Abstract
Vellykket genterapi i stor grad avhenger av selektiv innføring av terapeutiske gener inn i de riktige målet kreftceller. En av de mest effektive og lovende metoder for å målrette tumorvevet i løpet av genavlevering er anvendelsen av virale vektorer, noe som gjør det mulig for høy effektivitet genavlevering. Imidlertid er anvendelsen av virale vektorer ikke er uten risiko og sikkerhetsmessige hensyn, så som toksisitet, en vertsimmunrespons mot virale antigener eller potensiell viral rekombinasjon inn i vertens kromosom; Disse risikoene begrenser den kliniske anvendelsen av virale vektorer. The Sleeping Beauty (SB) transposon-basert system er en attraktiv, ikke-viral alternativ til virale leveringssystemer. SB kan være mindre immunogene enn den virale vektorsystemet på grunn av sin manglende virale sekvenser. SB-baserte genavleveringssystemet kan stabilt integreres i vertscellens genom for å frembringe det terapeutiske genprodukt over levetiden til en celle. Imidlertid, når sammenliknet med virale vektorer, den ikke-virale SB-baserte genavleveringssystemet fremdeles har begrenset terapeutisk virkning på grunn av den manglende langvarige genekspresjon potensial og tumorcellespesifikk genoverføring evne. Disse begrensninger kan overvinnes ved å modifisere SB systemet gjennom innføring av hTERT-promotoren og SV40-enhancer. I denne studien ble en modifisert SB leveringssystem, under styring av hTERT-promoteren i forbindelse med SV40-forsterkeren, var i stand til å overføre selvmordsgen (HSV-TK) i flere typer kreftceller. Den modifiserte SB transfekterte kreftceller viste en signifikant økt kreftcellespesifikk dødelighet. Disse data antyder at den modifiserte SB-baserte genavleveringssystemet kan anvendes som et sikkert og effektivt verktøy for kreftcellespesifikk terapeutisk genoverføring og stabil langtids ekspresjon
relasjon:. Hong IS, Lee HY, Kim HP (2014) Novel terapeutiske tilnærminger for ulike krefttyper med en modifisert Tornerose-basert genavleveringssystem. PLoS ONE 9 (1): e86324. doi: 10,1371 /journal.pone.0086324
Redaktør: Eduard Ayuso, Universitetet i Nantes, Frankrike
mottatt: 11 juli 2013; Godkjent: 06.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Hong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning (Prosjekt koden Nei, Z-1541745-2012-13-09) fra Animal and Plant Karantene Agency, landbruks~~POS=TRUNC, Food and Rural Affairs. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gene styrt enzym prodrug terapi (GDEPT) er en av de lovende alternativer til konvensjonell kjemoterapi; GDEPT reduserer systemisk toksisitet gjennom innføring av katalytiske enzymer som omdanner lav- eller ikke-giftige forløpere til giftige metabolitter i kreftceller [1]. Det terapeutiske systemet består av inaktivt lav eller ikke-toksiske prodrugs og et gen som koder for et enzym [2]. Etter genetisk modifisering av tumorceller for å uttrykke slike enzymer og den systemiske administrering av legemiddelforløperen, er promedikamentet lokalt omdannes ved hjelp av enzymet til toksiske metabolitter, som fører til selektiv dreping av tumorcellene. Fordi toksiske metabolitten er bare produseres og frigjøres i den lokale tumorstedet hvor genet er levert, noe som resulterer i en sterkt redusert sirkulerende konsentrasjonen av den frie giftige stoffet, er dette terapeutiske system kalt lokal kjemoterapi. Det er flere gener som koder for prodrug-aktiverende enzymer. Blant dem er det mest vanlige genet Herpes simplex virus-1 tymidinkinase (HSV-TK), et godt karakterisert selvmordsgen som kan bli isolert fra Herpes simplex-virus eller
E. coli product: [3], [4]. HSV-TK omdanner systemisk administrert prodroge gancyclovir (GCV) inn i en toksisk metabolitt som dreper kreftceller [5]. Denne kombinasjonen metoden har blitt brukt til mange kliniske områder, for eksempel genterapi for behandling av kreft [6] og graft-versus-vert-sykdom (GVHD) [7].
