programvare. Relative uttrykk nivåer ble beregnet som 2 × 10
5. Resultatene for hver GPCR ble undersøkt, og dersom prøven hadde en beregnet terskelverdi under 0,1, ble det ansett for å være umulig å oppdage. I slike tilfeller, for databehandlingsformål, ble det syklusnummer innstilt på 35,0.
RNA-fremstilling og semi-kvantitativ analyse ved revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA i NHLF ble H1975, HCC827 og HCC827GR hentet ved hjelp av SV Total RNA Isolation system (Promega, Madison, WI) etter produsentens anvisninger. Renset total RNA ble kvantifisert spektrofotometrisk ved A260. For å fremstille første-tråd cDNA, ble 1 pg RNA inkubert i 100 ul buffer inneholdende 10 mM ditiotreitol, 2,5 mM MgCl
2, dNTP-blanding, 200 U av revers transkriptase II (Invitrogen), og 0,1 mM oligo-dT12 -18 (Invitrogen). Hvert gen ble forsterket i 50 mL av PCR-løsning som inneholder 0,8 mM MgCl
2, dNTP blanding, og DNA polymerase med syntetiserte primere for menneskelig A2a reseptor (forstand: GGCTGCCCCTACACATCATCAACT, anti: TGGGCCAGGGGGTCATCT) og GPR87 (forstand: 5’CTCTAAAGGGGTAAGGGAGA 3 «, antisense: 5′-TGGGTTCAGCATAGGTTATT-3»). Prøvene ble oppvarmet ved 95 ° C i 1 minutt, 55 ° C i 2 min, og 72 ° C i 3 minutter. Den endelige inkuberingen var ved 72 ° C i 7 min. Blandingen ble kjørt på 2% agarose-gel-elektroforese med de indikerte markører og primere for den indre standard glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase. Agarosegelen ble farget med etidiumbromid og fotografert med UV transilluminasjon. Intensiteten av bandene ble analysert og semi-kvantifisert ved datastøttet densitometry hjelp ImageJ programvare.
prøveopparbeidelse og Western blotting
Celler ble oppløst med buffer som inneholder 20 mM Tris-HCl (pH 7 0,4), 0,3% (w /v) Triton, 3 mM MgCl
2, 1 M sukrose, 5 mM α-ME, og 1/1000-protease inhibitor i 15 min. Cellelysatene ble sentrifugert ved 2350 g i 10 min ved 4 ° C og supernatanten ble beholdt som lysatet fraksjonen for Western blotting. En aliquot av prøven ble fortynnet med et like stort volum av 2 x elektroforese-prøvebuffer (Protein Gel lastes Dye-2X, Amresco, Solon, OH) inneholdende 2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 10% glycerol med 0,2 M ditiotreitol. Proteiner (7 mL /felt) ble separert etter størrelse på 4-20% SDS-polyacrylamid-gradientgel og overført til nitrocellulosemembraner i Tris-glycin-buffer inneholdende 25 mM tris og 192 mM glycin. For immunoavtrykket deteksjon, ble membranene blokkert i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 1% fettfri melk (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) inneholdende 0,1% Tween 20 (Research Biochemicals, Inc., MA, USA) i 1 timer ved romtemperatur med omrøring. Membranen ble inkubert med primært antistoff fortynnet i TBS [1:1000 GPR87 (Abcam, Cambridge UK), 1:200,000 glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA)] inneholdende 1% fettfri tørrmelk med 0,1% Tween 20 over natten ved 4 ° C. Membranen ble vasket i TBS inneholdende 0,05% Tween 20 (TTBS), og deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur med pepperrotperoksydase-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) fortynnet 1 :10,000 i TBS inneholdende 1% fettfri tørrmelk inneholdende 0,1% Tween 20. Etter denne inkubasjon ble membranene vasket i TTBS. Antigen-antistoff peroksidase komplekset ble til slutt oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Pierce, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og visualisert ved eksponering for Amersham Hyperfilm (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA).
