Abstract
LC3s (MAP1-LC3A, B og C) er strukturelle proteiner av autophagosomal membraner, mye brukt som biomarkører av autofagi. Hvorvidt disse tre LC3 proteiner har en lignende biologisk rolle i autofagi er fortsatt uklar. Vi undersøker i parallell de subcellulære uttrykk mønstre av de tre LC3 proteinene i et panel av humane kreftcellelinjer, så vel som i normale MRC5 fibroblaster og HUVEC, ved hjelp av konfokal mikroskopi og Western blot-analyse av cellefraksjoner. I cytoplasma, var det en minimal ko-lokalisering mellom LC3A, B og C farging, noe som tyder på at de aktuelle autophagosomes er dannet av bare ett av de tre LC3 proteiner. LC3A viste en perinukleær og kjernefysiske lokalisering, mens LC3B ble likt fordelt i hele cytoplasma og lokalisert i nukleolære regioner. LC3C lå i cytoplasma og sterkt i kjernen (unntatt nukleoli), hvor det i stor utstrekning samlokalisert med LC3A og Beclin-en autofagi initiere protein. Beclin 1 er kjent for å inneholde et kjernefysisk handel signal. Blokkering atom eksport funksjon av Leptomycin B resulterte i atom akkumulering av alle LC3 og Beclin-1-proteiner, mens Ivermectin som blokkerer atom innførsel viste reduksjon av akkumulering, men ikke i alle cellelinjer. Siden endogene LC3 proteiner blir brukt som markører for store autophagy i kliniske studier og cellelinjer, er det viktig å undersøke spesifisiteten av antistoffer som brukes, som kinetikken av disse molekylene ikke er identiske, og kan ha forskjellige biologiske roller. Den distinkte subcellulære uttrykk mønstre av LC3s gi grunnlag for videre studier
Citation. Koukourakis MI, Kalamida D, Giatromanolaki A, Zois CE, Sivridis E, Pouliliou S, et al. (2015) Autophagosome Proteiner LC3A, LC3B og LC3C har forskjellige subcellulære Distribusjons Kinetics og Expression i kreft cellelinjer. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10,1371 /journal.pone.0137675
Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, INDIA
mottatt: 04.07.2015; Godkjent: 20 august 2015; Publisert: 17.09.2015
Copyright: © 2015 Koukourakis et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. studien er finansiert av «opplæring og livslang læring – ARISTEIA» prosjekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013, GGET avgjørelse nummer 12605 /26.09.2012 (URL: https://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy er en viktig intracellulær reaksjonsvei for degraderingen og resirkulering av langlivede proteiner og hele organeller [1,2]. LC3s (MAP1-LC3s) er strukturelle proteiner av autophagosomal membraner. Den menneskelige LC3 genet familien har tre medlemmer, LC3A, LC3B og LC3C, mens to varianter av LC3A protein er identifisert [3,4]. Den menneskelige LC3 genet familien har tre medlemmer LC3A, LC3B og LC3C mens i en nyere artikkel har blitt rapportert fem medlemmer, LC3A (variant-en, variant-2), LC3B, LC3B2 og LC3C [4]. Skjemaet LC3-II er en av de viktigste komponentene i autophagosome membran (LC3A-II og LC3B-II, også LC3C-II, men ikke studert her) som ligger i både indre og ytre side av membranen. Den LC3-II er avledet fra et proLC3 ~ 30 kDa protein etter spalting av autophagin Atg4 for å fremstille den aktive cytosoliske formen LC3-I. Dette i sin tur aktiveres av Atg7, og deretter overført til Atg3, en andre E2 enzym, blir en membranbundet form, LC3-II [5]. Etter autophagosome formasjon, blir den LC3-II plassert i det ytre området frigitt til cytosol og den LC3-II ligger i den indre siden er degradert ved hydrolaser [6]. I denne siste formen, lokaliserer LC3-II på de sfæriske autophagosomal og autolysosomal membraner, danner en passende markør av autophagic aktivitet [6,7].
