Abstract
CRC kreft er en av de dødeligste sykdommer i vestlige land. For å utvikle prognostiske biomarkører for CRC (kolorektal kreft) aggressivitet, analyserte vi retrospektivt 267 CRC pasienter via en roman, flerdimensjonale biomarkør plattform. Bruke nanofluidic teknologi for qPCR analyse og kvantitativ fluorescerende immunhistokjemi for protein analyse vurderte vi 33 microRNAs, 124 mRNA og 9 proteinantigener. Undersøkelsen er gjennomført i hver enkelt dimensjon (mikroRNA, gen eller protein) ved hjelp av både multivariat Cox modellen og Kaplan-Meier metoden. Deretter forenklet vi sensurerte overlevelsesdata i binære responsdata (aggressive versus ikke aggressiv kreft). Deretter integrert vi dataene til en diagnostisk ranger med skiver invers regresjon for tilstrekkelig dimensjon reduksjon. Nøyaktigheten ble vurdert ved hjelp av arealet under mottakeren opererer karakteristiske kurven (AUC). Enkelt dimensjon analyse førte til oppdagelsen av individuelle faktorer som var signifikant prediktor for utfallet. Disse inkluderte syv spesifikke microRNAs, fire gener, og en protein. Når disse faktorene ble kvantifisert individuelt som predikator for aggressiv sykdom, den høyeste påvise arealet under kurven (AUC) var 0,68. Derimot, når alle resultatene fra enkelt dimensjoner ble kombinert i integrerte biomarkører, AUC ble dramatisk økt med verdier nærmer seg, og til og med overstiger 0,9. Enkelt dimensjon analyse genererer statistisk signifikante prediktorer, men deres prediktive styrker er suboptimalt for klinisk nytte. En roman, seirer flerdimensjonale integrert tilnærming disse manglene. Nylig avledet integrerte biomarkører har potensial til menings veilede valg av terapeutiske strategier for enkeltpasienter mens belyse molekylære mekanismer kjører sykdomsprogresjon
Citation. Mariani M, S He, McHugh M, Andreoli M, Pandya D, Sieber S, et al. (2014) Integrert Flerdimensjonal analyse er nødvendig for Nøyaktige Prognostiske Biomarkører i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (7): e101065. doi: 10,1371 /journal.pone.0101065
Redaktør: John Souglakos, Universitetet General Hospital i Heraklion og Laboratorium for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Hellas
mottatt: April 15, 2014; Godkjent: 03.06.2014; Publisert: 02.07.2014
Copyright: © 2014 Mariani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av en bevilgning fra Ruth C. Donovan Cancer Research Program og av en liberal donasjon fra Mr. og Mrs. Ruggles . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CRC er en av de dødeligste sykdommer over hele verden. Kaukasiske pasienter med lokal, regional eller metastatisk sykdom utstillings en 5-års overlevelse på 66%, 44% og 4%, henholdsvis [1]. Sykdom stadium ved tidspunktet for kirurgi er godt etablert som den viktigste prognostiske faktor i CRC. I de siste to tiårene, har median total overlevelse økt betydelig med innføring av nye cytostatika og biologisk terapi. Responsen på slike behandlinger avhenger av molekylære determinanter som forklaring har vært fokus for intens og produktive forskningsinnsats. Vi vet nå, for eksempel at kreft huser aktiverende KRAS-mutasjoner ikke svare på anti-EGFR terapi [2]. Men fortsatt gjenstår den hensikt å optimalisere behandlingsprotokoller basert på de unike molekylære egenskapene til en persons svulst unnvikende. Utvikling av nye biomarkører som sikkert kan identifisere pasienter med høy risiko for sykdomsprogresjon og død vil være spesielt nyttig for å bestemme de kliniske omstendigheter der adjuvant kjemoterapi er berettiget. Mens bruken av antimetabolitt 5-Fluorouracil (5-FU) er standardbehandling for pasienter med stadium III CRC, dets potensielle fordeler i forhold til risiko i stadium II CRC pasienter er et spørsmål om uenighet og debatt [3]. I fravær av en robust klinisk prediktor for sykdom utfallet, beslutningen om å behandle eller ikke behandle stadium II pasienter med 5FU kan ikke hvile på objektive og faste kriterier. Tidligere identifiserte prediktive biomarkører som hadde vist store løftet i denne arenaen inkludert telomerase, som skaper vekstfaktorer (TGFa og TGFB), epidermal vekstfaktorer (ErbB2 og ErbB3) og mucin (MUC1 og MUC2) har skuffet i studier av klinisk nytte [4].