«Small interfering RNA» (siRNA) transfeksjon
H1975 og HCC827GR celler ble transfektert med kommersielt tilgjengelig «small interfering RNA» (siRNA) targeting adenosin A2a reseptorer (NIPPON EGT CO., Toyama, Japan) etter revers transfeksjon metode. Den tilsvarende mål-mRNA-sekvens av adenosin A2a reseptoren for den siRNA var som følger: 5′-ACAGCAACCTGCAGAACGT-3 «, (tilgangsnummer: NM_000675.4). Kort fortalt ble adenosin A2A gen-spesifikke siRNA fortynnet i Opti-MEM (Invitorogen) og blandet med RNAimax (Invitorogen) pre-fortynnet i Opti-MEM. Etter 20 min inkubasjon ved romtemperatur ble kompleksene tilsatt til 96-brønn. Etter dette ble celler (5 × 10
3 celler) sådd ut som godt. Etter 3 dagers dyrking, ble cellenes levedyktighet påvist ved MTT-analyse.
Statistical Analysis
Alle data presenteres som gjennomsnittet ± S.E.M. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom grupper ble bedømt ved en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni /Dunn multiple sammenligningstest. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom to grupper ble vurdert med Student
t
-test.
Resultater
Effekt av tyrosinkinaseinhibitoren gefitinib på veksten av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) -celler
Tilsetning av tyrosinkinaseinhibitor gefitinib (0,0001 uM til 1 uM) for å HCC827 celler, som er blitt klassifisert som den gefitinib følsomme NSCLC-cellelinjen [5], i 2 dager produsert en konsentrasjonsavhengig reduksjon i tumorcellevekst (figur 1 a-i, p 0,001 sammenlignet med ikke-behandlede gruppe). I motsetning til dette, har tilsetningen av gefitinib (0,0001 uM til 1 uM) i 2 dager ikke påvirke veksten av H1975-celler (Figur 1a-ii).
HCC827 (a) eller H1975 (b) celler ble inkubert 2 dager med gefitinib, og deretter celle levedyktighet ble målt (*** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppen).
Ulike uttrykk for GPCRs mellom NHLF og H1975 celler
til profil uttrykket av mRNA som koder 384 GPCRs i NHLF og H1975 celler ble utført en TaqMan GPCR spesifikk microarray analyse (figur 2, 3, figurer S1-1, S1-2, S1-3 for listen over GPCR gener i matrisen). Den spredningsplott viste at det var mange flere oppregulert GPCRs enn nedregulert GPCRs i H1975 celler sammenlignet med NHLF. En varme kart over microarray avdekket betydelige forskjeller i uttrykket av GPCR mellom NHLF og H1975 celler (figur 2, 3).
Menneskelig GPCR uttrykk ble analysert ved mikromatriser.
hver GPCR er vist som en enkel linje basert på deres Ct verdier og fargekoding er vist nedenfor, med en gradient fra grønt (negative og laveste Ct verdier) til rødt (positive og høyeste Ct verdier).
endringer i uttrykket prosenter av Gα subenheter (Gs, GI og GQ) i H1975 celler
uttrykk mønstre av Gα subenheter blant opp- eller nedregulert GPCRs av H1975 celler sammenlignet med NHLF ble tildelt følgende grupper: oppregulert Gs-koblet GPCR (tabell 1-a), oppregulert Gi-koblet GPCR (tabell 1-b), oppregulert Gq-koblet GPCR (tabell 1-c), nedregulert Gs-koblet GPCR (tabell 2-a), nedregulert Gi-kombinert GPCR (tabell 2-b) og nedregulert Gq-kombinert GPCR (tabell 2-c).
mRNA og dets protein uttrykk for GRP87, som var den mest oppregulert GPCR funnet i GPCR matrisen, var signifikant oppregulert i H1975 celler sammenlignet med dem i NHLF celler (Figur 4a: p 0,01 vs. NHLF, Figur 4b: p 0,001 vs. NHLF). (B) Øvre: Representative vestlige blotter av GPR87 Nedre: Representative vestlige blotter av GPR87 i membran fraksjoner av H1975 celler. Hver kolonne representerer gjennomsnittet med S.E.M. av 3 uavhengige utvalg (** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppen).