Om disse tre LC3 proteiner har en lignende biologisk rolle i autofagi eller annen trasé er fortsatt uklar. I litteraturen fleste studier fokuserer på en samlet LC3 uttrykk, uten å rapportere om spesifisiteten av antistoffer som brukes, basert på den vilkårlige antagelse at A- og B-formene er ekvivalente. I denne studien vi undersøke, etter omfattende validering antistoffspesifisitet, uttrykket i parallell av tre LC3A, B- og C-proteiner i humane kreftcellelinjer, viser tydelige mønstre av sub-cellulær lokalisering, noe som tyder på en tydelig biologisk rolle av disse beslektede proteiner .
Resultater
Identifikasjon av LC3A og B-spesifikke antistoffer
spesifisiteten av antistoffene testet mot de kommersielle tilgjengelige menneskelige rekombinante proteiner LC3A og LC3B er vist i figur 1A. Den anti-LC3A antistoffer (ap1805a og ab62720) er spesifikke for protein LC3A og anti-LC3B antistoffer (5F10 og NB100-2220) er spesifikke for protein LC3B. Den L8918, kan NB600-1384 og L7543 bindes enten til LC3A eller LC3B, men med forskjellig følsomhet, mens ab52628 ikke klarte å påvise en av de to isoformer under de samme betingelser.
(A) Spesifisitet av ulike anti-LC3 antistoffer testet mot rekombinante LC3A og LC3B proteiner. (B) Den LC3A og LC3B behandling etter 24 timer av bafilomycin (100 nM) behandling i glioma og brystkreft cellelinjer, ved hjelp av LC3A bestemt ab62720 og av LC3B spesifikke 5F10 antistoffer (C) Dobbel immunofluorecence i A549 cellelinje ved hjelp av ab62720 gjenkjenne utelukkende LC3A proteinet og 5F10 antistoff som reagerer utelukkende med LC3B. Bemerket en tydelig tydelig uttrykk for LC3A i grønne vakuoler med perinukleær /kjernefysiske lokalisering og av LC3B røde vakuoler som har en diffus, gjennom cytoplasma, lokalisering. Det er ingen autophagosomes sammensatt av både LC3A og LC3B proteiner (C1, C2), mens LC3A og LAMP2a viser omfattende colocalization (C3, C4). Den distinkte identitet LC3A og LC3B autophagosomes ble også bekreftet under sure forhold (C5) og etter eksponering for bafilomycin (c6). (D) Double immunofluorecence i A549 cellelinje ved hjelp av ab62720 erkjenner utelukkende LC3A protein og NB600-1384 som reagerer med både LC3A og LC3B proteiner. Bemerket at flertallet av perinukleær /atom LC3A (grønn) vakuoler vise dobbel immunfluorescens (gul), et resultat av dobbel LC3A /LC3B reaktivitet som produserer NB600-1384 antistoff. (E) LC3A og LC3B sirnas spesifikt blokkere ekspresjon av LC3A og LC3B proteiner henholdsvis i A549 cellelinje (E1,2,3). I E4 reaktivitet LC3A (ab62720 Ab) og av LC3B (5F10 antistoff) vises, følger stanse av den LC3A eller av LC3B gener, i A549-cellelinjen.
Vi har fokusert på både LC3A og LC3B proteiner for å analysere autophagic respons på bafilomycin i cellelinjer ved hjelp av de to antistoffer som selektivt gjenkjenner disse isoformer. De to isoformer viste forskjellig basislinje og responsprofil uttrykket (fig 1B) Under bafilomycin spenning der var akkumuleringen av LC3A-II og LC3B-II i alle cellelinjer, noe som tyder på at begge proteiner kan brukes til å vurdere autophagic fluks (fig 1B) . De T98G og BT474 cellelinjer har høyere autophagic fluks (vurdert enten ved LC3A eller LC3B immunoblotting) sammenlignet med U87MG og MDA-MB-231 henholdsvis (figur 1B).