Den tradisjonelle tilnærmingen til utvikling av biomarkører er avhengig av enkelt dimensjonale (mikroRNA, gen eller protein) analyse i et forsøk på å knytte en enkelt molekylære enheten til tumor atferd. Denne metoden ser ut til å ha nådd et høydepunkt som er suboptimalt for kliniske beslutninger. Tidligere flerdimensjonale tilnærminger har vist at gjennom en kombinasjon av biomarkører som kommer fra forskjellige dimensjoner bedre kunnskap om biologien til CRC kan oppnås [5], [6], [7]. I et forsøk på å gi mer tilpassede alternativer, har vi utviklet en ny metode som ytterligere fremskritt integrering og inkorporerer flere molekylære enheter fra alle tre molekylære dimensjoner (mikroRNA, gener og proteiner) samtidig for å generere nøyaktige prediktorer for utfall hos pasienter med CRC. Våre resultater viser klart overlegenheten av dette nye, flerdimensjonal tilnærming sammenlignet med de tradisjonelle verktøy av dimensjon enkelt analyse. Vi håper at nyoppdagede flerdimensjonale biomarkører vil gi grunnlag for vellykket triage og lagdeling av pasienter i prospektive kliniske studier samtidig avsløre molekylære agenter og stier som spiller fremtredende skumle roller i CRC sykdomsprogresjon.
Materialer og metoder
Gene og mikro-RNA uttrykk vurderes med nanofluidic teknologi
En klinisk kohort av 267 tykktarmskreftpasienter ble analysert i denne retrospektive studien. Etter godkjenning av Danbury Hospital Internal Review Board (DHIRB) og innsamling av relevant klinisk informasjon, ble FFPE- prøver hentet fra tykktarm kreft tilfeller som hadde blitt bevart mellom 2000 og 2008. Ifølge protokollen av studien (DH-17/12 ) inkludert full de-identifisering av pasientopplysninger, DHIRB fravikes behovet for informert samtykke. FFPE-prøver ble kuttet til 10 um tykkelse og to vevssnitt ble anbragt i et 1,5 ml rør. Til hvert rør, ble en milliliter xylen tilsatt for deparaffinization etterfulgt av blanding to ganger med en høy hastighet vortex i 3 minutter ved romtemperatur. Total RNA ble da automatisk hentet med Qiacube bruker miRNeasy FFPE kit (Qiagen, Valencia, CA) etter produsentens protokoll. RNA fra SW837 celler ble automatisk trukket ut med Qiacube bruker miRNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA) etter produsentens protokoll. RNA kvantitet og kvalitet ble vurdert av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analysen ble utført ved hjelp av 48.48 dynamisk array (Fluidigm Corporation, CA, USA) og en Biomark plattformen etter produsentens protokoll som tidligere beskrevet [8], [9].
Kvantitativ fluorescerende immunhistokjemi
Kvantitativ fluorescerende immunhistokjemi ble utført for protein analyse. Vevsprøver var forberedt på en Tissue Micro Array (TMA) format: representative tumorområder ble innhentet fra formalinfiksert parafin Embedded (FFPE) eksemplarer av primærtumor, og opptil tre representative replikere 3 mm-kjerner fra flere tumorvev ble tatt etter gjennomgang og merking av hematoxylin og eosin farget lysbilder av bord-sertifisert patologer (SS og PF). I alt ble 630 kjerner tatt og distribuert over 16 lysbilder fra 267 pasienter. FFPE-vev benyttes som kontroller i reaksjons følger normal tykktarm, nyre, lever, hjerne, bryst, lymfeknuter, skjoldbruskkjertel, hud, mandel, skjelettmuskel og blære sammen med brystkreft og ikke-småcellet lungekreft.