Vellykket GDEPT avhenger i stor grad av den selektive innføring av den selvmordsgen i de riktige mål-kreftceller. En av de mest effektive og lovende metoder for genavlevering inn i målet tumorvev er anvendelsen av virale vektorer, noe som gjør det mulig for høy effektivitet genoverføring [8], [9]. Men disse vektorene for øyeblikket har risiko og sikkerhet bekymringer, slik som toksisitet, vertsimmunresponser mot virale antigener eller potensiell virus-rekombinasjon inn i vertens kromosom, noe som begrenser deres kliniske anvendelse [10]. Et annet problem med bruken av virale vektorer for genterapi er den virale vektoren fremstillingen er arbeidskrevende og kostbar [11], [12], kan derfor et bedre alternativ er å utvikle en genavlevering metode som ville dirigere terapeutiske midler til passende steder og konstitutivt uttrykke terapeutiske gener innenfor eller i nærheten av svulsten nettstedet uten disse begrensningene.
transposon-basert system er en attraktiv, ikke-viral alternativ til de virale leveringssystemer. Transposoner er diskrete segmenter av DNA som har iboende evne til å bevege seg fra sted til sted, og kan replikere seg selv i genomet ved hjelp av vertscellens organeller og andre maskiner. Imidlertid, når sammenliknet med virale vektorer, transposoner er ikke smittende, og deres virksomhet er derfor begrenset til intracellulære med spesifikke funksjoner. I virvelløse dyr, har flere forskjellige typer av endogene transposoner blitt brukt i stor utstrekning, slik som TC1 mariner-lignende element i
Caenorhabditis elegans
og P-element i
Drosophila product: [13], [14] . Uheldigvis finnes det ikke noen slike aktive og endogene transposoner er tilgjengelige i virveldyr på grunn av de akkumulerte mutasjoner i transposonet sekvensen [15]. En måte å løse dette problemet i virveldyr var den molekylære rekonstruksjon av en genetisk aktiv virveldyr TC1 /mariner-type transposable element kalt Tornerose (SB) fra de gamle «døde» transposon fossiler funnet i fisk genomer [16]. SB viser effektiv transpositional aktivitet i mus embryonale stamceller (ES) celler [17], mus somatisk vev [18], og mus kjønnsceller [19]. I tillegg har SB vist stor suksess som en effektiv genavlevering kjøretøy i musemodeller av sykdom hos mennesker [20] – [23]. I tidligere studier, sang et al. fant at SB transposon megle selvmord genuttrykk i leverkreft forårsaker apoptose [24] og telomerase genoverføring å beskytte mot kjemikalier (t-BH, CCI4, eller d-GalN) -. indusert akutt celleskade [25]
imidlertid, når sammenlignet med virale vektorer, den ikke-virale SB basert genavleveringssystemet fremdeles har begrenset terapeutisk virkning på grunn av den manglende langvarige genekspresjon og kreftcellespesifikk genoverføring evne. Den hTERT-genet er ofte reaktiveres i omtrent 90% av udødeliggjorte humane celler og kreftceller av forskjellig opprinnelse [26] – [28]. hTERT arrangøren har vært mye brukt i målrettet kreft genterapi [29] – [31]. I tillegg har den SV40-forsterkeren blitt brukt i stor utstrekning for å forbedre aktiviteten av aktivatorer for å fremme langvarig genekspresjon [32]. Således, for å øke promotorstyrken under opprettholdelse av vev-spesifisitet, har vi brukt et rekombinant SV40 enhancer inneholdende en tumorspesifikk promoter hTERT [33]. Mens sangen et al. har rapportert en forbindelse mellom modifisert SB og undertrykkelse av tumorvekst [24], er deres studie er begrenset til de av enkeltleverkreft cellelinje (Hep3B) hvori universelle antitumoreffekter i forskjellige cancercelletyper mangler. På samme måte, selv om tumor suppressive effektene av modifisert SB har vært foreslått, er disse effektene bekreftet av en enkelt in vitro-analysen (ATP celleviabilitet assay) hvor et mer omfattende profil av antitumor-virkningene av modifisert SB mangler fortsatt [24]. Derfor, i den foreliggende undersøkelse, ble den modifiserte SB-baserte genavlevering system som brukes til å overføre selvmordsgen (HSV-TK) i flere typer kreftceller, inkludert H358 (lungekreft), H1299 (lungekreft), PC3 (prostata kreft), DU145 (prostatakreft), og OVCAR3 (ovarian cancer) celler med forskjellige eksperimentelle tilnærminger inkludert TUNEL assay, celleviabilitet assay, FACS-analyse, og in vivo-eksperiment. Disse data tyder på at modifisert SB-baserte genavleveringssystemet kan anvendes som et sikkert og effektivt verktøy for kreftcellespesifikk terapeutisk genoverføring og stabil langtids uttrykk.
