Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis og er fortsatt den mest utbredte. Samspillet mellom PI3K /AMPK /AKT og MAPK trasé er en avgjørende effektor i lungekreft vekst og progresjon. Disse signalene transduksjon proteinkinaser tjene som gode terapeutiske mål for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) som omfatter inntil 90% av lungekrefttilfellene. Her beskrev vi enten 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), en aktiv triterpenoid derivat av
Poncirus trifoliate
kan vise kreft egenskaper ved å regulere disse signalene og modulere forekomsten av multiresistens hos NSCLC celler. Vi fant at 21α-MMD inhiberte vekst og kolonidannelse av lungekreftceller uten å påvirke den normale lunge celle-fenotype. 21α-MMD oppheves også den metastatisk aktivitet av lungekreftceller gjennom inhibering av cellemigrering og invasjon, og induserte G
0 /G
en cellesyklus-stans med økt intracellulær ROS generering og tap av mitokondriemembranintegritet. 21α-MMD regulert uttrykk for PI3K /AKT /AMPK og MAPK signal som kjørte oss til å evaluere sin aktivitet på multiresistens (MDR) i lungekreftceller videre ved å spesifisere på P-glykoprotein (P-gp) /MDR1-forening. Ansette de etablerte paclitaxel-resistente A549 celler (A549-pacr), fant vi videre at 21α-MMD induserte en MDR reversering aktivitet gjennom hemming av P-gp /MDR1 uttrykk, funksjon, og transkripsjon med gjenvunnet paclitaxel følsomhet som kan avhengig relateres til regulering av PI3K /mTOR signalveien. Samlet utgjør disse funnene viser, for første gang, den mekanistiske evaluering
in vitro
av 21α-MMD viser veksthemmende potensial med innflytelse på MDR reversering i humane lungekreftceller.
Citation : Aldonza MBD, Hong JY, Bae SY, Song J, Kim WK, Oh J et al. (2015) Undertrykkelse av MAPK signalering og Reversering av mTOR-Dependent MDR1-Associated multiresistens ved 21α-Methylmelianodiol i lungekreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10,1371 /journal.pone.0127841
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 28 august 2014; Godkjent: 21 april 2015; Publisert: 22 juni 2015
Copyright: © 2015 Aldonza et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning (2005 og 12172MFDS989) fra Ministry of Food and Drug Safety og Foundation National Research of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MEST) (No. 2009-0083533)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste kreftformen i verden i flere tiår, og det står for ca 1.38 million dødsfall hvert år for både menn og kvinner i USA alene. Prognosen forbundet med sykdommen er svært dårlig forsinke diagnosen til sent avanserte stadier og behandling er begrenset, noe som resulterer i nesten 90% dødelighet på grunn av behandlingssvikt forårsaket av uoppdaget metastaser progresjon [1]. Naturlige produkter har blitt brukt som medisinsk terapi for århundrer med så mange som 70% av alle legemidler som er godkjent for klinisk cellegift, samt for kreftbehandling lunge mellom 1981 og 2002 som består av enten naturlige produkter eller kjemisk og syntetiske derivater basert på naturlige produkter. [2]. Imidlertid er mekanismen ved hvilken de fleste naturlige produkter oppviser deres terapeutiske potensial mindre godt forstått. Triterpenoids har tatt en økende oppmerksomhet i det siste i lunge kreftbehandling fordi de rapporterte chemopreventive og terapeutisk potensial både
in vitro Hotell og
in vivo product: [3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) er en naturlig triterpenoid og en isomer av 21-methylmelianodiols først isolert fra fruktene av
Poncirus trifoliata plakater (Rutaceae), som lenge har vært brukt i orientalsk medisin som et middel for allergisk betennelse. I de siste rapportene, 21α-MMD vises funksjonelle anti-inflammatorisk aktivitet [5]. Imidlertid har det ikke vært noen rapport ytterligere evaluere sin kreft potensial og virkningsmekanismen i lungekreft.