TMA lysbilder ble deparaffinized i xylen og deretter rehydrert i sekvensielt fortynnet etanol løsninger. Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming av lysbildene i en dampkoker i 30 minutter i en løsning av Tris-EDTA pH 8,0. Endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert ved å behandle lysbildene i Peroxidazed reagent (Biocare Medisinsk, Concord, CA) i 5 minutter. Ikke-spesifikk binding ble redusert ved inkubasjon med bakgrunn Sniper (Biocare Medical, Concord, CA) i 10 minutter. Glassene ble inkubert med de primære målet antistoffene og epiteliale og stromale cellemaske antistoff fortynnet i Da Vinci Grønn antistoff-fortynningsmiddel (Biocare Medical, Concord, CA) i 1 time ved romtemperatur. Detaljer om alle antistoffer som brukes er i tabell S1. Cyanine 5 (Cy5) direkte konjugert til tyramide (Perkin-Elmer, Boston, MA) på 1:50 fortynning ble brukt som fluorescerende deteksjon for alle de mål antigener.
Statistical Analysis
For enkelt dimensjon analyse ble total overlevelse beregnet fra diagnosedato til dødsdato eller dato sist sett. Medianer og livs tabeller ble beregnet ved hjelp av produkt grensen estimat av Kaplan og Meier metoden, og logg Rank test ble ansatt bare for å vurdere statistisk signifikans. Multivariat analyse vurderte klinisk rolle hver faktor matchet med andre kliniske variabler (alder, scene, gradering, type svulst og kjønn), etter Cox modell. For å forenkle spørsmålet om sensur, fjerner vi de pasientene som ble sensurert i løpet av 3 år og forvandlet overlevelsesdata i binær respons, enten aggressiv eller ikke-aggressiv. For hver faktor vist seg å være av betydning i multivariat analyse (p-verdi 0,05)., Arealet under kurven (AUC) i mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve ble anvendt for å vurdere diskriminerende effekt
For flerdimensjonal analyse, datasettet ble tilfeldig delt inn i opplæring og testing undergrupper, med 125 tilfeller i hver undergruppe. Flere biomarkører ble kombinert for å gi en diagnostisk poengsum som ble brukt som en prediktor for utfall. For å generere score, vi først brukt skiver inverse regresjon [10], [11] for å gjøre det tilstrekkelig dimensjon reduksjon der ingen informasjon om den betingede fordelingen av utfall ble tapt under dimensjonen reduksjon. Deretter ble en skalar diagnostisk stillingen beregnet fra de nedre dimensjonale data som er generert i det første trinn ved sannsynlighetsforhold statistikk som har vist seg å være optimal blant alle mulige funksjoner av multiple markører for binærsykdoms utfall [12]. Denne tilnærmingen aktivert utnyttelse av informasjon fra flere markører samtidig uten å måtte gjøre forutsetninger om fordelingen av markørene. Cox og Kaplan-Meier-modellene ble ansatt for å vurdere den statistiske betydningen av flerdimensjonale biomarkører i multivariat analyse som beskrevet ovenfor.
