Abstract
Bakgrunn
Aberrant aktivering av den kanoniske Wnt /β- catenin pathway forekommer i nesten alle kolorektal kreft og bidrar til deres vekst, invasjon og overlevelse. Phopholipase D (PLD) har vært innblandet i utviklingen av tykktarmskreft imidlertid en forståelse av målene og regulering av denne viktige veien forblir ufullstendig og dessuten forholdet mellom Wnt signal og PLD er ikke kjent.
Metodikk /Principal funn
Her viser vi at PLD isoenzymer, PLD1 og PLD2 er direkte mål og positive tilbakemeldinger regulatorer av Wnt /β-catenin signalering. Wnt3a og Wnt etterligninger betydelig forbedret uttrykk for PLDS på en transkripsjonsnivået i HCT116 kolorektal kreftceller, mens tie av β-catenin genekspresjon eller utnyttelse av en dominerende negativ form av T-celle faktor-4 (TCF-4) hemmet uttrykk for PLDS . Videre både PLD1 og PLD2 ble svært indusert i tykktarm, lever og mage vev av mus etter injeksjon av LiCl, en Wnt mimetisk. Wnt3a stimulerte dannelsen av de β-catenin /TCF-komplekser til to funksjonelle TCF-4-festeelementer innenfor PLD2 promoteren som vurdert av kromatin immunutfelling assay. Undertrykke PLD ved hjelp av genet Slå eller selektiv inhibitor blokkerte evnen av β-catenin til transkripsjonelt aktivere PLD og andre wnt målgener ved å hindre dannelsen av β-catenin /TCF-4-komplekset, mens taktikker for å heve intracellulære nivåer av fosfatidinsyre, produkt av PLD aktivitet, som forsterkes disse effektene. Her viser vi at PLD er nødvendig for Wnt3a drevet invasjon og forankringsuavhengig vekst av tykktarmskreftceller.
Konklusjon /Betydning
PLD isozym fungerer som en roman transkripsjonen mål og positive tilbakemeldinger regulator av Wnt signalering, og deretter fremmer Wnt-drevet forankringsuavhengig vekst av kolorektal kreft celler. Vi foreslår at terapeutiske intervensjoner rettet mot PLD kan gi et klinisk fordel i Wnt /β-catenin-drevet malignitet
Citation. Kang DW, Min DS (2010) Positiv tilbakemelding forordning mellom fosfolipase D og Wnt signale Fremmer Wnt- Driven Anchorage-Uavhengig Vekst av tykktarmskreftceller. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10,1371 /journal.pone.0012109
Redaktør: Sudha Agarwal, Ohio State University, USA
mottatt: 03.04.2010; Godkjent: 05.07.2010; Publisert: 12. august 2010
Copyright: © 2010 Kang, Min. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Korea Healthcare Technology R D Project, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, republikken Korea (A080287). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformer, som forekommer i en betydelig andel av befolkningen. Mer enn 80% av sporadisk og arvelige kolorektal kreft kan være forårsaket av aberrasjoner i Wnt /β-catenin signalveien [1] – [3]. Dermed endringer i Wnt /β-catenin vei definere en viktig begivenhet i patogenesen av tykktarmskreft. β-catenin er en transkripsjons coactivator av T-celle faktor (TCF) /lymfoid enhancer faktor (Lef) transkripsjonsfaktorer. β-catenin stabilitet er regulert av en multiprotein kompleks som inkluderer adenomatøs polypose coli (APC), glykogensyntasekinase 3β (GSK3P), og Axin. Fosforylering av β-catenin av GSK3p rettet mot β-catenin til ubiquitinering og proteasome degradering [4]. Således aktivering av veien undertrykker β-catenin degradering, noe som resulterer i akkumulering av nukleær β-catenin. I kjernen, akkumulering av TCF /β-catenin fører til transkripsjonen aktivering av flere mål-gener, som deretter kan bidra til utvikling av kreft [5], [6]. Dermed er potensielt viktig for å forstå den sentrale rollen som Wnt /β-catenin /TCF avhengig kanoniske veien i tumorigenesis identifisering av direkte mål av Wnt /β-catenin signalveien.