Blant oppregulert GPCRs i H1975 celler, GS, Gi- og Gq-koblede GPCRs ble uttrykt nesten like . Blant nedregulert GPCRs, ble Gi-koblede GPCR dominant uttrykt i H1975 celler (figur 5)
Andelen uttrykk mønster av Gα subenheten. (Gs: rød, Gi: blå og Gq: grønn) i opp- eller nedregulert GPCRs av H1975 celler sammenlignet med NHLF vises.
Effekter av en selektiv GPCR agonist eller antagonist på veksten av gefitinib bestandig H1975 celler
fra GPCR uttrykk listen, noen kommersielt tilgjengelige GPCR-agonist /antagonist ble valgt for å undersøke hvorvidt de respektive ligander påvirket veksten av H1975-celler (Figur S2). En adenosin A2a-reseptor (CGS-21680), en angiotensin II-reseptor-lignende en agonist (angiotensin II) og en purinergisk reseptor P2Y G-proteinkoblet 2 agonist (2- (metyltio) adenosin-5′-trifosfat-tetranatriumsalt-hydrat), hvilken var alle agonister av opp-regulert GPCR i microarray listen, hadde ingen effekt på tumorcellevekst. Tilsvarende cellevekst ble ikke påvirket av et prostaglandin I
2-reseptor (IP) agonist (beraprost natrium), en 5-hydroksytryptamin-reseptor 2B agonist (BW723C86) og et arginin vasopressin-reseptor 1A agonist ([Arg
8] -Vasopressin acetate salt), som alle ble klassifisert som «nedregulert GPCR». I motsetning til dette, tilsetning av den selektive adenosin-A2a-reseptor antagonist SCH-58261 (10 nM-10 uM) i 7 dager (figur 6A) frembrakte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i H1975 cellevekst (p 0,01, s 0,001 vs. ikke- behandlet gruppe)
(a) H1975 cellene ble inkubert i 7 dager med den selektive adenosin-A2a-reseptor antagonist SCH-58261 (10 nM-10 uM), og deretter cellenes levedyktighet ble målt (** p . 0,01 , *** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppen). (B) Behandling med siRNA targeting adenosin A2a reseptorer for å H1975 celler for 3 dager betydelig redusert celle levedyktighet H1975 celler (** p 0,01 vs. ikke-behandlede gruppen).
neste utføres for å transduce siRNA targeting adenosin A2a reseptorer i H1975 celler. Cellene ble høstet for påvisning av adenosin A2a-reseptor mRNA nivået semi-kvantitativt ved RT-PCR ved 72 timer etter transfeksjon. Adenosin A2a-reseptor-ekspresjon i nærvær av siRNA målretting adenosin A2a-reseptorer ble nedregulert med 90% sammenlignet med ikke-behandling (data ikke vist). Under disse betingelser, behandling med siRNA rettet mot adenosin A2a-reseptorer produseres en betydelig reduksjon i H1975 cellevekst (figur 6b: p 0,001 sammenlignet med ikke-behandlede gruppe).
Rollen til adenosin A2a-reseptorer i veksten av gefitinib -resistente HCC827GR celler
for å bekrefte funksjonen av adenosin A2a reseptorer på gefiitnib-motstand mot NSCLC, genererte vi anaother gefitinib bestandig HCC827GR celler ved å utsette HCC827 celler til økende konsentrasjoner av gefitinib for 1,5 måned. I henhold til en sekvensanalyse, HCC827GR cellene hadde andre punktmutasjon, på grunn forårsaket hovedsakelig medikamentresistens, 2369 C T i EGFR ekson 20-21, noe som førte til overganger Thr790Met (figur 7a-i). Derfor ble tilsetningen av gefitinib (0,01 uM til 1 uM) i 2 dager ikke påvirke veksten av HCC827GR celler (figur 7a-ii). Uttrykket av adenosin A2a reseptor mRNA ble dramatisk økt i HCC827GR celler sammenlignet med HCC827 og NHLF celler (figur 7b, p 0,001 vs. NHLF). Under disse betingelser, den selektive adenosin-A2a-reseptor antagonist SCH-58261 (10 nM-1 uM) i 7 dager frembrakte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i HCC827GR cellevekst (figur 7c, s 0,05, s 0,001 sammenlignet med ikke-behandlede gruppen ). Videre behandling med siRNA rettet mot adenosin A2a-reseptorer også en signifikant reduksjon i HCC827GR cellevekst (figur 7d: p 0,001 sammenlignet med ikke-behandlede gruppe).