Cancer survival-assosiert signalveier, inkludert phosphoinositide 3-kinase (PI3K) /AKT /mammalian target of rapamycin (mTOR ) og mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) og kreft metastaseassosierte AMPK trasé spille sentrale roller i reguleringen av legemiddelinduserte funksjonelle aktiviteter som DNA-skader indusert apoptose, celleveksthemming, og anti-metastatiske /progresjon verktøy [6 , 7], med uttalt avgjørende funksjonell regulatorisk aktivitet i lungekreft celleproliferasjon og overlevelse [8]. De nøyaktige molekylære mekanismene som er ansvarlig for de fleste av triterpenoid-indusert kreft aktiviteter som involverer disse klassiske banene har ennå ikke klarlagt i detalj for å ytterligere innlemme terapeutiske strategier for bedre resultater.
En annen sentral årsak til behandlingssvikt i lungekreft er forekomsten av multimedikamentresistens (MDR), den viktigste mekanisme hvorved mange kreftformer blir resistente mot et bredt spektrum av kjemoterapeutika. PI3K /AKT og MAPKs signale har vært mye involvert i utviklingen av MDR i lungekreft. Stimulering av disse banene gjør lunge kreftceller resistente mot cytotoksiske kjemoterapeutiske stoffer som paclitaxel, å påvirke cellulære funksjon [9,10] videre. Følsomhet for ulike kjemoterapeutika varierer mye fra pasient til pasient. Imidlertid kan man molekylære mekanismen påpekes å effektivt utforme begrunnelsen kjemoterapeutiske kombinasjonsbehandlinger, det vil si ved å målrette den MDR1 (ABCB1) genet kodet P-glykoprotein (P-gp), ansvarlig for å pumpe ut en rekke xenobiotics og endogene stoffer fra innsiden til det ekstracellulære område av celler [11]. Nye bevis har lagt vekt på samspillet mellom mTOR signal og P-gp /MDR1-mediert MDR i levercellekarsinom og endetarmskreft [12,13]. Disse slags foreninger har ført til funksjonelt karakterisere potensialet reguleringsmekanisme for å målrette den PI3K /AKT og MAPKs sti og påfølgende svekkelse av P-gp aktivitet [14,15]. I tillegg har en rekke studier har også antydet utvikling av legemidler basert fra flavonoider og triterpenoids som kan målrette disse signalene til påfølgende skjema en kategori av P-gp-hemmere og øke aktiviteten av flere kreftmedisiner, slik som paclitaxel og doxorubicin [16 -18].
Hensikten med denne studien var derfor å mechanistically identifisere virknings av 21α-MMD på humane NSCLC-celler og videre relatere sin reguleringsmekanisme på cellevekst og overlevelse relaterte signaler som den PI3K /AKT /AMPK og MAPKs med P-gp /MDR1-forbundet MDR forekomst i et lungekreft fenotype. Karakterisering av virkningsmekanismer av 21α-MMD kan føre til nye innsikter av terapeutisk utvikling for å bekjempe vekst, metastatisk aktivitet, samt forekomst av MDR i humane lungekrefttilfellene.