Resultater
Expression analyse av mikroRNA
De viktigste kliniske parametre av de 267 CRC pasienter som deltok i denne retrospektive analysen er vist i tabell 1. Alle prøvene ble samlet ved den første operasjonen før eventuell behandling. Som forventet er den viktigste kliniske faktoren for å forutsi utfallet var stadium av sykdommen. For pasienter med stadium IV progresjon var rask med en median overlevelse på 11 måneder, mens for pasienter ved tidligere stadier utfallet var bedre (Fig. 1). Alle pasientene ble deretter behandlet med den beste tilgjengelige omsorg og denne studien vil fokusere på rene prognostiske prediktorer og ikke til respons til bestemte behandlinger. Som et første skritt, skjermet vi en serie med 33 microRNAs å identifisere potensielle prediktorer for utfall i multivariat analyse inkludert alder og stadium i Cox modell. MicroRNAs ble valgt i henhold til antall siteringer i Pubmed bruker som søkeord begrepene «kolorektal kreft» og «mikroRNA». Ti microRNAs (MiR-532-3p, Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, MiR-193a-5p, MiR-145, MiR-375, Mir-29a, MiR-18a og Mir-200b) var statistisk signifikant med verdier av serien risiko ratio (RR) mindre enn 1 for hver, noe som betyr at høyt uttrykk var relatert til et godt resultat (tabell 2). For å støtte resultatene av Cox analyse ytterligere, ble data også vurdert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Fem kvintilen cutoffs (25, 33, 50, 67 og 75) ble brukt til å stratifisere pasienter for høyt og lavt uttrykk for hver mikroRNA og log-rank test servert å oppdage hvis forskjeller i resultatet var betydelig. Den kvintilen cutoff som gir den laveste p-verdi på log-rank test ble brukt som discriminator (tabell 2). Syv microRNAs (Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, MiR-375, Mir-29A, MiR-18a og Mir-200b) ble bekreftet å være betydelig ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og de tilsvarende tomter er vist i figur . 2.
I rød stadium I-II pasienter (n = 176), i grønn scene III pasienter (n = 82) og i blått stadium IV (n = 8).
Kaplan-Maier-analyse ble utført som deler de pasienter så høy (grønn) og lav (rød) innstilling. Survival tidsskala er i måneder. Alle forskjellene var signifikante og p-verdier er rapportert i tabell 2 (Log-rank test).
Expression analyse av gener
Nanofluidic teknologi tilbyr fordelen med å tillate analyse av microRNAs og deres målgener (targetome) i de samme RNA-prøven på grunn av det lave volum av hver enkelt qPCR-analyse. For å utføre denne analysen benyttet vi flere programmer (www.miRbase.org) [13] for å utarbeide en liste av gener som kan være målrettbar av de 33 microRNAs undersøkt i denne studien. Listen ble prioritert i henhold til et funksjonelt nettverk oppnådd med DAVID programvare (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [14] for å berike bassenget med handlings mål og mestre regulatorer av genuttrykk og apoptose. Etter en innledende analyse av 180 kandidater, fokuserte vi på 79 gener som uttrykk var synlig i et stort antall CRC kreftpasienter. Seks gener (MID1, INHBA, OSBPL3, BGN, DICER1 og FAP) var prediktorer i univariat analyse (data ikke vist), men bare MID1 forble signifikant etter multivariate korrigering og Kaplan-Meier analyse (Tabell 3 og Fig. 3). Som et andre tiltak for å kunne øke antallet av kandidatgener, analyserte vi for publikum datasettet GSE14333 rapportering transkriptomet analyse av 290 CRC kreftpasienter [15]. For hvert enkelt gen, ble data analysert og beregnet i en multivariat Cox-modellen som er beskrevet ovenfor (tabell 4). Prediktiv evne ble bekreftet ved Kaplan-Maier-analyse ved anvendelse av en prosedyre multiplum av kvintilen seleksjon for avskjæringen, som beskrevet ovenfor. De 45 gener med de laveste p-verdier i multivariat analyse ble vurdert i vår plattform av nanofluidic genuttrykk. Bare tre av 45 (7%) gener ble bekreftet som predikator for utfallet i både GSE14333 og vår klinisk setting i multivariat Cox regresjon og Kaplan-Meier analyse (ANO1, KANK4 og IGFBP3, tabell 4 og Fig. 3).