Materialer og metoder
Cell kultur
normalt humant fibroblast, WI-38 og IMR-90-celler ble holdt i DMEM (GIBCO BRL, Tyskland) tilsatt 10% fatalt kalveserum (FCS) (HyClone, Logan, USA), penicillin (50 enheter /ml) og streptomycin (50 ug /ml) i nærvær av 5% CO
2. H358 (lungekreft), H1299 (lungekreft), PC3 (prostatakreft), ble DU145 (prostatakreft), og OVCAR3 (ovariekreft) dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FCS, penicillin (50 enheter /ml) og streptomycin (50 ug /ml) i 5% CO2. Alle cellelinjer ble hentet fra Korea cellelinje Bank (Seoul, Korea).
Dyreforsøk
lungekreftceller (H358), prostatakreft cellelinje (DU-145), og eggstokkreft -celler (OVCAR3) ble høstet ved trypsinering, og 1 x 10
5 levedyktige celler (som bestemt ved trypanblå eksklusjon) i et totalvolum på 200 ul ble injisert subkutant i 6- til 10-uker gamle, NOD /SCID mus. To dager etter tumor-såing, ble dyrene injisert intravenøst via halevenen med 100 mg /kg gancyclovir (GCV) sammen med enten 25 ug av plasmid tom (pT. HTP. Con) eller modifisert SB system (pT.hTp.HSV-tk. con). Musene ble avlivet 28 dager etter tumorinjeksjon, og effekten av modifiserte SB system på tumorvekst ble evaluert ved å måle tumorstørrelse. For å minimere lidelse, var alle kirurgiske prosedyren utført under natrium pentobarbital anestesi. Dyreforsøk ble godkjent av etisk komité for dyreforsøk av jungwon University (Permit Number: 2013-0610).
RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra hver celler bruker Absolutt RNA Microprep kit (Stratagene, La Jolla, USA) i henhold til produsentens protokoll og behandlet med DNase i for å forebygge genomisk DNA-forurensning. cDNA-syntese ble utført med 1 ug av RNA ved hjelp av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Calsbad, USA) med Oligo (dT) primer (Promega, Madison, USA) til et sluttvolum på 20 ul. 1 ul alikvoter av cDNA ble anvendt for å amplifisere cDNA i 20 ul av den totale reaksjon. PCR-betingelser for amplifisering var: 94 ° C i 5 min; 30 sykluser ved 94 ° C i 1 minutt, ved 55 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 90 sekunder; og til slutt, 72 ° C i 10 minutter). HTR cDNA ble forsterket med HTR spesifikk primer sett (5′-tttgtctaaccctaactgagaagg-3 «som frem og 5′-tgtgagccgagtcctgggtgcacg-3′ som omvendt). hTERT-cDNA ble amplifisert med forover-primer (5»-cggaagagtctggagcaa-3 «) og revers primer (5′-ggatgaagcggagtctgga-3′). Forskjeller i ekspresjon fra hver prøve ble normalisert til GAPDH (forover 5»-aacgagcggttccgatgccctgag-3 «, revers 5′-tgtcgccttcaccgttccagt t-3»). PCR-produktene ble separert ved 2% agarosegel-elektroforese inneholdende 0,5 ug /ml etidiumbromid.