Materialer og Metoder
Reagenser
Trikloreddiksyre (TCA), (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), sulforhodamin B (SRB), propidiumjodid (PI ), RNase A, paclitaxel, 5-fluorouracil (5-FU), muse-monoklonalt anti-β-aktin-antistoff, diklor-dihydro-fluorescein-diacetat (DCFH-DA), rhodamin-123, krystallfiolett, N-acetyl-L- cystein (NAC), og andre reagenser, med mindre annet er angitt ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640 medium, føtalt bovint serum (FBS), antibiotika-antimykotisk oppløsning, og trypsin-EDTA ble innkjøpt fra Invitrogen (Grand Island, NY, USA). mus monoklonalt anti-fosfo-ERK (Tyr 204), anti-c-myc, og kanin-polyklonalt anti-cyklin A, anti-cyklin B1, anti-cyclin E, anti -CDK2, anti-CDK4, anti-Rb og anti-fosfo-Rb, anti-ERK 1/2, anti-p38 MAPK, anti-fosfo Akt, anti-Akt, anti-fosfo-mTOR, anti-mTOR ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Mus monoklonalt anti-fosfor-JNK /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), anti-JNK /SAPK, anti-fosfor-p38 (Thr 180 /Tyr 182), anti-AMPK, anti-fosfor-AMPKα (Thr 172), anti-PI3K, og anti-fosfor-PI3K P85 (Tyr 458) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Alexa Fluor 488-merket kylling anti-kanin IgG ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Mus monoklonalt anti-P-gp og fluorescein (FITC) -merket monoklonalt anti-P-gp ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Den kationiske lipofile fargestoff tetramethylrhodamine etylester (TMRE) ble kjøpt fra Molecular Probes (OR, USA). ON-TARGETplusTM (SMARTpool) mTOR og krafse sirnas ble kjøpt fra Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Technologies (Suwanee, GA, USA). Testforbindelsen, 21α-MMD, ble isolert fra fruktene av
Poncirus trifoliata
som tidligere beskrevet [19] og levert av Dr. S. H. Lee, en medforfatter, ved College of Pharmacy, Yeungnam University, Korea.
Cellelinjer og kultur betingelser
Menneskelige lungekreftceller (A549, H460, H1299 H358 og H292) , humane normale lungeceller (L132 og MRC-5), humane brystcancerceller (MDA-MB-231), human ductal bryst epitelial tumorceller (T47D), humane leverkreftceller (SK-HEP-1), og human gastrisk kreftceller (SNU-638) ble levert av koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Paclitaxel-resistente A549 celler (A549-pacr) ble utviklet av vår gruppe fra foreldre A549 celler gjennom kontinuerlig eksponering for gradvis økende konsentrasjoner av paclitaxel opprettholde kontinuerlig vekst og fine foreldrelignende morfologi [20]. Cellene ble dyrket i DMEM (for MRC-5, MDA-MB-231 og SK-HEP-1-celler) og RPMI-1640 (for A549, A549-pacr, H358, H1299, H460, H292, T47D, og SNU -638 celler) supplert med 10% varme-inaktivert FBS og antibiotika-antimykotika (PSF; 100 enheter /ml penicillin G-natrium, 100 ug /ml streptomycin, og 250 ng /ml amfotericin B). Cellene ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktig atmosfære.
celleproliferasjon Assays
celleproliferasjon ble evaluert ved hjelp av MTT kolorimetrisk analyse med unntak av den innledende screening av den anti-proliferative aktiviteten til
P
.
trifoliata
aktive forbindelser som ble utført av SRB analysen. Celler ble sådd ut i en tetthet på 3 til 5 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater med et totalvolum på 200 pl /brønn og ble tillatt å feste over natten. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD, H
2o
2, medikamenter, som individuelt eller i kombinasjon, eller DMSO kontroll kontinuerlig ved de angitte tidsforløp. Etter behandling ble cellene fiksert med 10% TCA-løsning og ble utsatt for SRB eller MTT-analyser. For MTT-analysen ble cellene inkubert i MTT (0,5 mg /mL) inneholdende dyrkningsmedium ved 37 ° C i 4 timer. Supernatant mediet fjernet og DMSO (200 ul) ble tilsatt til hver brønn og blandet fullstendig å oppløse MTT. For SRB-analysen ble cellene inkubert med 0,4% SRB-løsning i 30 minutter. Den ubundne SRB ble fjernet raskt ved vasking av brønnene fem ganger med 1% eddiksyre og deretter lufttørket. 100 ul Tris-buffer (0,01 M, pH 10,4) ble tilsatt og ristet forsiktig i 5 minutter på en mekanisk rister. Absorbansen ble målt ved 570 nm for MTT analyse mens 515 nm for SRB analysen med felles bakgrunn subtraksjon ved 650 nm (zero day eller replikere kontroll) av Versamax mikroplateleser (Molecular Devices Inc., Toronto, Canada). Absorbans verdier ble uttrykt som en prosentandel av den for ubehandlede eller DMSO kontrollceller, og konsentrasjonen av testede medikamenter som ble beregnet med formelen% levedyktighet = ((Ave. Abs.Drug-Ave.Abs.Zero dag) /(Ave. Abs.Control-Ave. Abs.Zero Day)) x 100. IC
50 verdier ble beregnet som stoff som hemmer cellevekst med 50% sammenlignet med kontroller ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse (prosent overlevelse vs. konsentrasjon) . Alle forsøkene ble utført ved hjelp av fire replikater og gjentatt minst tre ganger på en parallell måte i hvert medikament /konsentrasjon av forbindelsen.