fosfolipase D (PLD) katalyserer hydrolyse av fosfatidylcholin (PC) for å generere fosfatidinsyre (PA), som virker som en andre budbringer i mange fysiologiske responser [7]. To pattedyr PC-spesifikke PLD isoenzymer utpekt som PLD1 og PLD2 har blitt klonet. PLD har dukket opp som en viktig regulator av cellevekst og overlevelse hvis feilregulering finner sted i løpet av utviklingen av en rekke humane tumorer [8]. Forhøyet uttrykk for PLD1 og PLD2 har blitt rapportert i kolorektal kreft vev [9]; Særlig har PLD2 ekspresjonsnivået og dens tilknytning til clinicopathological egenskaper nylig blitt undersøkt i kolorektal karsinom [10]. Ekspresjonsnivåene av PLD2 korrelerer signifikant med tumorstørrelse og overlevelse av pasienter med kolorektal karsinom [10]. Den PLD2 punktmutasjon er også blitt funnet i brystkreft [11]. Celler overekspresjon PLD isozyme forbedre matriksmetalloproteinase-2 uttrykk og tumorcelle invasjon og danne metastaser i syngene mus [12], [13]. Disse funnene tyder på at PLD spiller en viktig rolle i utviklingen av tykktarmskreft, og kan være et mål for kreftbehandling. Vi har nylig rapportert om betydelig co-overekspresjon av PLD isozymene med β-catenin i human kolorektal kreft [14]. Ved hjelp av to RNA interferens (RNAi) -baserte tap-av-funksjon-skjermer, er onkogener som modulerer β-catenin avhengig transkripsjon og regulerer tykktarmskreft celleformering er blitt identifisert [15].
Blant ett av genene identifisert i denne skjermen var PLD1, og undertrykkelse av PLD1 betydelig hemmet både β-catenin transkripsjonen aktivitet og tykktarmskreft celleproliferasjon. I denne studien, viser vi virkningen av PLD isozymene som nye mål og positive tilbakemeldinger regulering av Wnt signalering. Dermed identifikasjon av en Wnt-β-catenin-TCF-regulert PLD aksen gir nye mekanistiske innsikt i kreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Menneskelig kolorektal kreftceller (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO) og brystkreft celler (HS578T) ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia) og ble dyrket i henhold til standard protokoller. Renset rekombinant Wnt3a ble kjøpt fra R D Systems Inc. BIO ble hentet fra Calbiochem. LiCl, 1- eller 3-butanol, dioktanoyl PA, og 1-propranolol ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. PLD1 og PLD2 selektive hemmere ble kjøpt fra Cayman kjemisk. Dual luciferase assay kit ble kjøpt fra Promega.
plasmider og små interfering RNA
Menneske PLD1 (pGL4-PLD1 Luc) og PLD2 (pGL4-PLD2 Luc) promoter reporter plasmider inneholder -1,9 kb ( -1930 /+ 1) og 2,6 kb (-2180 /+ 491) på oppstrøms 5′-flankerende DNA bundet til luciferase-rapportørgener, henholdsvis, og er blitt beskrevet andre steder [14]. Vi brukte arrangøren av hPLD1 (pGL4-PLD1, -1930 /+ 1), transkribert fra ekson 2, blant to alternative transkripsjoner av PLD1 å bli transkribert ved to forskjellige transkripsjons områder (ekson 1 og ekson 2). PCR-basert metode ble anvendt for kloning av serielt slettet PLD2 promoter-konstruksjonene inn i pGL4-14b reporter vektoren ved Kpnl og Bglll-sete. Sekvensen av oligonukleotider brukt som primere i PCR presiseringer er vist i tabell S1.