(a-i) Sekvensanalyse i HCC827GR celle. En enkelt nukleotid endring C T (EGFR ekson 20) i DNA, noe som skaper en missense forandring i proteinsekvensen som erstatter et treonin med en metioninrest. (A-ii) HCC827GR celler ble inkubert med gefitinib i 2 dager, og deretter cellenes levedyktighet ble målt. (B) Øvre: Representative RT-PCR for mRNA av adenosin A2a-reseptor (ADORA2a) og GAPDH, en intern standard, i hver celletype. Nedre: Intensiteten av båndene ble bestemt semi-kvantitativt ved hjelp ImageJ. Verdiene for ADORA2a mRNA ble normalisert med verdien for GAPDH mRNA. Data representerer gjennomsnittet med S.E.M. av 3 uavhengige utvalg (*** p 0,001 vs. NHLF). (C) HCC827GR cellene ble inkubert i 7 dager med den selektive adenosin-A2a-reseptor antagonist SCH-58261 (10 nM-10 uM), og deretter cellenes levedyktighet ble målt (* p 0,05, ** p 0,01 vs. ikke-behandlede gruppe). (D) Behandling med siRNA targeting adenosin A2a-reseptorene til HCC827GR celler for 3 dager betydelig redusert celle levedyktighet HCC827GR celler (*** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppen).
Diskusjoner
GPCRs har tradisjonelt vært forbundet med mange av funksjonene til differensierte, post-mitotiske celler. På den annen side, er GPCR også uttrykt i prolifererende celler, og bidrar til embryogenese, vev remodellering og reparasjon, inflammasjon, angiogenese, normal cellevekst og kreft.
Blant dem, protease-aktiverte reseptorer (PARS), chemokine reseptorer og reseptorer for bioaktive lipider så som LPA og sfingosin-1-fosfat (S1P) har vært implisert i avvikende cellevekst i et bredt spekter av kreftceller. Videre nevropeptider som endotelin, bradykinin, neuromedin B, cholecystokinin og angiotensin II aktivere sine beslektede GPCRs å stimulere cellevekst i ulike celletyper, og spiller en avgjørende rolle i mange aggressive menneskelige kreftformer, deriblant småcellet lungekreft (SCLC), kreft i bukspyttkjertelen, hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC), og prostata kreft [18], [19]. Imidlertid har det vært få rapporter om den kritiske rollen GPCR i gefitinib-resistente NSCLC celler, for eksempel H1975 celler. En bedre forståelse av hvilken rolle GPCRs i NSCLC kan komme fra flere analyser for gen-uttrykk profilering. Microarray studier er sannsynlig å være nyttige verktøy for dette formålet. Derfor utførte vi en GPCR microarray analyse for gefitinib bestandig H1975 celler sammenlignet med normale menneskelige lunge fibroblast celler. Ved å profilere uttrykk for mRNA som koder GPCR, fant vi et stort antall GPCR overuttrykt i H1975 celler. Det har blitt erkjent at mange GPCR som ble overuttrykt i forskjellige krefttyper fremme veksten av tumorceller når det aktiveres ved å sirkulere eller lokalt produserte ligander. Blant GPCRs ble GRP87 oppført som den mest oppregulert GPCR i nåtiden GPCR array. Etter denne matrisen, validert vi oppregulert uttrykk for GRP87 mRNA og dens protein ved hjelp av RT-PCR og Western blotting, sammenlignet med de som ble observert i NHLF celler. I H1975 celler, GS, Gi- og Gq-coupled GPCRs ble overuttrykt i nesten like stor grad, mens noen Gi-koblede GPCRs ble nedregulert i H1975 celler.