Colony Forming Assay
monolag av celler ble behandlet i 20 timer med 21α- MMD i forskjellige konsentrasjoner, og deretter høstet, telt og utsådd i 24-brønners plater i en tetthet på 1500 celler per brønn. Etter en til en og en halv uke, ble adherente makroskopiske kolonier ble vasket med PBS, fiksert ved anvendelse av 2% paraformaldehyd og farget med krystallfiolett (0,5% w /v) og deretter tellet visuelt eller ved hjelp av bilde J programvare.
legemiddelkombinasjonen Analyse
celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater med økende konsentrasjoner av 21α-MMD, paclitaxel og 5-FU, enten alene eller i kombinasjonen på deres ekvipotent molarforhold samtidig. Vekstinhibitoriske aktivitet av kombinasjonene ble målt ved MTT-analyse. De kombinerte effekter ble analysert ved hjelp av medianeffektanalyse metode og ved beregning av kombinasjonsindeksen (CI) under anvendelse av ligningen: KI = D
1 /(D
x)
1 + D
2 /(D
x)
2, hvor D
1 og D
2 er konsentrasjonene av kombinerte forbindelse og medikament som oppnås den forventede effekten, og (D
x)
1, og (D
x)
2 er de konsentrasjonene som oppnår lignende virkninger når forbindelsen blir brukt alene. 50% hemming ble valgt som indikator på effekt. Den beregnede CI ble deretter sammenlignet med rapporterte referanseverdier [21].
Cell Cycle Analysis og BrdU innlemmelse analysen
Analyse på virkningene av 21α-MMD på cellesyklus distribusjon ble utført ved hjelp av metoden tidligere beskrevet [22]. Celler ble behandlet med eller uten 21α-MMD i 24 timer i 10% FBS-supplert medium. Cellene ble høstet, vasket to ganger, og fiksert i 70% kald etanol over natten ved -20 ° C. Etanol-fikserte celler ble pelletert, vasket med iskald PBS og resuspendert i fargeløsning inneholdende 50 mikrogram /ml PI, 0,1% Triton-X-100, 0,1% natrium-citrat, og 100 ug /ml RNase. Etter 1 time med inkubering ved værelsetemperatur i mørket, ble fluorescens-aktiverte celler, sortert og cellulært DNA-innhold analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av FACSCalibur strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) utstyrt med en argon-laser og data ble evaluert ved hjelp av Cellquest 3.0.1 programvare (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Minst 20.000 celler ble brukt for hver analyse. Endringer i andelen av cellefordeling i hver fase av cellesyklusen ble bestemt, og resultatene vises som histogrammer. Andelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen ble deretter tatt opp med i det minste tre eksemplarer, og uttrykt som gjennomsnitt ± SD. I tillegg ble en colometric BrdU-inkorporering assay (Abcam) gjennomført for å måle graden av DNA-syntese. I korthet ble cellene behandlet med eller uten 21α-MMD i 24 timer i samme medium som ovenfor. BrdU tilsettes til celler dyrket på mikroplater, fulgt av 4 timers inkubasjon for å inkorporere BrdU i DNA til prolifererende celler. Kultursupernatant ble fjernet, fulgt av fiksering. Cellene ble deretter inkubert med et anti-BrdU-antistoff konjugert til peroksidase. Bundet BrdU er oppdaget av et substrat reaksjon og kvantifisert ved absorbans måling ved 350 nm.