Mutasjoner av TCF-4 bindende elementer på PLD2 arrangøren ble generert ved hjelp av Quick Change seterettet mutagenese Kit, i henhold til produsentens anbefalinger (Stratagene, Tabell S2). TOPflash og FOPflash luciferase-plasmider inneholdende flere kopier av TCF /LEF responselementer ble benyttet for måling av TCF-aktivitet. Dominant-negative TCF-4 (ΔN30 TCF-4) ble vennlig levert av Dr. Tesshi Yamada (National Cancer Center Research Institute). Konstituerende aktiv mutant av β-catenin (S37A β-catenin) og villtype TCF-4 ekspresjonsvektorer ble vennlig levert av Dr. Bert Vogel (Johns Hopkins University). shRNA for β-catenin ble vennlig levert av Dr. H. Clevers (Utrecht, The. Nederland). Sirnas for kontroll, PLD1, og PLD2 ble kjøpt fra Dharmacon Forskning Inc (Lafayette, Colo). siRNA sekvenser for PLDS er som følger:. menneskelige PLD1 (nukleotider, 1571 til 1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) og menneskelige PLD2 (nukleotider, 1378-1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA)
Transient Transfeksjon og Reporter Gene analysen
følge produsentens instruksjoner, uttrykk plasmider eller siRNA ble transient transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine Plus (Invitrogen) eller Polyfect (Qiagen) reagenser. Transfeksjon og luciferase-analyser ble utført som tidligere beskrevet [16]. Relativ luciferase aktivitet ble oppnådd ved normalisering av aktiviteten til ildflue luciferase mot aktiviteten til den interne kontrollen
Renilla
luciferase.
Immunpresipitasjon og Western blotting
Cellelysater ble analysert for immunoprecipitation og /eller immunoblot, som tidligere beskrevet [17]. Anti-α-tubulin (Sigma, MO), anti-vimentin (Sigma, MO), anti-c-myc (Santa Cruz, California), anti-β-catenin (Santa Cruz, California), anti-NOS2 (Santa Cruz , CA), anti-TCF-4 (Santa Cruz, CA), anti-β-catenin (BD Biosciences, CA), anti-cycinD1 (BD Biosciences, CA), og anti-fosfo-GSK3p-antistoff (Cell signalering, MA ) ble kjøpt. Det polyklonale anti-PLD antistoff som gjenkjenner både PLD1 og PLD2 ble dannet som tidligere beskrevet [18].
PLD aktivitetsanalyse
PLD-aktivitet ble bestemt ved måling av dannelsen av [
3H] phosphatidylbutanol, produktet av PLD-mediert transphosphatidylation, i nærvær av 1-butanol, som tidligere beskrevet [17].
Kvantitativ RT-PCR
Totalt RNA (1 pg) ble forbehandles med DNase og brukt for revers transkripsjon med M-MLV-revers transkriptase (Invitrogen). Sanntids Q-PCR ble utført på en Rotor-Gene RG-6000A apparat (Corbett Research): for 44 sykluser ved 94 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, og 72 ° C i 15 sek. Reaksjoner (20 mL) inkludert 2 mL av cDNA, target-spesifikke primere, og Quantitect SYBR grønn PCR (Qiagen). Temperaturområdet for analyse av smeltekurvene var 55 ° C til 99 ° C i løpet av 30 sek. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver reaksjon i tre eksemplarer. Alle data ble normalisert med GAPDH genekspresjon verdier. Se tabell S3 for Q-RT-PCR-primer sekvenser.
Animal og vev forberedelse
Mus ble gitt med normalt vedlikehold og en diett fra Dae Han Bio Link (Seoul, Korea). Dyrestudier ble godkjent og utført under retningslinjene fra Institute of Health retningslinjer for Institutional Review Board of Pusan National University (Busan, Korea). Tolv uker gammel hann FVB mus fikk intravenøs injeksjon med LiCl en gang hver dag i 2 dager ved dose på 5 mg /kg. Kontrollgruppen ble injisert med samme volum av fosfat-bufret saltvann (PBS). Førtiåtte timer etter injeksjon LiCl, dyr (n = 3 /gruppe) ble dypt bedøvet med dietyleter og halshugget, og vevene ble frosset umiddelbart i LN
2 og lagret ved -70 ° C for immunblotting. Mus (n = 3 /gruppe) også ble bedøvet og deretter perfusert intracardially med 4% paraformaldehyd i PBS inneholdende 0.34% L-lysin (Sigma). Etter fikseringsmiddel perfusjon, ble vevene fjernet, anbragt i 4% paraformaldehydløsning ved 4 ° C over natten, og deretter overført til en 30% sukroseløsning. Vevene ble behandlet ved korona kryostat snitting i Dulbeccos PBS oppløsning inneholdende 0,1% natriumazid ved bruk av en fryse mikrotom (MICROM, Tyskland).