Konstruksjon av plasmider
Plasmider for kadensen-transposonet system, pCMV-SB og pCMV- MSB (en transposase har en missense mutasjon i sin C-terminal Asp-Asp-Glu motiv) ble vennlig levert av Dr. Joonseok Song (University of Pittsburgh) [25]. Å konstruere transposon plasmid, pGL3-HT-Con og pGL3-HT-TK-Con plasmider ble kuttet med KpnI og BamHI restriksjonsenzymer. En luciferase og HSV-TK-genet ble ligert med pT-MCS vektor, noe som ga opphav til pT.hTp.Con og pT.hTp.HSV-tk.Con vektorene henholdsvis (fig. 1). Den hTERT-promotoren og SV40-forsterkeren region ble amplifisert ved PCR ved anvendelse Ex Taq DNA-polymerase (Takara, Shiga, Japan) og subklonet inn i pGL3-HT-Con vektor. Den hTERT promoteren forover (5′-accaggtagtggattcgcgggcacaga-3 «) og bakover (5′-agatctagggcttcccacgtgcgcag-3′) primere, og den SV40E forover (5»-gcattcgatggagcgg-3 «) og bakover (5»-ggatccgctgtggaatg-3) primere ble anvendt. PCR ble utført i 35 sykluser ved 94 ° C i 1 minutt, ved 60 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 1 min.
For å konstruere plasmidet transposonet, den pGL3-HT-Con og pGL3-HT-TK-Con plasmider ble kuttet med Kpnl og BamHI; endene av luciferase kassetten og HSV-TK kassett ble fylt igjen ved å bruke DNA-polymerase I og stump ende ligert inn i pT-MCS vektor, noe som resulterer i pT.hTp.Con og pT.hTp.HSV-tk.Con vektorer henholdsvis. Den pT.hTp.nori.Con plasmid ble konstruert fra plasmid pTnori gjennom innsetting av den humane telomerase-promotoren (hTERTp) og SV40-enhancer. SV40 promoter ble erstattet med hTERTp ved fordøyelse av pTnori plasmid med SexAI og BglII. SV40-forsterkeren ble innsatt mellom BsmI og BamHI-setene til pTnori. Den hTERT-promotoren og SV40-forsterkeren region ble amplifisert ved PCR fra pGL3-HT-Con-vektoren ved hjelp av Ex-Taq-polymerase.
Luciferase-analyse
luciferase-analyser ble utført ved anvendelse av luciferase assay System (Promega, Madison, USA) og AutoLumat LB953 luminometer (Berthold, Wildbad, Tyskland) i henhold til produsentens protokoller. I korte trekk, 3 x 10
4 celler utsådd i en 16-mm vevskulturskål ble transfektert med 1 jjg av luciferase reporter plasmider og 0,25 ug pSV-β-galaktosidase kontroll plasmidvektor. Cellelysatene ble preparert 48 timer etter transfeksjon ved å tilsette 100 ul av reporter lyseringsbuffer og deres luciferase-aktivitet ble målt. Den pGL3-promotoren plasmid inneholdende SV40-promoter ble anvendt som en positiv kontroll. Luciferaseaktiviteten av pGL3-plasmid arrangøren i hver cellelinje ble ansett for å være en, og den relative luciferaseaktivitet ble beregnet. Alle luciferase analysene ble utført i tre eksemplarer.
Plasmid transfeksjon med GCV behandling in vitro
Kreft og normale celler (10
5 celler per parabol) ble sådd ut i 35-mm kultur retter tidligere transfeksjon, og de ble transfektert med pCMV-SB eller pCMV-MSB-plasmid med pT.hTp.HSV-TK.Con plasmid ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). Etter inkubering ved 37 ° C i 3 dager, 2 ml media inneholdende forskjellige konsentrasjoner av ganciclovir (GCV; InvivoGen, San Diego, USA) ble tilsatt til cellene. Alle data som er vist i denne rapporten er innhentet fra minst tre uavhengige eksperimenter.