LC3A og LC3B uttrykke autophagosomes
Konfokalmikroskopi med dobbelt LC3A /B immunfluorescens, ved hjelp av LC3-type spesifikke antistoffer, avslørte at LC3A og LC3B autophagosomes er forskjellig, og at det ikke er noen autophagosomes uttrykker begge proteiner (fig 1C1 og 1C2). Dette funnet var universell i alle cellelinjer undersøkt. Colocalization analyse viste en prosentvis 1% mens LC3A /LAMP2A colocalization i kontrollceller var høyere enn 20% (Fig 1C3 og 1C4)
Den distinkte identitet LC3A versus LC3B autophagosomes ble også bekreftet etter intensivering av autofagi. under sure betingelser (fig 1C5) og etter autofagi flux blokkering etter eksponering for bafilomycin (fig 1C6). I kontrast, ikke-spesifikke antistoffer viste et bredt innkopiering uttrykk, et resultat av dual anerkjennelse av LC3A og LC3B av antistoff (Fig 1D1 og 1D2).
Ved hjelp av siRNA for LC3A og LC3B, disse spesifikt blokkert akkumulering av LC3A eller LC3B autophagosomes, henholdsvis (fig 1E1, 1E2 og 1E3). Stanse av LC3A eller LC3B konstatert tap av identifiseringen av de respektive proteiner i vestlige blotter (fig 1E4).
Cytoplasmatiske LC3A og LC3B lokaliseringsmønster
Fordelingen av LC3A og LC3B i cytoplasma var ganske tydelig. LC3A ble hovedsakelig samlet i perinukleær området, mens LC3B ble jevnt fordelt i hele cytoplasma. Dette fenomenet var tydelig i alle cellelinjene som ble undersøkt og som vist ved cytoplasmisk ekspresjon intensitet analyse, perinukleært LC3A nådde opp til 90% (område 60-90%) av det totale proteininnhold cytoplasmiske (fig 2A1-2A7). Av og små LC3A + autophagosomes inkludert i LC3B + autophagosomes var tydelig i cytoplasma (fig 2A1 og 2A2).
(A) Confocal dobbel immunfluorescens for LC3A (grønn) og LC3B (rød) i ulike cellelinjer. Bemerket LC3A opphopning i perinukleær området, mens LC3B er fordelt over hele cytoplasma (A1-7). LC3 aggregater, tyder på små LC3A + autophagosomes inkludert i LC3B + autophagosomes, er tidvis tilstede (bokser i ã1,2). Western blot bekrefte den kjernefysiske nærvær av LC3A i kjernen, i hovedsak med den LC3A-II-form (A8). (B) nucleoli er farget med MIB1 /grønn (B1), den LC3B /rød (B2), men ikke den LC3A /fiolett antistoff (B3); LC3A bestemt ap1805a og av LC3B spesifikke 5F10 antistoffer ble brukt. Dette bekreftes i dobbel farging for LC3A /MIB1 (B4), LC3B /MIB1 (B5) og LC3A /LC3B (B6). Bemerket at LC3B flekker de interne nukleolære områder, mens MIB1 det perifere. (C) Actinomycin D skader nucleoli og forstyrrer nucleaolar LC3B og MIB1 lokalisering (C1). Sure betingelser (pH = 6,5; C2) eller hypertermi (40 ° C; C3) ikke oppheve fordeling av LC3B i nucleoli eller noen av LC3A i kjernene. Lamin er også brukt som en kontroll for å bekrefte tilstedeværelse av kjerner bare i kjernefraksjonen.
Nuclear LC3A og LC3B lokaliseringsmønster
LC3A var tydelig lokalisert i kjernen av all kreft cellelinjer undersøkt, inkludert HUVEC s og den humane MRC5 fibroblast-linje (figur 2A1-2A7). Western blot analyse etter trippelfraksjonering (atom pellet-supernatant) viste tydelig nærvær av LC3A proteiner i kjernen, mer tydelig som LC3A-II form, som var mer fremtredende i glioblastom celler (Fig 2A8).