Immunhistokjemi
Paraformaldehyde fiksert 4 mikrometer parafinsnitt av kolon vev ble autoklavert i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0). Etter blokkering med 5% BSA og 1% normalt geiteserum i PBS ble snittene inkubert med anti-β-catenin (BD transduksjon) og PLD-antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av vasking med PBS. Deretter seksjoner ble inkubert med Alexa 488 fluor eller fluor Alexa 555-konjugert IgG sekundært antistoff (Santa Cruz, 1: 200) ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av vasking med PBS. Etter counterstaing med DAPI, og lysbilder ble montert i Permount
® (Fisher Scientific, USA). To-farge fluoriserende bilde for anti-PLD og β-catenin antistoffarging ble oppsamlet på et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop (Zeiss, Tyskland). Fluorescent bildene ble analysert ved bruk av Zeiss LSM bilde nettleser programvare (Zeiss).
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
chip eksperimenter ble utført som tidligere beskrevet [19], med mindre modifikasjoner. HCT116-celler ble anvendt for tverrbinding med 1% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 10 minutter. Cellene ble skrapet og oppsamlet ved sentrifugering. Celler ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% deoksykolat og 1,0 mM protease-inhibitor cocktail), og ultralydbehandlet i 20 sekunder 3 ganger. Normal mus IgG, anti-β-catenin eller anti-HDAC1 antistoff ble tilsatt og inkubert i 6 timer ved 4 ° C. Immnunocomplexes ble ekstrahert 3 ganger med 1% SDS, 0,1 M NaHCO3, og kryssbinding ble reversert ved inkubasjon ved 65 ° C over natten. Den lagrede kromatin inngangs fraksjon ble også behandlet på samme måte. Prøvene ble deretter spaltet med DNase- og RNase-fri proteinase K ved 50 ° C i 4 timer, og ekstrahert med fenol /kloroform /isoamylalkohol. DNA-prøver ble renset med Qiagen oppryddings kolonner. Den PLD2 eller NOS2 promoter regionen ble analysert av Q-RT-PCR med spesifikke primere (tabell S4).
Cell migrasjon og invasjon Analyser
Celler ble lagt til Transwell membrankamrene (porestørrelse, 12,0 mikrometer, Corning). Antallet celler som migrerte gjennom membranen til det nedre kammer ble tellet etter 24 timer. For siRNA eksperimenter ble celler sådd ut 24 timer etter transfeksjon med sirnas, og migrasjons analyser ble utført i ytterligere 24 timer. For invasjonsanalyser, Matrigel (1: 5; BD) ble tilsatt til Transwell membrankamrene og inkubert i 5 timer; Cellene ble deretter sådd. Omfang av migrasjon og invasjon ble uttrykt som et gjennomsnittlig antall celler per mikroskopisk felt.
Anchorage uavhengig vekst analysen
Anchorage uavhengig vekst ble målt ved hjelp av CytoSelect ™ 96-Well
I vitro
Tumor Sensitivity-analysen (Cell Biolabs, CA), i henhold til produsentens spesifikasjoner. Anchorage uavhengig vekst ble undersøkt i myk agar; 50 ul av basis agar matrise ble tilsatt til bunnen av hver brønn av en 96-brønns plate. Etter at agaren var faste, 75 ul av cellesuspensjonen /bløt agar matriks inneholdende 3 x 10
3-celler ble lagt på toppen, etterfulgt av 50 ul 2 x komplett medium med Wnt3a og /eller inhibitorer. Etter 10 dagers inkubering, agar-matrise var oppløst, og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen fremstilt ved dannelse av uoppløselig formazanprodukt av levedyktige celler ble registrert ved 570 nm.