Aktivering av A2a reseptorer har blitt rapportert å føre til immunosuppressive effekter, noe som reduserer anti-tumorimmunitet og således oppmuntrer tumorvekst. I adferdsstudier, har det vært antydet at A2a antagonister bør legges til immunterapeutiske protokoller for kreft for å forbedre svulst immunterapi. Disse forbindelser har allerede blitt vist å være trygg i forsøkene med A2a-antagonister i behandling av Parkinsons sykdom [20]. I denne studien har vi undersøkt om spesifikke agonister /antagonist som virker på GPCRs som ble oppregulert eller nedregulert i H1975 celler kan påvirke veksten av H1975 celler. Blant de oppførte GPCR, en selektiv antagonist av adenosin A2a-reseptoren, som var en av de kommersielt tilgjengelige ligander for GPCR overuttrykt i H1975-celler, ga en reduksjon doseavhengig i H1975 celleviabilitet. I likhet med den antagonist, behandling med siRNA rettet mot adenosin A2a-reseptorer dannet en betydelig reduksjon i celleviabilitet H1975. For ytterligere å undersøke hvilken rolle adenosin A2a reseptorer i gefiitnib-motstand mot NSCLC, genererte vi en annen gefitinib-resistente klonen ved å utsette gefitinib til gefitinib-sensitive NSCLC celler, HCC827 celler. Som H1975 celler, ble uttrykket av adenosin A2a reseptor mRNA dramatisk økt i geftinib bestandig HCC827GR celler i forhold til HCC827 og NHLF celler. Under disse betingelser, behandling med enten den selektive adenosin-A2a-reseptorantagonist eller siRNA målretting adenosin A2a-reseptorer produseres en betydelig reduksjon i HCC827GR cellevekst. Disse funnene antyder at, selv om ytterligere
in vivo studier
er fortsatt nødvendig, evnen til å blande seg med adenosin A2a-reseptorer kan gi unike muligheter for forebygging og behandling av NSCLC. På den annen side er selektive agonister for adenosin A2a-reseptoren, angiotensin II-reseptor-lignende 1, purinergiske reseptor P2Y G-proteinkoblet 2, prostaglandin I
2-reseptor (IP), 5-hydroksytryptamin reseptor 2B og arginin vasopressin reseptor 1A hadde ingen virkning på cellelevedyktighet H1975, noe som gjenspeiler de komplekse funksjoner av GPCR uttrykt i disse cellene. Mange av de ligander eller inhibitorer for GPCR som ble opp- eller ned-reguleres på H1975-celler var ikke tilgjengelig for denne studien. For eksempel, er det vurdert at GPR87, som var den største overuttrykt GPCR i H1975-celler, spiller en avgjørende rolle i den p53-avhengig overlevelse av kreftceller som er utsatt for skade på DNA [21]. Imidlertid er den spesifikke ligand og dens antagonist har ennå ikke blitt identifisert. Siden det er ingen tvil om at GPCR kan være sentrale aktører i reguleringen av ulike patofysiologiske reaksjoner, blant annet kreft utvikling og progresjon, er det sannsynlig at tilnærminger som involverer forstyrrelser RNA vil tillate oss å bedre forstå de spesialiserte funksjonene GPCR uttrykt i gefitinib-resistente NSCLC celler.
i konklusjonen, vi viste at et stort antall GPCR var oppregulert, mens noen ble nedregulert via funksjonelle crosstalk mellom EGFR nedstrøms og GPCR transkripsjon i utviklingen av gefitinib-resistens hos NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Liste over GPCR genet symboler i microarray. TaqMan Array Menneskelig GPCR kort som tillater oss å kvantifisere uttrykk for mRNA som koder GPCRs fra 50 underfamilier (343 reseptorer, ikke inkludert odorant, olfactory, gustatory og feromon-reseptorer), ble brukt
doi:. 10,1371 /journal.pone .0044368.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Effekter av flere GPCR-agonister på veksten av H1975-celler. H1975 cellene ble inkubert i 2 dager med hver GPCR ligand (1, 10 pM) og MTT-analysen ble deretter utført. Den cellelevedyktighet dataene representerer gjennomsnittet med S.E.M. av 5 uavhengige utvalg
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044368.s002 product: (PDF)