Måling av intracellulær ROS
Intracellulær ROS ble målt ved flowcytometri (Becton Dickinson, FACSCalibur) som beskrevet tidligere [ ,,,0],23]. I korthet ble cellene sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 celler /ml i sterilt 60 mm skål i 24 timer og ble behandlet med eller uten 21α-MMD i 24 timer for å detektere ROS endringer. Celler ble høstet og vasket to ganger og farget med 1 ml DCFH-DA ved 10 uM konsentrasjon, som ble anvendt som probe for å vurdere ROS produksjon. Celler ble deretter inkubert ved 37 ° C i 40 minutter og topp eksitasjonsbølgelengden for oksydert DCFH-DA ved 488 nm med emisjon ved 525 nm ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. ROS-produksjon ble uttrykt som midlere fluorescensintensitet (MFI) beregnet ved hjelp av Cell søken programvare. Påvisning av ROS ble også undersøkt av fluorescens mikroskopi. I korte trekk ble celler sådd med en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml i dekkglass retter og inkubert over natten for å festes. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD eller NAC, enkeltvis eller i kombinasjon, i 24 timer ved 37 ° C. Dekkglass ble fjernet fra serviset og cellene ble farget med 40 mikrometer DCFH-DA for 40 min. Cellene ble vasket to ganger med PBS for å fjerne overskudd av fargestoff. Dekkglass ble montert på glassplater og bildene ble tatt ved hjelp av en fluorescens mikroskop ved 200X forstørrelse.
Måling av mitokondrie transmembranpotensial (Δѱm)
Endringer i mitokondrie potensialet ble vurdert ved hjelp av fluorescerende potensiometrisk fargestoff TMRE. Den kationiske lipofile fargestoff TMRE virker ved å skrive inn i cellen i form av en ester som deretter hydrolyseres og omdannes til tetramethylrhodamine, som er reversibelt akkumulert i den negativt ladede mitokondrielle matriks avhengig av mitokondriell transmembranpotensialet som utviser potensielle avhengig akkumulering i mitokondriene. For å analysere Δѱm etter 21α-MMD behandling ble cellene vekst ved en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn i 24 timer i 24-brønners sterilt kulturplate ble behandlet med eller uten 25 mM av 21α-MMD for 24 h. Tjue minutter før slutten av inkubasjonsperioden ble cellene vasket med PBS og TMRE fargestoff ved 100 nM ble påsatt i 10 minutter ved 37 ° C. Cellene ble trypsinert og høstet med kald PBS, fulgt av måling av fluorescens-intensitet ved strømningscytometri (Becton Dickinson, FACSCalibur) og analysert ved hjelp av Cellquest 3.0.1 programvare.
cellemigrering og bølgen Assays
forandringer i cellemigrering ble bestemt og Transwell analyser uten inkorporering av Matrigel. For migrasjon transwell analysen ble cellene sådd ut på forkamrene av 24-Transwell plater med 200 mL medium serumsultede (uten FBS). Etter behandling med forskjellige midler, ble cellene venstre overtid for å migrere til det nedre kammer inneholdende 800 uL medium med 10% FBS for å indusere kjemotaksis. Migrerte celler ble visualisert ved farging med krystallfiolett (0,5% w /v) etter vasking med PBS og fiksering med metanol. Bilder ble tatt og analysert ved hjelp Juli FL mikroskop hjulpet med bilde J programvare. Celle invasjon assay ble utført i 24-brønners plater med Transwell polykarbonat (PVDF) filtre (8 um porestørrelse, Corning, USA). Matrigel ble fortynnet til 1 mg /ml med serumfritt dyrkningsmedium og anvendes på innsatsen i forkamrene av flere brønner for invasjonen analyseplaten. Celler med en tetthet på 2 x 10
4 celler per brønn ble sådd inn i det øvre kammer i transwellenheten i 200 ul serumfritt kulturmedium. Det nedre kammer av enheten ble tilsatt med 800 ul dyrkningsmedium supplert med 10% FBS for kjemotaksi induksjon. Etter inkubasjon med eller uten 21α-MMD (5 uM; IC
50) i 24 timer ved 37 ° C, mediet i det øvre kammer ble sugd ut, og en bomullsdott ble anvendt for å fjerne cellene på oversiden av membranen. Celler som invaderte til undersiden av membranen ble farget med krystallfiolett (0,5% w /v) og visualisert og avsluttet etter JULI FL mikroskop. Alle resultater er uttrykt som prosent av migrerte eller invaderte celler sammenlignet med kontroll (ubehandlede celler).