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført uavhengig er minst tre ganger, med lignende resultater. Data ble analysert ved Student
t
test, og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Wnt signal fremmer uttrykk for PLD. isoenzymer
for å undersøke spørsmålet om hvorvidt Wnt signal øker PLD uttrykk, ble HCT116 kolorektal kreft celler utsatt for Wnt3a eller Wnt3a etterligninger (figur 1). Som bestemt ved immunopresipitering og Western blot, ekspresjon av både PLD1 og PLD2 ble forbedret i en tidsavhengig måte etter administrering av renset rekombinant Wnt3a (150 ng /ml) (figur 1A, øvre panel). Anti-PLD-antistoff ble dannet mot C-terminale peptid av PLD1 hvori 7 aminosyrer blant 12 aminosyrer var de samme med den PLD2, og gjenkjenner både PLD1 og PLD2 [18]. Det ble demonstrert at HCT116-celler har mutasjoner i β-catenin ved Ser-45, og at denne Ser-45 mutant allel var ikke tilstrekkelig til å støtte tumorgenese av HCT116-celler [20] – [22]. Således er det foreslått at den β-catenin banen i HCT116-celler ikke er fullstendig aktivert ved mutasjon og kan derfor bli stimulert av ytterligere ekstracellulære budbringere slik som Wnt signalering, noe som resulterer i ytterligere onkogen transformasjon. Vi deretter undersøkt spørsmålet om hvorvidt eller ikke Wnt signal-indusert ekspresjon PLD kan reguleres ved en transkripsjonsnivået. Wnt3a forbedret mRNA nivåer av PLD1 og PLD2 i en tidsavhengig måte (figur S1). For å utelukke at Wnt avhengig økning av PLD mRNA kun er forårsaket av endringer i mRNA-stabilitet, utførte vi en mRNA-forfall analyse ved bruk av actinomycin D, noe som forhindrer transkripsjon. Ekspresjonen av PLD1 og PLD2 ble økt over tid på en sammenlignbar måte mellom Wnt-behandlede og kontrollcellene som analysert ved Q-RT-PCR (fig S2). Forbehandling med actinomycin D undertrykte betydelig både basal og Wnt3a-indusert PLD mRNA nivåer (figur S2). Således Wnt avhengig økning av PLD mRNA er faktisk på grunn av forhøyet transkripsjon. For ytterligere å styrke våre resultater, bestemt vi effekten av blokaden av GSK-3β på PLD uttrykk. LiCl og BIO er etablert agonister som etterligner den Wnt-signalveien, hvilket fører til aktivering og stabilisering av β-catenin [23], [24]. Som analysert ved hjelp av immunpresipitering og Western blot, LiCl (20 mM), BIO (1 uM), og Wnt3a (150 ng /ml) signifikant øket ekspresjonsnivået av PLD isozymer (figur 1B). Wnt mimetika også økt proteinnivået av β-catenin, så vel som ekspresjon av c-myc og NOS2, målgener av Wnt signalering. Som analysert av Q-RT-PCR, Wnt signale markert forhøyede uttrykk nivåer av PLD mRNA (figur 1C). I tillegg Wnt og dets mimetika forbedret promotor aktiviteten til både PLD1 og PLD2 (figur 1D) vesentlig; Wnt3a fulgte en betydelig økning i gen-ekspresjon fra et TCF /LEF spesifikk luciferase reporter plasmid (TOPflash) anvendt som en kontroll. Videre fant vi at Wnt3a økt uttrykk nivåer av PLD isozymene i ulike kreftceller, inkludert kolorektal kreftceller (HCA-7, RKO, Colo-741) og brystkreft celler (HS578T) (Figur S3). For å observere induksjon av PLD-isozymer som reaksjon på signalering Wnt, valgte vi kreftceller i hvilken status for Wnt veien er normal. Disse kreftcellene er kjent for å uttrykke villtype APC og β-catenin [25] – [29]. Således er det foreslått at Wnt signale-indusert ekspresjon PLD kan være et generelt fenomen. Oppregulering av PLDS uttrykk ved Wnt3a og Wnt etterligninger sterkt innblandet en sentral rolle for hemming av GSK3p og den kanoniske Wnt signalveien i Wnt-medierte effekter. Tatt sammen indikerer disse resultater at induksjon av PLD-isozym som et nytt mål for Wnt signalisering er regulert på begge transkripsjonelle og post-transkripsjonelle nivå.