LC3B var dårlig uttrykt i kjernen, men sterkt uttrykt i nukleolære regioner, et område som var negative for LC3A. Nukleolært sterk farging er tydelig i 60-95% av celle avhengig av cellelinjen. For eksempel A549 lungekreft cellelinjen oppviser denne fargingsmønster i 60% av dyrkede celler, mens denne er så høy som 95% i lungekreft H1299 cellelinjen. Fig 2B1-2B6 viser et typisk mønster av uttrykk i 4-farge konfokalmikroskopi. Ki67 flekker nucleoli og colocalizes med LC3B, men ikke LC3A. Behandling av celler med Actinomycin D (fig 2C1) som skader nucleoli resulterte i mangel på LC3B og Ki67 lokalisering i kjernene. I motsetning til dette ble eksponering av celler til sure betingelser (pH = 6,5) eller hypertermi (40 ° C) i 24 timer ikke oppheve fordelingen av LC3B i nucleoli eller fra LC3A i kjernen (fig 2C2 og 2C3). Western blot-analyse i atomfraksjonen bekreftet tilstedeværelsen av den LC3B proteinet (figur 3).
(A, B, C), 24 timers inkubering med Leptomycin B på 10 ng /ml, resulterer i akkumulering av nukleær LC3A, LC3C og Beclin-en i lunge A549, H1299 og glioblastom U87, T98 cellelinjer. (D) 24 timer inkubasjon med Ivermectin på 100 ug /ml, reduserte den kjernefysiske ekspresjon av LC3A /Beclin-1 i A549 og H1299 cellelinjer og økt perinukleære akkumulering av LC3A i H1299 cellelinjen. (E) vestlige blotter av atomcellefraksjon bekrefte opphopning av LC3s og Beclin-en i lunge og glioblastom cellelinjer etter inkubasjon med Leptomycin B. Reduksjonen av proteiner etter inkubasjon med Ivermectin var ikke konsekvent i alle cellelinjer.
uttrykk for LC3C
LC3C ble klart uttrykt i cytoplasma og mer intensivt i kjernen av celler (figur 4A). Western blot analyse viste en tydelig tilstedeværelse av LC3C i det nukleære fraksjon (figur 4E). Det var ingen tydelig lokalisering i nukleolære områder og i dobbel immunfluorescens med LC3B det tydelig mangel på collocalizaton i nucleoli og i cytoplasma (figur 4B). I dobbel immunfluorescens, LC3C ble omfattende samlokalisert med LC3A i atomområdet (fig 4C og 4D), mens deres colocalization var minimal i cytoplasma. Den fremtredende ekspresjon av LC3C i kjernene ble også bekreftet i Western blot-analyse (figur 4E). Disse funn ble bekreftet i alle cellelinjene som ble undersøkt. Tabell 1 oppsummerer de forskjellige uttrykk mønstre for LC3A, LC3B og LC3C.
(A) Cytoplasmatisk og nukleær farging av LC3C (rød) i U87 cellelinje. (B) Dobbelt LC3C (rød) og LC3B (grønn) farging i U87-celler som viser mangel på ko-lokalisering mellom de to proteiner, både i cytoplasma og de nukleære /nukleolære regioner. (C, D) Double LC3C (rød) og LC3A (grønn) farging viser samlokalisering mellom de to proteiner, hovedsakelig i kjernefysiske området (U87 og T98 cellelinjer). (E) Western blot for LC3C i atom (N), Pellet (P) og Løselig (S) fraksjon av U87 og T98 celler. «M» er markør og Lamin brukes som en kontroll for å bekrefte tilstedeværelse av kjerner bare i kjernefraksjonen.
LC3 nucleo-cytosolic trafficking
Celler ble inkubert i 24 timer med Leptomycin B, et spesielt og potent hemmer av CRM1 /exportin en sti av kjernefysisk eksport. Ved 10 ng /ml for 24 h inkubering ble akkumulering av LC3A i kjernen økes, noe som tyder på en blokkering av LC3A ekstrudering kinetikk fra kjerner (fig 3A). Av interesse, LC3A atom opphopning viste en intens samlokalisering med autofagi signaliserer protein Beclin-en, og lignende kinetikk etter Leptomycin B eksponering (Fig 3B). Lignende kinetikk og colocalization mønstre med Beclin-en ble bekreftet for LC3C protein (figur 3C).