Rhodamine-123 (Rho-123) Akkumulering Assay
endringer i utstrømningen funksjon P-gp i A549-pacr celler ble bestemt parallelt med endringene i akkumulering av Rho-123 fargestoff. Celler ble sådd inn i 30 mm skåler i en tetthet på 1 x 10
5 celler pr tallerken. Cellene ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD på 24 og 48 timer. 0,5% DMSO ble anvendt som kontroll. Etter forbehandling ble cellene inkubert med 1 pg /ml av Rho-123 fargestoff i kulturmedium ved 37 ° C og 5% CO
2 i mørke i 90 min. Etter Rho-123 opphopning ble cellene trypsinert fra Subkonfluente monolag av celler i kulturskåler, og cellepelleten ble vasket to ganger med iskald PBS. Cellene ble deretter analysert umiddelbart med FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) er utstyrt med en 488 nm argon laser. Konsentrasjonen av Rho-123 i hver prøve ble bestemt fra fluorescensmålinger ved bygging av Rho-123 standardkurve. Konsentrasjonen av intracellulær Rho-123 ble normalisert med mengden av protein og uttrykt som nmol /g protein. Den grønne fluorescens fra Rho-123 ble målt ved anvendelse av et 530 nm båndpassfilter [24]. Utstrømningen funksjon av P-gp ble overvåket i form av reduksjon av eksport av Rho-123 med inkorporering av foreldre A549 celler brukt som negativ kontroll.
Immunocytochemistry
P-gp lokalisering, immunfluorescens, og DNA fluorescerende observasjon i A549 /A549-pacr celler ble observert ved bruk av Zeiss LSM 780 ApoTome mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). Den A549 /A549-pacr celler ble sådd ut i 30 mm retter med sklier og inkubert over natten. Cellene ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD eller legemiddelfritt medium i 48 timer. Alle vaskinger ble utført med PBS og alle inkubasjoner ble utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Cellene ble vasket to ganger. Etter behandling inkubering ble cellene fiksert med 4% para-formaldehyd (i PBS) i 15 minutter og deretter blokkert med 1% BSA (i PBS) i 1 time ved romtemperatur, ble cellene inkubert med P-glykoprotein primært antistoff ved 4 ° C natten over, deretter vasket ytterligere to ganger. Permeabilization med Triton X-100 var ikke inkludert ettersom det mål-proteinet, P-gp, er et transmembranprotein. Etter over natten inkubering ble cellene inkubert med FITC-konjugert sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur. DAPI (0,5 ug /ml) ble brukt for å counterstain kjerner og lagret ved 4 ° C før mikroskopi.