(A) HCT116-celler behandlet med renset rekombinant Wnt3a (150 ng /ml) i de angitte tidsrom, og lysatene ble immunopresipitert og immunoblottet med antistoff mot PLD. β-catenin ble analysert ved Western blotting å bruke kjernefysiske lysatene (øvre panel). Histogrammene viser relative proteinnivåer PLD1 og PLD2, som er normalisert til tilsvarende α-tubulin verdier (nedre panel). (B-C) HCT116-celler behandlet med Wnt3a (150 ng /ml), LiCl (20 mM), eller BIO (1 uM) i 24 timer. (B) Protein nivå av PLDS ble analysert ved hjelp av immunopresipitering og immunoblotting. c-myc og NOS2 ekspresjon ble analysert ved Western blotting (øvre panel). Histogrammene viser relative proteinnivåer PLD1 og PLD2, som er normalisert til tilsvarende α-tubulin verdier (nedre panel). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) mRNA-nivåene av de angitte gener ble analysert ved Q-RT-PCR. *
P
0,05
versus
kjøretøy. (D) De angitte promotorreporter plasmider ble transfektert og behandlet med Wnt3a, LiCl, eller BIO i 12 timer; luciferaseaktivitet ble deretter bestemt. *
P
0,01
versus
kjøretøy. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
LiCl induserer uttrykk for PLD isoenzymer
in vivo
For å styrke våre resultater ytterligere undersøkte vi effekten av blokaden av GSK3p på PLD uttrykket
in vivo
. LiCl ble injisert i mus, og ekspresjon av PLD ble undersøkt i flere vev ved anvendelse av anti-PLD antistoff som gjenkjenner både PLD1 og PLD2. Vi har rapportert om spesifisiteten av antistoffet til PLD [18], [30]. Som analysert ved immunoutfelling og immunoblot, økte protein LiCl nivåer av både PLD1 og PLD2 i tykktarm, mage, og levervev (figur 2A). Som en positiv kontroll, nivået av β-catenin og NOS2, samt fosforylering av GSK3P, ble øket i LiCl-injiserte vev. En komplementær resultat med hensyn til ekspresjon av PLDS etter påføring av LiCl ble også oppnådd ved immunofluorescens i kolon vev (Figur 2B). Kjerner ble kontra av DAPI. Mens β-catenin viste en membranseptum fargingsmønster i PBS-injiserte kontroll colon, ble β-catenin har økt med LiCl i cytoplasma og cellekjernen. PLD-nivå ble samtidig øket både i cytoplasma og cellekjernen i LiCl-injisert tykktarm som β-catenin ble øket (figur 2B). Sammen er disse observasjoner tyder på at ekspresjon av både PLD1 og PLD2 forsterkes i vev av LiCl-behandlede mus.
(A) Mus ble injisert intravenøst med LiCl, som beskrevet i «Materialer og metoder». Lysates fra ulike vev ble immunopresipitert og immunoblottet med antistoff mot PLD gjenkjenne både PLD1 og PLD2 (venstre panel). Proteinnivåer ble analysert ved immunblot ved hjelp av de angitte antistoffer. Histogrammene viser relative proteinnivåer PLD1 og PLD2, som er normalisert til tilsvarende α-tubulin verdier (panel høyre). (B) Parafin deler av tykktarm vev ble utsatt for immunfluorescens analyser ved hjelp av anti-β-catenin (Alexa Fluor 488, grønn) og PLD (Alexa Fluor 555; rød) antistoff. Vev ble overvåket ved hjelp av Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop. Mikros felt ble observert ved x 650 forstørrelse. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
β-catenin og TCF-4 oppregulere uttrykk for PLD isozymene
Vi har undersøkt spørsmålet om hvorvidt uttrykk for PLD isozymene er faktisk transcriptionally aktiveres av β-catenin eller TCF-4. Som vist i figur 3
A
, ektopisk ekspresjon av TCF-4, og en stabil β-catenin mutant (S37A β-catenin), som er ufølsom for ubiquitinering av β-catenin, forsterket transkripsjonen aktivering av både PLD1 og PLD2. TCF-4 og stabil β-catenin mutant betydelig økt genekspresjon fra et TCF /LEF spesifikk luciferase reporter plasmid anvendt som en kontroll. Denne induksjon ble signifikant redusert ved tilsetning av en dominant negativ (dn) TCF-4-ekspresjonsvektor (ΔN30 TCF-4) (figur 3A). Videre analyse av immunopresipitering og immunoblot viste at ektopisk ekspresjon av β-catenin eller TCF-4 økte endogene proteinnivå PLD1 og PLD2 isoenzymer i HCT116-celler. TCF-regulerte gener, inkludert c-Myc og NOS2, ble også øket ved ekspresjon av β-catenin eller TCF-4 (figur 3B). Videre transfeksjon av dnTCF-4 eller uttømming av β-catenin hjelp shRNA redusert proteinnivåer både PLD isozymer og Wnt målgener i HCT116-celler (Figur 3C). Disse resultatene indikerer at uttrykk for PLD isoenzymer er oppregulert ved både β-catenin og TCF-4.