Ivermectin, derimot, er en potent hemmer av importin
α Twitter /
β product: (Imp
α Twitter /
β
1) kjerne import avhengig transport. Celler ble inkubert i 24 timer sammen med Ivermectin ved forskjellige konsentrasjoner. Etter en 24 timers inkubasjon ved 100 ug /ml, akkumulering av LC3s og av Beclin-1 i kjerner ble redusert, mens cytoplasmatisk farging ble øket (figur 3D og 3E). Funnene, men varierte mellom cellelinjer, som reduksjon uttrykk ikke ble bekreftet for alle proteiner i alle cellelinjer.
Diskusjoner
Hos mennesket er LC3 genet familien har fem medlemmer, LC3Av1 ( variant 1; NM_032514), LC3Av2 (variant 2; NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) og LC3C (NM_001004343). Den geneloc for LC3A er 20.q11.22 mens for MAP1LC3B er 16q24.2 og MAP1LC3C er 1q43. Både LC3A og LC3B er forskjellig uttrykt i normalt vev [3,4,7,8]. Videre er LC3C (den tredje isoformen av LC3 familien) antas å være dårlig eller ikke uttrykkes i de fleste normale vev [3,4,7]. Men bare den LC3A (variant 1), LC3B og LC3C har vært show å ha post oversettelse modifikasjon og generere form-II [4]. Videre går tilbake til litteraturen [3,7,8] innlegget oversettelse stedet for MAP1LC3B bare er ikke bevart. For eksempel He et al. 2003 [3] rapporterte at viktig område for den distinkte post-oversettelse modifikasjon av MAP1LC3B er Lys-122 i stedet for bevart Gly-120, som rapportert for MAP1LC3A og MAP1LC3C. På den annen side Tanida et al. 2005 [8] rapporterte at karboksylsyreenden av MAP1LC3B spaltes for å eksponere Gly (120) for ytterligere ubiquitylation lignende reaksjoner. I disse to publikasjonene sømmer det at MAP1LC3B produsere LC3B-II, mens post-translasjonell modifikasjon området ikke er konservert.
I litteraturen best studerte endogene autophagic markør er LC3B. Det understrekes imidlertid at flertallet av studiene utført bruke anti-LC3 antistoffer antas å være anti-LC3B og ikke anti-LC3A, uten å ha bekreftet sin spesifisitet [9,10,11]. Det er en høy identitet mellom LC3A og LC3B isoform, noe som indikerer at epitopene som brukes til å utvikle spesifikke antistoffer er avgjørende. Ifølge våre resultater noen antistoffer er ikke bestemt, erkjenner begge isoformer med en varierende følsomhet, mens andre er i stand til å oppdage de spesifikke isoformer av LC3A og LC3B. I alle fall, ville spesifisere LC3-type undersøkt være unødvendig dersom faktisk de forskjellige LC3 proteinene hadde den samme uttrykksmønster og biologi i normale og kreft vev. Dette er imidlertid ikke tilfelle som vist i denne studien.
I en tidligere studie av våre [12], undersøke autophagic fluksen i mus vev etter ulike påkjenninger, immunoblotting arbeid viste at LC3A protein følger diskrete mønstre av LC3A-i og LC3A-II endringer i lever, lunge, nyre og hjerte vev av mus. Dette understreket at LC3A er også understreke induserbar og har spesifikke mønstre av uttrykk for sin løselig og autophagosome bundet form. Heri, i konfokalmikroskopi ved hjelp av validerte spesifikke anti-LC3 antistoffer vi bekreftet at LC3A og LC3B autophagosomes er tydelig, aldri komponert av både proteiner og har tydelig subcellulære fordeling. Den LC3A utbredt perinukleær uttrykk i kontrast til den ganske homogen fordeling av LC3B hele cytoplasma, noe som tyder på en klar biologisk rolle mellom de to autophagosome typer. Av interesse, i en artikkel av Bai et al. 2012 [4]. LC3A og LC3B ofte samlokalisert i samme puncta i sult forhold (67%), mens i basale forhold samlokalisering var på 13% i Saos-2 celler. Vi har også nevnt, i konfokalmikroskopi, en sporadisk colocalization av LC3A og LC3B, gir inntrykk av et stort LC3B + autophagosome fordøye en LC3A + ett.