Kaplan-Maier-analyse ble utført som deler de pasienter så høy (grønn) og lav (rød) innstilling. Survival tidsskala er i måneder. Alle forskjellene var signifikante og p-verdier er rapportert i tabell 3 (Log-rank test).
Expression analyse av proteiner
For å gjennomføre analysen på proteinnivået, valgte vi 9 faktorer (TUBB3, ELAVL1, OSBPL3, IGFBP3, ANO1, HGF, GLI3, PPP2CA og ARNT2). TMA ble fremstilt fra de samme parafinblokker som benyttes for genet og mikroRNA analyse. Triplikate kjerner i hvert tilfelle var inkludert i TMA for å fange opp klonal heterogenitet, og hver TMA ble analysert i triplikat ved multiplekset, kvantitativt fluorescerende immunhistokjemi. Kjerner ble farget med DAPI (blå kanal), og stromal og epitelceller ble farget med anti-vimentin (grønn kanal) og anti-cytokeratin (gul kanal), henholdsvis. Antigener av interesse ble kjøpt i den røde kanal, og et representativt bilde av analysen for IGFBP3 og ANO1 er vist i fig. 4A. For hvert protein, ble uttrykket kvantifisert med AQUA programvare som utnytter en unsupervised algoritme for å kvantifisere uttrykk i definerte subcellulære avdelinger eller «masker». I vår studie, valgte vi fire masker: tumor (cytokeratin +), stromal (vimentin +), tumorkjerner (DAPI + /cytokeratin +) og tumor cytoplasma (DAPI- /cytokeratin +). For hver 3 mm kjerne, ble minst tre elektroniske undersegmenter (histospots) analysert. På grunn av replikere analyse, vi samlet opp til 18 AQUA score for hver pasient som ble deretter gjennomsnitt. GLI3, ARNT2 og HGF viste hovedsakelig kjernefarging i enkelte kreftceller, mens i andre, fargingen var overveiende cytoplasma. For å utnytte dette fenomenet, ble en indeks opprettet ved å dele atom over cytoplasma uttrykk. En verdi en var typisk for en sterk nukleær farging, mens en verdi mindre enn 1 antydet en overveiende cytoplasmatisk mønster av uttrykket. Uttrykk for alle proteiner og indeksen ble analysert med multivariat Cox regresjonsanalyse. Bare ekspresjon av ANO1 (i kreftceller og i kjerner av kreftceller) var signifikant i multivariat analyse (tabell 5 og 4B fig.)
A:. Fra topp til bunn de følgende signaler er representert: antigen interesse (rød kanal), cellekjerner (DAPI), tumorceller (cytokeratin), stromale celler (vimentin) og sammenslåtte bildet. B: Kaplan-Maier analyse av 267 pasienter i henhold til uttrykk av AQUA score til ANO1 inne i svulsten maske (ANO1_AQUA) og i kjernen av kreftceller (ANO1_Nuclear_AQUA). Kaplan-Maier-analyse ble utført som deler de pasienter så høy (grønn) og lav (rød) innstilling. Alle forskjellene var signifikante og p-verdier er rapportert i tabell 5 (Log-rank test).
Beregning av Predictive Nøyaktighet
Vi delte pasientene inn i to kliniske grupper av interesse å tillate en forenkling av sensurerte data til en binær reaksjon. De overlevende mindre enn tre år fra diagnose ble merket som å ha aggressiv sykdom, mens de overlevende i mer enn tre år ble ansett for å ha mer lat, ikke-aggressiv sykdom. Hver av de enkelte faktorene fra de tre dimensjonene ovenfor (mikroRNA, gen eller protein) ble testet som en prediktor for sykdom aggressivitet å bruke ROC-kurver med AUC beregningen. Selv om noen faktorer var statistisk signifikant i multivariat analyse, er hentet fra en enkelt biomarkør i en enkelt dimensjon maksimal AUC var bare 0,68 (ADAMTS5). Utnytte en slik svak prediktor for pasientbehandling ville være uakseptabelt som det er unøyaktig (enten falskt positive eller falskt negative) i omtrent en tredjedel av tilfellene.