(A) HCT116-celler ble ko-transfektert med pGL4-PLD eller topp /FOP reportere og de angitte ekspresjonsvektorer. *
P
0,01
versus
mock; †
P
0,05
versus
S37A β-catenin /TCF-4. (B) Celler ble transfektert med enten TCF-4 eller β-catenin ekspresjonsvektor, og lysater ble immunopresipitert eller immunoblottet med de angitte antistoffer (øvre panel). Histogrammene viser relative proteinnivåer PLD1 og PLD2, som er normalisert til tilsvarende α-tubulin verdier (nedre panel). (C) Cellene ble transfektert med ΔN30 TCF-4 eller shRNA for β-catenin. Lysates ble analysert ved immunoutfelling eller Western blot bruker de angitte antistoffer (øvre panel). Proteinekspresjon ble kvantifisert ved densitometer analyse. Histogrammene viser relative proteinnivåer PLD1 og PLD2, som er normalisert til tilsvarende α-tubulin verdier (nedre panel). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
β-catenin og TCF-fire bind til TBES av PLD2 promoter og forbedre PLD2 uttrykk
En polymorfisme av PLD2 genet har nylig vært forbundet med forekomsten av tykktarmskreft [31]. Videre uttrykk nivåer av PLD2 oppdaget av real-time PCR ved bruk av 97 kolorektal karsinom vev ble signifikant korrelert med tumorstørrelse og overlevelse av pasienter med tykktarmskreft; Det ble således foreslått at PLD2 ekspresjonsnivået kan være en prognostisk indikator på kolorektal karsinom [10]. Derfor prøvde vi å undersøke områder som er ansvarlig for Wnt /β-catenin /TCF-4-indusert PLD2 uttrykk.
Som vist i figur 4A, den -2180 /+ 491 PLD2 promoter ble transactivated av TCF -4 (4,6 ganger) eller S37A β-catenin (2,3 ganger) proteiner. Sekvensielle 5 «slettinger av PLD2 arrangøren til stillinger -1601, -1210, og -784 påvirket ikke TCF-4- eller S37A β-catenin-mediert trans av PLD2 promoter (TCF-4, 4,2 ganger; p-catenin 2,2 ganger høyere aktivering av alle mutanter); Men sletting av -380 regioner betydelig redusert TCF-4 eller S37A β-catenin stimulert PLD promoter aktivitet. Således er det foreslått at antatte TCF-festeelement (TBE) i posisjonene -784 -380 ~ kan være essensielle for PLD2 genregulering av TCF-4 og β-catenin.
(A) Sletting analyse av pGL4- PLD2 i HCT116 cellene. En skjematisk fremstilling av pGL4-PLD2 rapportør konstruksjoner er vist. Cellene ble kotransfektert med pGL4-PLD2 og de indikerte ekspresjonsvektorer, etterfulgt av bestemmelse av luciferase-aktivitet. (B) skjematisk fremstilling av den -2180 til 491 region av det humane PLD2 promoteren. Tall over linjene viser til transkripsjon start stedet av
PLD2
genet (1). To antatte bindingsseter for TCF-4 er vist på sekvensen (pilene indikerer retningen). (C) HCT 116-celler ble transfektert med luciferase reporter plasmid inneholdende villtype (wt) PLD2 promoter, en eller dobbelt TBE mutante former (MT) av PLD2 promoter, og behandlet med Wnt3a (150 ng /ml) eller BIO (1 mikrometer). Luciferasepreparater aktiviteter ble målt. *
P
0,05
versus
wtTBE /Wnt3a; †
P
0,01
versus
wtTBE /BIO. (D) Celler ble ko-transfektert med de indikerte ekspresjonsvektorer, sammen med WT eller TBE mutante former av PLD2 promoteren. Luciferasepreparater aktiviteter ble målt. *
P
0,05
versus
transfektert med wtTBE /β-catenin; †
P
0,05
versus
wtTBE /TCF4; **
P
0,05
versus
transfektert med wtTBE /β-catenin /TCF4. (E) Pilene angir stillingen av primerne anvendt i brikken eksperimentet. Brikken Analysen ble utført ved anvendelse av preimmun IgG, anti-β-catenin, eller anti-HDAC1 antistoff og analysert ved Q-RT-PCR. Som en positiv kontroll ble ChIP analyse av NOS2 promotoren inneholdende TBE utført. *
P
0,05
versus
β-catenin /kjøretøy; †
P
0,05
versus
HDAC1 /kjøretøy. Dataene er representative for fire uavhengige eksperimenter. (F) Prinsippskisse for sammenligning av TBES på PLD2 promoter regioner fra forskjellige arter. TCF-4 festeelementer i 5 «flankerende regioner av det humane PLD2 transkripsjonelle startsete (TSS) ble sammenlignet med de av genomene fra 4 forskjellige arter. En kjerne
motiv
, CTTTG (A /T) (A /T) [eller den komplementære sekvens (A /T) (A /T) CAAAG] av TCF bindende sekvenser på PLD2 arrangøren er svært
konservert
på tvers av arter.