Protein lysater, Western blotting, og Immunoutfelling
Cellene ble sådd ut i sterile 100 mm skåler i 24 eller 48 timer og ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD. For å bestemme nivået av målproteinet uttrykk, ble hel-celleekstrakter fremstilt. Behandlet eller ikke-behandlede celler ble lysert og protein quantifications ble bestemt ved hjelp av Bradford assay [25]. Proteiner ble isolert ved lyseringsbuffer (Beyotime, Kina) [20 mmol /liter Tris (pH 7,4), 250 nmol /L NaCl, 2 mmol /L EDTA (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 ug /ml aprotinin , 0,005 mg /ml leupeptin, 0,4 mol /L fenylmetylsulfonylfluorid, og 4 mmol /L NAVO
4] etterfulgt av spinning av lysatene på 14.000 rpm i 10 min ved hjelp av Thermo Sorvall Legend Micro 21R kjølesentrifuge (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) for å fjerne uoppløselig materiale og målt ved anvendelse av Nanodrop spektrofotometer 1000 (Thermo, USA). Cellene ble ødelagt ved ultralydbehandling, og ekstrahert ved 4 ° C i 30 minutter. Homogenatene ble sentrifugert ved 14000 rpm i 30 minutter for å fjerne mitokondrier og andre uoppløselige fragmenter og supernatantene ble deretter igjen sentrifugert som ovenfor for å sikre fullstendig fjerning av mitokondrier. Supernatanter fra hel-cellelysater ble samlet og holdt ved -80ºC. Det totale protein (100 ug) i hvert cellelysat ble løst i forskjellige prosentandeler av geler matchet med molekylvektene av protein-mål ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE), og ble elektro-overført på PVDF-nitrocellulosemembraner. Membranene ble inkubert med blokkeringsbuffer (5% fettfri tørrmelk i fosfatbufret saltvann-0,1% Tween 20, PBST, pH 8,0) i 2 timer ved romtemperatur og ble videre inkubert med spesifikke antistoffer fortynnet i TBST over natten ved 4 ° C . Etter vasking med TBST tre ganger, ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Visualisering av immunkomplekser ble utført ved hjelp av PowerOpti-ECL-kit (Animal genetikk Inc., Korea) og en LAS 4000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan).
RNA Utvinning og Real-Time Reverse transkripsjon-PCR
RT-PCR og sanntids RT-PCR ble utført for å evaluere MDR1 mRNA, cyklin E, og CDK2 mRNA genekspresjon etter behandling med eller uten 21α-MMD eller siRNA som angitt. -Celler ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /skål på 100 mm skåler ble behandlet med 21α-MMD for forskjellige tidsforløp. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med PBS, og deretter lysert med TRI-reagens for innledende RNA isolert trinn. RNA ble ekstrahert ved tilsetning av kloroform, og det isolerte RNA ble utfelt med isopropylalkohol. RNA-pelletene ble vasket med 70% etanol, lufttørket, og deretter løst opp i nuklease-fri vann. Absorbansen ble målt ved 260 og 280 nm for å bestemme konsentrasjonen og renheten av RNA. Det totale RNA (1 til 2 ug) ble reverstranskribert ved å bruke AMV revers transkriptase og oligo (dT) 15 primer. En polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført i en reaksjonsblanding inneholdende cDNA, 0.2 mM dNTP blanding, 10 pmol av mål-spesifikke primere med sekvenser som er oppført som følger: MDR1 (forover: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′, omvendt: 5′ -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′), mTOR (forover: 5′-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA-3′; omvendt: 5′-TTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′), cyclin E (fremover: 5′-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA-3′; omvendt: 5′-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3′), CDK2 (forover: 5′-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3′; omvendt: 5′-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3′) og 0,25 U av Taq DNA polymerase hjelp GeneAmp PCR system 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) for å amplifisere cDNA. Terskelen syklusen (CT) verdier ble bestemt. De relative mRNA uttrykk nivåer ble normalisert til enten β-aktin (forover: 5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′; omvendt: 5′-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC-3′) eller GAPDH (forover: 5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′; omvendt: 5′ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3) som angitt, ved å dele det ved de midlere Ct-verdiene for intern kontroll for at prøven (Δ-Ct). De normaliserte transkripsjonsnivåer ble uttrykt relativt til prøven oppnådd fra DMSO kontroll (ΔΔ – Ct), og den relative RNA-ekspresjonsnivået ble presentert som to-Δ-Ct [26]. PCR-produktene ble separert ved 2% agarosegel-elektroforese. Gelen ble farget med 10 000 ganger utvannet SYBR trygg fargeløsning og visualisert under en UV transilluminator (Alpha ImagerYM, Alpha Innotech Corp, USA). Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av en MiniOpticon system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ved anvendelse av 5 ul av revers transkripsjon produkt, 10 ul av iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 0,5 ul av primere og prober i et totalvolum på 20 ul. Standard thermal cycler betingelser ble anvendt som følger: 95 ° C i 5 minutter før den første syklus, 95 ° C i 10 sek, 56 ° C i 30 sekunder, gjentatt 40 ganger
Transient transfeksjon av Lie interfererende RNA. (siRNA)
stanse av mTOR med siRNA (25 nM) ble oppnådd ved hjelp DharmaFECT transfeksjonsteknologier reagenser etter instruksjons manual for transient transfeksjon i A549-pacr celler. Scramble siRNA (25 nM), brukt som kontroll, ble også gitt. Blandingen reagens ble tilsatt til hver brønn per skål inneholdende 200 ul av serum-fri og antibiotika-fritt medium for et totalvolum på 300 mL, og cellene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Et like stort volum av medium ble deretter tilsatt til hver brønn. Etter transfeksjon i 24 t etter plating ble cellene anriket med 10% FBS, ble inkubert i ytterligere 24 timer med 25 uM av 21α-MMD og cellene ble oppsamlet og underkastet analyse. Knockdown av mTOR-ekspresjon ble undersøkt ved immunblotting som beskrevet ovenfor ved anvendelse av anti-mTOR-antistoff. Den mTOR siRNA sekvensen var 5′-AAGAAUCAAAGAGCAGAGUGC-3′.