TUNEL analysen
DNA trådbrudd i apoptotiske celler ble målt ved Tunel analysen ved hjelp av In-situ Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Tyskland). Prøvene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter og inkubert i en 0,1% iskald Triton X-100-løsning for permeabiliseringen i 10 minutter i henhold til produsentens instruksjoner. Celle ble deretter vasket 3 ganger med PBS og omsatt med 50 ul av TUNEL reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 60 minutter i et mørkt, fuktet kammer. Celler ble vasket tre ganger i PBS. Under fluorescens mikroskopi, ble antall TUNEL-positive celler telles.
apoptose analysen
De apoptotiske priser i normale celler og kreftceller ble målt ved en Annexin V-FITC Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). I korthet, den pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transfekterte celler ble behandlet med GCV (50 ug /mL, 3 timer ved 37 ° C) etter 10 dager etter transfeksjon. Celler ble høstet og skylt med et 1 x annexin-bindingsbuffer og deretter resuspendert med 100 ul av en 1 x annexin-bindingsbuffer. Etter tilsetning av 5 ul av FITC-annexin V og 1 ul av propidiumjodid (PI, 100 ug /ml), ble celler inkubert ved romtemperatur i 15 minutter i mørket. Andelen av levedyktige celler ble analysert ved FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, California) og kvantifisert ved FlowJo programvare (Tre stjerners Inc., Ashland, USA).
Cvtotoksisitetsmålinq
Et antall av 5 x 10
3 pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transfekterte celler ble inokulert i 96-brønns plate. Platen ble deretter inkubert ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer. GCV ble tilsatt ved konsentrasjonsnivå på 10, 30, 50 pg /ml i tre eksemplarer for hvert konsentrasjonsnivå. Cellene ble deretter inkubert i 3 timer og ble tilsatt med MTT, hvor cellene ble dyrket i ytterligere 4 timer. Supernatanten ble deretter fjernet og DMSO ble tilsatt for å oppløse de MTT formazankrystaller. OD-verdien ved 570 nm ble påvist ved en mikroplateleser. Cell overlevelse ble beregnet etter: overlevelsesrate (%) = A /B x 100 (A: OD verdien pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transfekterte celler, B: OD verdien pT.hTp.Con og pCMV-SB). Alle forsøk ble utført in triplo. Overlevelseskurve ble generert med midlere viabilities av hver av de cellelinjer som ordinataksen og konsentrasjonene av GCV som abscisse akse
Statistisk analyse
Hvert sett av eksperimenter ble utført i duplikat eller triplikat. Resultatene fra hvert eksperiment replikat ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Dataene ble bedømt ved en-veis analyse av varians (ANOVA) og signifikante resultater ble ytterligere vurdert ved Tukey multiple sammenligningstester. Statistisk signifikans ble definert til en P nivå. 0,05
Resultater
hTERT er et lovende mål for SB-mediert genterapi
Vellykket genterapi i stor grad avhenger selektiv ekspresjon av et selvmordsgen i passende mål kreftcellene, men ikke i den normale omgivende celler. Det humane telomerase revers transkriptase (hTERT) genet, som koder for den katalytiske subenhet av telomerase, er sterkt uttrykt i embryonale stamceller og er progressivt nedregulert i løpet av differensiering, noe som resulterer i fullstendig stanse i fullt differensierte somatiske celler. hTERT ofte reaktiveres i omtrent 90% av udødeliggjorte humane celler og kreftceller av forskjellig opprinnelse [26] – [28]. Derfor kan det være et lovende mål for genterapi på en rekke forskjellige tumortyper. Først undersøkte vi uttrykket profiler av de humane telomerase RNA-komponenter (HTR) og hTERT ved hjelp av RT-PCR i fibroblaster og forskjellige kreftcellelinjer. HTR ble konstitutivt uttrykt i både fibroblaster og cancercellelinjene som var i overensstemmelse med tidligere observasjoner [34]. Ekspresjon av hTERT ble påvist i alle kreftceller, inkludert to lungecancercellelinjer (H358 og H1299), to prostatacancercellelinjer (PC3 og DU145), og en ovarial cancer cellelinje (OVCAR3), men det ble ikke påvist i de to fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90) (fig. 2). Derfor uttrykk for hTERT syntes å være tett koblet til tumorutvikling, og hTERT kan være et lovende mål for SB-mediert genterapi av de ulike krefttyper.