som vist i figur 4B, sekvensanalyse av den 5′-flankerende sekvens av den PLD2 genet identifisert to mulige TBES (betegnet som TBE1 og TBE2). TBE1 (ATGAAAG) ligger -512 b oppstrøms, og inneholder en nesten invertert kamp med konsensus CTTTG (A /T) (A /T) sekvens for TCF-4-binding [32]; TBE2 (CTTTCAT) ble plassert -497 b oppstrøms og nesten matchet konsensus sekvens (tabell S2) [33].
For å undersøke den funksjonelle betydningen av TBE motiv i reguleringen av PLD2 gentranskripsjon, site-rettet mutasjon av TBE-setene ble generert i forbindelse med en PLD2 promoter. Mutasjon i TBE1 eller TBE2 nettstedet sunket betraktelig Wnt3a-indusert PLD2 promoter aktivitet i HCT116-celler (Figur 4C). Mutasjoner av både TBE1 og TBE2 nettsteder (TBE1 /2) dramatisk undertrykt Wnt3a stimulert PLD2 promoter aktivitet. Videre TCF-4 og /eller β-catenin-indusert PLD2 promoter-aktivitet ble også opphevet når TBE1 og TBE2 ble mutert (figur 4D). Disse dataene antyder at PLD2 arrangøren er et mål av TCF /β-catenin kompleks via sin konsensus TBE.
Videre har vi deretter utført en kromatin immunoprecipitation (chip) assay i HCT116 cellene for å bekrefte
i vivo
binding av β-catenin /TCF-4 til PLD2 arrangøren. DNA-β-catenin /TCF-4-kompleksene ble immunoutfelt med antistoff som er vist i figur 4E, etterfulgt av reversering av tverrbinding og Q-RT-PCR ved anvendelse av primere som flankerer både TBE1 og TBE2, som er plassert i proksimal posisjon til hverandre. Som vist i figur 4E, renset rekombinant Wnt3a forbedret binding av β-catenin /TCF-4 til begge TBES av PLD2 promoteren. Disse resultater er sammenlignbare med de av promotoren analyse ved bruk av mutagenese. Wnt signal mål beta-catenin til kromatin for fjerning av corepressor HDAC1 (histondeacetylase 1) [34]. Som forventet, Wnt3a undertrykte betydelig binding av β-catenin til to TBES av PLD2 arrangøren etter chip analysen, ved hjelp av anti-HDAC1 antistoff. Videre fant vi at TCF bindingsseter på PLD2 promoter er bevart over arter (figur 4F). Samlet utgjør disse data viser at PLD2 genet er et direkte mål for transkripsjonen β-catenin /TCF signalering in vivo.
PLD-isozymer er nødvendig for dannelsen av den β-catenin /TCF-4-kompleks og fremming av β-catenin /TCF transkripsjonen aktivitet
Vi undersøkte spørsmålet om hvorvidt Wnt signalutløst PLDS oppregulering kan modulere β-catenin avhengig TCF transkripsjonen aktivitet via en positiv feedback loop. Ektopisk ekspresjon av en konstitutiv aktiv mutant av β-catenin øket TCF transkripsjonen aktivitet i HCT116 tykktarmskreftceller (figur 5A). Selektive PLD-inhibitorer er nylig blitt utviklet [35], [36].