Generering av flerdimensjonale biomarkører
Vi spekulert i at ved å kombinere informasjon fra forskjellige dimensjoner (mikroRNA, gene og protein), kan vi øke prediktiv nøyaktighet. Men skaper multidimensionality betydelige beregnings kompleksiteten og utfordringene. Mens det i én dimensjon analyse antall variable muligens i vårt tilfelle er forholdsvis begrenset på 188, flerdimensjonal analyse av to og tre variabler gir 17,578 og 1,089,836 kombinasjoner, respektivt. Kontrollere for type 1 feil ved hjelp kryssvalidering blir kritisk viktig som antall variabler stiger. Av denne grunn, når unntatt for 17 pasienter på grunn av ufullstendige data, vi tilfeldig tilordnet de resterende 250 pasienter til enten trening eller testing set (Tab. 1). Som et første skritt, vi tilfeldig valgte enten to eller tre variabler fra alle microRNAs, gener og proteiner som vi vurderte. Etter tilstrekkelig dimensjon reduksjon, ble variablene sammen til en ny diagnostisk poengsum, som inkluderte all informasjon av foreldrefaktorer. Beregning tydelig vist at ved å øke mengden av data fra ulike dimensjoner, de beregnede AUC øker i treningssettet (Fig. 5A). Etter beregning av alle 1,089,836 flerdimensjonale prediktorer, valgte vi kombinasjonene med høyest rangering av AUC. Vi tilsatte deretter en ytterligere biomarkør om gangen, en mikroRNA, gen eller protein, i det eksisterende kombinasjoner mens i betraktning alle mulige kombinasjoner, og beregnet AUCene igjen i treningssettet (Fig. 5B). Denne prosess ble gjentatt inntil AUC nådde et maksimum og mislyktes i å øke vesentlig ved tilsetning av ytterligere prediktorene inn i de eksisterende kombinasjoner. Disse maksimumsgrenser ble nådd når antall variabler innenfor hver kombinasjon nådd 10 i treningssettet (fig. 5B). Deretter analyserte vi de beste kombinasjonene i testsettet, og vi fant 15 flerdimensjonale biomarkører (MB) som viste AUC 0,83 i trening og testing sett (sammensetning er rapportert i tabell 6, 7 og 8) som støtter forestillingen om at flerdimensjonale biomarkører er mer nøyaktig enn noen enkelt personlig dimensjon prediktor. Fra denne listen, valgte vi de 4 mest nøyaktige flerdimensjonale biomarkører (MB1 til MB4), hver med AUC på ca 0,9 i både trening og testsett (Fig. 6A). Deres sammensetning er grafisk avbildet i fig. 6B. Disse biomarkører var også fremragende predikator for utfallet i Kaplan-Meier analyse (Fig. 6C).
I boksplott, fra bunn til topp, de er Q1-1.5 * IQR, Q1, medianen, Q3, og Q3 + 1,5 * Q3 hvor Q1 er første kvartil (25
th persentil), er Q3 tredje kvartil (75
th persentil), og IQR er interkvartilt (nemlig Q3-Q1). I A er gjort analyse med en enkelt variabel, med alle mulige kombinasjoner av to (n = 17 578) og tre variabler (n = 1,089,836). I B utføres analysen ved å legge til en ny variabel (genet, mikroRNA eller protein) til de tidligere beste kombinasjonene.
grafisk diagram av sammensetningen av MB1-4 (B). I blå, grønn og rød protein, er gener og mikroRNA rapportert. Kaplan-Maier analyse av trening og testing angitt i henhold til uttrykk av de beste 4 MB (C). Alle forskjellene var svært signifikant (Log-rank test) og er rapportert i tabell 7 og 8 for trening og testing sett, henholdsvis.