HTR og hTERT uttrykk nivåer i ulike kreftcellelinjer og normale fibroblaster ble bestemt under anvendelse av RT-PCR. Total RNA ble forsterket ved hjelp av HTR og hTERT spesifikke primere (henholdsvis øvre og midtre,). GAPDH ekspresjon ble anvendt som en intern kontroll for normalisering av HTR og hTERT uttrykk. HTR ble konstitutivt uttrykt i både fibroblaster og kreftcellelinjer. Ekspresjon av hTERT ble påvist i alle kreftceller, mens det ikke ble detektert i de to fibroblast cellelinjer. Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90).
Tumor spesifikk aktivering av hTERT arrangøren av SV40 enhancer
Fordi normal eller naturlig arrangøren var ikke sterk nok til å indusere effektiv ekspresjon av terapeutiske gener i visse tumorceller, er et kraftig tumorspesifikk promoter avgjørende for å oppnå vellykket langvarig terapeutisk genekspresjon. Simian virus 40 (SV40) enhancer har vært mye brukt for å forbedre aktiviteten av promotorer [32] og 3-poly (A) hale er viktig for stabiliteten og translasjon mRNA [35]. Således, for å øke promotorstyrken under opprettholdelse av vev-spesifisitet, konstruerte vi et rekombinant hTERT promoter som inneholdt SV40-enhancer og SV40 PolyA (Simian-virus 40 PolyA, også kalt PolyA). SV40-enhancer sekvens ble amplifisert og innsatt i multiple klone sete (MCS) nedstrøms av hTERT-promoteren. Den transkripsjon aktivitet etter transfeksjon med PT-HTP-Con plasmid (med SV40 enhancer og SV40 PolyA) eller PT-HTP-Pro plasmid (uten SV40 enhancer og SV40 PolyA) ble funnet og sammenlignet i de normale og kreftcellelinjer, og effekten av SV40-enhancer på aktiviteten av den spesifikke tumor hTERT promoter ble evaluert. Som vist på fig. 3, PT-HTP-Con plasmid, som inneholder SV40 enhancer og SV40 PolyA, viste en betydelig økning i transkripsjon aktivitet i telomerase positiv kreft-cellelinjer, mens det var ingen forandring i de to normale fibroblast cellelinjer. Disse resultatene viste at hTERT-promotoren viste relativt høye transkripsjonelle aktivitet i de fleste tumorcellelinjer selv om de oppviser liten aktivitet i de normale fibroblast-cellelinjer, og SV40-enhancer og SV40 PolyA øket aktiviteten av hTERT-promoteren vesentlig utelukkende i kreftcellen linjer.