cytoplasmatiske biologi LC3 mediert autophagy er godt undersøkt. Rollen LC3s i kjernen er fortsatt uklar. Karim et al først oppdaget den LC3-II protein form i kjernen av rotte hepatocytter [13], som er i samsvar med vår upublisert erfaring med BALB /c mus hepatocytter. Drake et al rapporterte at selv om LC3A og B dele ingen kjente kjernelokaliseringssignal, kan en kjernefysisk eksport signal eksisterer, som ligger på restene 63 til 73 av menneskelig LC3 [14]. EGFP-LC3 protein ble klart lokalisert i kjernen av COS-7-celler. I denne studien, ved hjelp av et bredt spekter av cancercellelinjer, så vel som normale humane fibroblaster og endotelceller, bekreftet vi atom nærvær av alle tre LC3 proteiner. Det var imidlertid en slående differensial lokalisering av LC3B protein som fortrinnsvis lokalisert i nukleolære regioner, mens A og C formene ble lokalisert i det ekstra-nukleolært atomområdet. Rollen til denne LC3B nukleolært uttrykket er fortsatt et mysterium, akkurat som rollen LC3A og LC3C i resten av kjernen. Han et al foreslo at atom LC3 kan være involvert i kontrollen av cellevekst i promyelocytic leukemi [15].
Vi har undersøkt hvorvidt kjente atomtransportveier er involvert i Nucleo-cytosolic smugling av LC3s. Den kjernefysiske protein import og eksport sti mediert av kjernefysiske pore komplekser (NPC) ble undersøkt ved hjelp av agenten Leptomycin B, et soppdrepende antibiotikum, som spesifikt og potent hemmer av den CRM1 /exportin en sti av kjernefysisk eksport av direkte binde CRM1 protein [16 , 17]. Etter 24 timers inkubering av lunge- og glioblastoma cellelinjer, en betydelig akkumulering av LC3A, LC3C og av Beclin-1-proteiner var tydelig ved konfokal mikroskopi, som også ble bekreftet på western blot analyse. Dette står i kontrast til funnene av Drake et al [14], hvor en kort 3 h inkubering av COS-7-celler og HeLa med Leptomycin ikke resulterte i EGFP-LC3 atom akkumulering. Beclin-en inneholder en leucine-rik kjernefysisk eksport signal og forstyrrelse av CRM1 funksjons resultater i kjernefysiske opphopning av Beclin-1 [18]. Av interesse, Beclin-en co-lokaliserer i kjernen med LC3A og LC3C, mens ingen fremtredende samlokalisering ble notert i cytoplasma. Enten Beclin-en binding til LC3 er nødvendig for kjernefysisk inngangen til en komplekse krav nærmere undersøkelse.
Ivermectin, derimot, er en potent hemmer av importin
α Twitter /
β product: (Imp
α Twitter /
β
1) kjerne import avhengig transport, med ingen effekt på proteiner som inneholder kjernefysiske lokalisering signal (NLSs) anerkjent av alternative atomimport trasé [19] Inkubasjon av kreftcellelinjer med Ivermectin resulterte i redusert ekspresjon av LC3s og Beclin-en i kjernen, et resultat som imidlertid variert mellom cellelinjer og proteiner som ble undersøkt.
Siden endogene LC3 proteiner er viktige markører for autophagy, er det viktig for å kontrollere spesifisiteten av antistoffer som brukes ved utførelse av eksperimenter for LC3A eller LC3B behandling som reaksjon på annen type stressfaktorer. Disse molekylene er ikke identiske, og kan ha forskjellige biologiske roller, ikke godt avklart ennå. Den nukleolært LC3B lokalisering og atom LC3A, LC3C og Beclin-en opphopning funnet i denne studien gir grunnlag for videre studier på den distinkte biologiske rolle disse proteinene kan ha i normale og kreft vev.