Diskusjoner
CRC kreft er fortsatt blant de farligste kreftformer. For klinisk ledelse, spesielt i stadium II og III sykdom, flere behandlingsalternativer er nå tilgjengelig. Som observert også i vår kliniske studien utfallet er hovedsakelig drevet av klinisk stadium ved diagnose med stadium IV pasienter en alvorlig prognose. Imidlertid, selv hos pasienter med tidligere stadier resultatet er ikke bare gunstig med en betydelig tilbakefallsrate. Funn av effektive biomarkører som kan veilede terapeutiske beslutninger ambisiøst søkt i håp om å oppnå best mulige resultater, minimere ikke nødvendige og giftige prosedyrer. En rekke studier har blitt utført mot dette formålet [2], [16], [17]. Den ideelle biomarkør å kjøre kliniske behandlinger bør være betydelig i multivariat analyse samtidig ha robust prediktiv nøyaktighet med noen falske positive og falske negative resultater. Noen begrensede suksesser er oppnådd med hensyn til valg av spesifikke terapeutiske regimer i henhold til toksisitet og effekt [2]. Men de fleste av disse lovende enkelte biomarkører har kommet til kort i kliniske studier [18]. Mer komplekse biomarkører har blitt opprettet, om enn i en enkelt dimensjon. En 12-gen panel var effektiv i å forutsi risiko for tilbakefall og respons på behandling i en stor klinisk studie av 1436 pasienter i stadium II og III CRC pasienter [19]. Men senere valideringsstudier ikke reprodusere de samme resultatene [20], siden akilleshæl av denne teknologien er fortsatt mangel på nøyaktighet i uavhengige valideringsstudier. I vår studie har vi til hensikt dimensjon som arten av den variable, som mikroRNA, et gen eller et protein. Vi tror at den manglende nøyaktighet bør være avhengig i det minste delvis fra det faktum at den 12-genet signatur ble oppnådd bare i genet dimensjon, slik nedbygging den mulige rollen som andre faktorer som mikroRNA og proteinet kan ha i den predikative av gener. Denne tidligere erfaringer bedt oss om å revidere måten prediktive biomarkører er bygget. Kreft aggressivitet er en kompleks egenskap i de fleste tilfellene. Det er som en multifaktoriell ligningen. For å gjøre mønsteret mer komplekse, slike flere faktorer kommer fra forskjellige dimensjoner som gener, proteiner, DNA-sekvenser og annen undergruppe av celler (kreft og stromal). Vår idé ble sentrere forutsigelse på en integrert fremgangsmåte for analyse, inkludert flere dimensjoner og flere faktorer samtidig. Vi tror at bare en integrert tilnærming kan komme nærmere løsningen av en multifaktoriell ligningen. Resultatene vi presenterer i denne studien støtter vår hypotese. I vår kohort av CRC pasienter, må vi først analysert et stort panel av mulige individuelle prediktorer som kommer fra hver av tre enkelts dimensjoner (mikroRNA, gen eller protein). Vi var faktisk i stand til å identifisere statistisk signifikant prediktor for utfallet som bestemmes av multivariat Cox analyse og Kaplan-Meier metoden. Noen av disse prediktorer har ikke blitt grundig undersøkt i CRC hittil. Som et eksempel, ble ekspresjon av ANO1 (anoctamine 1) funnet å være statistisk signifikant på genet og proteinnivå, re forsterkende nylige data som kommer fra analysen av datasettet GSE14333 [15]. Men AUC for ANO1 i vår analyse var ikke større enn 0,65, noe som betyr at som en driver av kliniske avgjørelser, ville ANO1 feilklassifiserer en konsistent antall pasienter. Dermed gjør statistisk signifikans ikke nødvendigvis oversette til klinisk nytte. Unnlatelse av å anerkjenne dette faktum kan forklare mye av skuffelse med enkelte biomarkører som stammer fra en enkelt dimensjon [4], [20].