Statistiske analyser
Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD for det indikerte antall uavhengig av hverandre utførte forsøkene og analysert ved hjelp av en t-test ved hjelp av ikke-parametriske Mann-Whitney U-test for verdier som ikke var normalfordelt, en-veis ANOVA, og Spearman rang korrelasjonstester eventuelt ved GraphPad Prism v5.01 programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Verdier med
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Anti-proliferative effekter av forbindelser fra
P
.
trifoliata
på menneskelige kreftcellelinjer
Kumariner og triterpenoids fra fruktene av
P
.
trifoliata
har tidligere blitt beskrevet å vise potente kreft effekter mot en rekke kreftcellemodeller [27-29]. Basert på denne informasjonen,
in vitro
cytotoksiske aktiviteter av 13 forbindelser isolert fra fruktene av
P
.
trifoliata
mot MDA-MB-231, T47D, SNU-638, SK-HEP-1, og A549 humane kreftcellelinjer ble evaluert ved anvendelse av SRB-analysen. Som vist i tabell 1, triterpenoids viste de mest lovende ved å inhibere et panel av kreftceller med IC
50-verdier på mindre enn 50 mikro-molar områder. Blant testforbindelsene, triterpenoids 25-methoxyhispidol A, 21α-methylmelianodiol (21α-MMD, figur 1A), og 21α, 25-dimethylmelianodiol oppviste den mest aktive anti-proliferativ aktivitet. Dataene antydet at anti-proliferativ aktivitet av 21α-MMD er potent når testet på A549 humane lungekreftceller, som ledet oss til videre studier av virkningsmekanismen i et større panel av NSCLC cellemodeller.
( A) den kjemiske strukturen til 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), en naturlig triterpenoid isolert fra frukten av
Poncirus trifoliata
. (B) MRC-5 og L132 humane normale lungecellelinjer og A549, H460, H358, H1299, og H292 human lunge-cancercellelinjer ble platet ut på 96-brønners plate og ble behandlet med varierende konsentrasjoner av 21α-MMD i 24 timer og cellevekst ble analysert ved MTT-analyse og plottet som prosent av levedyktige celler. Verdiene er sammenlignet med tilsvarende kontrollverdi. (C) Klonal dannelsen veksten av angitte lungekreftceller ble utført etter en 7-dagers vekstperiode etter en enkelt administrasjon av forskjellige konsentrasjoner av 21α-MMD. Bildene på venstre vises er krystallfiolett farget kolonier mens på høyre er grafer som representerer teller målinger av koloniene. (D og E) fase-kontrastmikroskopi ble utført på celler etter eksponering for 25 uM 21α-MMD for å identifisere forandringer i morfologi og DNA ble observert etter DAPI (nederst til venstre) og med PI (høyre) farging observert ved konfokal mikroskop. (F) H1299 og A549 celler ble inkubert med 5 uM 21α-MMD i 24 timer fulgt av celle invasjon analyse.