Etter transfeksjon av enten PT-HTP-Con plasmid (med SV40 enhancer og SV40 PolyA) eller PT-HTP-Pro plasmid (uten SV40 enhancer og SV40 PolyA), luciferase aktiviteten ble oppdaget og sammenlignet i normale og kreftcellelinjer. I telomerase positive cancercellelinjer, SV40-enhancer og SV40 PolyA aktivert hTERT-gen promotoren med minst syv ganger høyere enn den hTERT-gen promotoren aktivitet uten disse sekvenser. Relativ luciferaseaktivitet ble standardisert til transfeksjon av styre pGL3-promoter plasmid. Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001
Langsiktig bærekraft av den modifiserte SB leveringssystemet i ulike typer kreft celler
vellykket genterapi avhenger av langsiktig bærekraft av terapeutisk genekspresjon å kurere eller bremse utviklingen av kreftutvikling. Derfor, ved siden undersøkte vi hvorvidt den SB avleveringssystem modifisert med hTERT-promotoren og SV40-forsterkeren vedvarende langvarig terapeutisk gen-ekspresjon i forskjellige typer av cancer-cellelinjer. På grunn av at transposase-produserende helper plasmid er vesentlig for innsetting av SB i verts genomer, vi co-transfektert normal fibroblast og cancercellelinjer med en luciferase som uttrykker versjon av pT-HTP-Con plasmid sammen med enten den aktive hjelpe plasmidet ( pCMV-SB) eller inaktive helper plasmid (pCMV-MSB). Alle kreftcellelinjer opprettholdt relativt høyere nivå av langvarige luciferase-aktivitet ved bruk av SB avgivelsessystemet under styring av hTERT-promotoren og SV40-forsterkeren i forhold til de normale fibroblaster; Det var ingen endring i de to normale fibroblast-cellelinjer 10 dager etter transfeksjon (fig. 4). Disse funnene antyder at den modifiserte SB avgivelsessystemet er en lovende måte å forbedre den terapeutiske effektiviteten når det kreves langvarig ekspresjon av de terapeutiske produkter.
luciferase-analyser ble brukt for å bestemme promotor aktiviteter av luciferase-uttrykkende plasmid pt-HTP-Con følgende kotransfeksjonen med enten den aktive helper plasmid (pCMV-SB) eller inaktive helper plasmid (pCMV-MSB) i H358, H1299, PC3, DU145, OVCAR3, WI-38, og IMR-90 celler . Alle kreftcellelinjer som inneholdt den SB-baserte genavleveringssystemet, under kontroll av den hTERT-promotoren og SV40-enhancer, vedvarende relativt høyere nivåer av langsiktig luciferaseaktivitet enn de normale fibroblaster 10 dager etter transfeksjon. Relativ luciferaseaktivitet ble standardisert til transfeksjon av styre pGL3-promoter plasmid. Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001
Modifisert SB leveringssystem øker tumorcelle spesifikk cytotoksisitet
Vellykket kreftbehandling ved hjelp av genterapi i stor grad avhenger av den spesifikke levering av det terapeutiske produkt inn i de riktige mål-kreftceller. Gene styrt enzym prodrug terapi (GDEPT) er et lovende alternativ til konvensjonell kjemoterapi; GDEPT minimerer systemiske toksisitet av konvensjonelle kjemoterapi narkotika ved å innføre katalytiske enzymer i tumorceller; disse enzymene deretter konvertere lav- eller ikke-giftige forløpere til giftige metabolitter [1]. Etter genetisk modifisering av tumorceller for å uttrykke de katalytiske enzymer, systemisk administrering av legemiddelforløperen, som er lokalt omdannes ved hjelp av enzymet til cytotoksiske metabolitter, fører til selektiv dreping av tumorceller. For å bestemme den tumorcellespesifikke toksisk effekt av vår SB-baserte genavleveringssystemet, kreftceller og normale fibroblaster ble ko-transfektert med det modifiserte SB system (pT.hTp.HSV-tk.Con) sammen med den aktive hjelpe plasmid (pCMV -SB) etter administrering av 50 ug /ml gancyclovir (GCV). Vi utførte deretter TUNEL-analyser på celler 10 dager etter transfeksjon for å identifisere de apoptotiske celler, som er karakterisert ved nærværet av tett farget sirkulære legemer som representerer den fragmenterte DNA av apoptotiske celler. Som vist på fig. 5, de TUNEL analyser viste at de modifiserte SB transfekterte kreftceller viste en betydelig øket dødelighet sammenlignet med de normale fibroblaster i nærvær av 50 ug /ml GCV. For ytterligere å bekrefte dette tumorspesifikke celledød ved den SB-baserte genavleveringssystemet, ble en cellelevedyktighet test som benyttes for å evaluere cancercellespesifikk cytotoksisitet i de normale fibroblaster og cancercellelinjer behandlet med GCV på en doseavhengig måte. GCV alene hadde ubetydelig virkning på cellenes levedyktighet (fig. 6A), mens transfeksjon av den modifiserte SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) system etter administrasjon av GCV betydelig redusert kreftcellelevedyktighet på en doseavhengig måte (figur . 6B). I tillegg celledød ble også bestemt ved strømningscytometri for å identifisere celler som ble farget med både Annexin V /FITC og propidiumjodid (PI). Dataene fra TUNEL og celleviabilitet analyser var i overensstemmelse med vår flowcytometri resultater (fig. 7). Disse resultatene tyder på at våre SB-baserte genavleveringssystemet mediert tumorcellespesifikk terapeutisk genavlevering, som i sin tur induserte tumor-spesifikke apoptose. Våre in vitro-data antyder at den modifiserte SB transfekterte kreftceller viste en betydelig øket dødelighet sammenlignet med de normale fibroblaster. Derfor, ved siden undersøkte vi hvorvidt tumorvekst kan undertrykkes ved å modifiseres SB leveringssystem in vivo. I noen forsøksgrupper ble tumorvekst med hell trykkes av modifisert SB leveringssystem, mens de andre gruppene ikke viser en tydelig antitumoreffekt (fig. 8).