Ikke fornøyd med AUC under 0,7 og i håp om å utvikle mer robuste prediktorer, vi søkt å kombinere våre data på nye måter. I dette manuskriptet, vi gir detaljer om en flerdimensjonal plattform som kombinerer nanofluidic teknologi med kvantitative fluorescerende immunhistokjemi å skape biomarkører med AUC nærmer seg, og til og med overstiger 0,9. Mens antall variabler som må analyseres er enorm, kan dette potent verktøysett samle flerdimensjonale data til en rimelig reagent kostnad for FFPE-prøver ($ 0,20 for genet /mikroRNA analyse, $ 0,85 per protein).
Utover forutsi klinisk utfallet, kan vår analyse markere molekylære førere av aggressivitet. For eksempel vises IGFBP3 i alle de fire øverste flerdimensjonale biomarkører. Dette antigenet er velkjent for forskere i CRC, selv om motstridende data er til stede i litteraturen med hensyn til dens virkninger [21]. På genuttrykk nivå i både GSE14333 og vårt datasett, ble høyt uttrykk for IGFBP3 relatert til dårlig resultat. Dette er i tråd med andre tidligere studier [21], [22], [23]. Vekten av bevis sikkert impliserer dette genet som en fremtredende føreren av CRC kreft aggressivitet tross for sin å være på kant med eldre studier kobler IGFBP3 uttrykk til en anti-proliferativ effekt på veksten av tykktarmskreftceller (anmeldt i [24]).
Bare to variablene var tilstede i 3 av de 4 øverste flerdimensjonale biomarkører: ADAMTS5 og HGF indeks. ADAMTS5 er medlem av ADAMTS (en disintegrinproteinet og metalloproteinase med thrombospondin motiver) protein familien. Enzymet er kodet av dette genet inneholder to C-terminale TS motiver og fungerer som aggrecanae å spalte aggrecan, en større proteoglykan av brusk [25]. Som enkelt faktor, i datasettet GSE14333, ble høyt uttrykk assosiert med dårlig utfall i flere sonder. Men i vår analyse, denne faktoren viste ingen signifikant trend i multivariat analyse som enkelt element. Litteratur på ADAMTS5 i CRC kreft er svært begrenset med bare en studie rapporterte dette genet som en av de mest hypermethylated i tumor sammenlignet med det omgivende normal tykktarmsslimhinne [26]. Den andre variable, HGF (hepatocytt-vekstfaktor) indeks, representerer en bane som er kjent for å bli aktivert i aggressive CRC. HGF har blitt grundig undersøkt som et potensielt nytt mål (anmeldt i [27]). Selv HGF uttrykk i immunoperoksidasefarging vises med en klar cytoplasmatiske mønster i CRC kreftceller [28], vår immunfluorescens analysen viste en kjernefysisk mønster som var av klinisk betydning. En tilsvarende kjernefysiske lokalisering av reseptoren av HGF c-Met har vært rapportert hos brystkreftceller, der slike overekspresjon ble knyttet til økt metastatisk potensial og aggressiv sykdom [29].
I sammendraget, er CRC kreft aggressivitet en komplekset egenskap som ikke kan forutsies med passende nøyaktighet ved anvendelse av et individ, enkelt dimensjonsfaktoren (mikroRNA, gen eller protein). I motsetning til en flerdimensjonal integrert tilnærming som benytter data fra mikroRNA, gen- og proteinanalyse kan generere nøyaktige prediktor for biologisk atferd, fremme bedre kliniske behandlingen av CRC, og skinne et søkelys på molekyler og molekylære stier som er forbundet med og potensielt årsaken til dårlig resultat.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Liste over antistoffer, leverandører og sluttkonsentrasjon brukes
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101065.s001 plakater (docx)
Takk
Dette arbeidet er dedikert til minne om Renato Andreoli som gikk bort for tykktarmskreft i en alder av 57.