Nivåene av apoptose celle ble vurdert ved hjelp av TUNEL assay etter transfeksjon av SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv hjelpe plasmid) og etter administrering av 50 ug /ml GCV ved 3 dagers post-transfeksjon. TUNEL-positive celler ble preget av tett farget sirkulære organer som representerer fragmentert DNA av apoptotiske celler. SB transfekterte kreftceller viste en betydelig økt antall TUNEL-positive celler i forhold til normale fibroblaster i nærvær av 50 ug /ml GCV. Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av MTT med eller uten transfeksjon av SB-systemet (pT.hTp.HSV- tk.Con med aktiv helper plasmid) etter administrasjon av 10, 30 eller 50 mikrogram /ml GCV på 3 dag etter transfeksjon. GCV alene hadde ubetydelig virkning på virkning på cellenes levedyktighet (A), mens transfeksjon av SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv hjelpe plasmid) etter administrasjon av GCV betydelig redusert kreftcellelevedyktighet i en dose avhengig måte (B). Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001
Kreft cellelinjer og normale fibroblaster ble transfektert med SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv helper plasmid). Cellene ble deretter utfordret med 50 ug /ml GCV, etterfulgt av Annexin V-FITC /PI farging og FACS-analyse ved 3 dagers post-transfeksjon. Lungekreft cellelinjer (H358 og H1299); prostata kreft cellelinjer (PC3 og DU145); ovarian cancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90).
lungekreftceller (H358) (A), prostatakreft cellelinje (DU-145) (B), og eggstokkreft celler ( OVCAR3) (C) ble høstet ved trypsinering, og 1 x 10
5 levedyktige celler (som bestemt ved trypanblå eksklusjon) i et totalt volum på 200 ul ble injisert subkutant. To dager etter tumor-såing, ble dyrene injisert intravenøst via halevenen med 100 mg /kg gancyclovir (GCV) sammen med enten ko-transfeksjon av det tomme plasmidet (pT. HTP. Con) med den aktive hjelpe plasmid (pCMV-SB) eller ko-transfeksjon av SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con) med den aktive hjelpe plasmid (pCMV-SB). Musene ble avlivet 28 dager etter tumorinjeksjon, og effekten av modifiserte SB system på tumorvekst ble evaluert ved å måle tumorstørrelsen.
diskusjon
Mange vanlig anvendte cytostatika mangler tumor spesifisitet , og dosene som kreves for å oppnå terapeutiske nivåer i tumoren er ofte toksiske til de omgivende normalt vev. Derfor prodrug aktiverende systemer som inkluderer selvmord genterapi er lovende alternativer til konvensjonell kjemoterapi; disse systemene minimere systemiske toksisitet av konvensjonell kjemoterapi narkotika. For klinisk anvendelse, selvmordsgener må tilfredsstille følgende kriterier: a) disse genene må enten ikke uttrykt eller til stede på ekstremt lave nivåer i vert;