Materialer og Metoder
Cell linje kulturer
lungekreft cellelinjer A549 (human lunge adenokarsinom, CLS GmbH, Tyskland), og H1299 (human ikke-småcellet lungekreft, ATCC), glioblastom cellelinjer U87MG ( human glioblastom-astrocytom, CLS GmbH, Tyskland) og T98G (human glioblastoma multiforme, ATCC), brystkreft-cellelinjer (HER2 + BT474, HER negativ MDA-MB-231, DA3; ATCC), så vel som embryonisk MRC5 fibroblaster cellelinjer ( CLS Cell linjetjenesten, Tyskland) ble dyrket ved hjelp av DMEM basal medium (31885-023, Gibco). HUVEC celler (CLS Cell linjetjenesten, Tyskland) dyrket i bestemt medium (EBM ™ -2 Basal Medium EGM ™ -2 SingleQuots ™ av vekstfaktorer; Lonza) ble også undersøkt. Basaldyrkningsmedium supplert med 10% FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (15140-122, Gibco) og 2 mM L-glutamin (25030, Gibco). Celler ble opprettholdt ved standardbetingelser, 37 ° C, 5% CO2 i fuktig atmosfære og ble brukt når det når 70-90% konfluens.
Chemicals
Cellekulturene ble behandlet separat, som spesifisert i 24 timer inkubasjonstid med Leptomycin B (L2913, Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 20 ng /ml og Ivermectin (I8898, Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 100 ug /ml.
Identifikasjon av LC3A, B og C spesifikke antistoffer
for å teste spesifisitet av kommersielt tilgjengelige antistoffer om deres spesifisitet for LC3A eller LC3B følgende antistoffer ble brukt mot den kommersielle tilgjengelige menneskelige rekombinante proteiner LC3A (H00084557-P01, Abnova) og LC3B ( H00081631-P01, Abnova):
kaninpolyklonalt til LC3A (1: 30.000, ab62720, Abcam, et syntetisk peptid PSDRPFKQRRSFADR konjugert til KLH ved en cysteinrest linker, tilsvarende aminosyrene 2-15 av Menneskelig MAP1LC3A)
kaninen polyklonale å LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, et syntetisk mellom 97 ~ 120 aminosyrer fra C-terminal spaltningssetet til human spaltet-LC3A bruk som en epitop)
kanin monoklonalt til LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam)
kaninpolyklonalt til LC3B (1: 5,000, NB600-1384, Novus, et syntetisk peptid gjort til den N-terminale region av det humane LC3, isoform B protein), etter
kaninen polyklonale å LC3B (1: 5.000, L7543 Sigma-Aldrich, et syntetisk peptid tilsvarende aminosyrene 2-15 av menneske LC3B, konjugert til KLH)
den kaninpolyklonalt til LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, et syntetisk peptid gjort til en N-terminale del av den humane LC3B proteinsekvensen mellom restene 1-100)
kaninpolyklonalt til LC3 ( 1: 5,000, L8918, Sigma-Aldrich, et syntetisk peptid svarende til aminosyrene 36-49 av human LC3A isoform a, konjugert til KLH via C-terminale cysteinrest)
mus monoklonalt antistoff mot den. LC3B. (1: 5000, 5F10, nanoverktøy, et syntetisk peptid gjort til en N-terminal del av den menneskelige LC3B protein)
Når det gjelder anti-LC3C anibody, vi brukte kanin polyklonale (18726-1-AP, Proteintech Europa) antistoff. Spesifisiteten av anti-LC3C antistoff som brukes er tidligere blitt rapportert (https://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).
Eksponering til bafilomycin
LC3A og LC3B ble analysert i cellelinjer etter eksponering for autophagy forstyrre midlet bafilomycin A [8]. Bafilomycin A er en spesifikk hemmer av den vacuolar type H (+) – ATPase (V-ATPase) i celler, hemmer surgjøring av organeller som inneholder dette enzym (for eksempel lysosomer og endosomer) og dessuten hemmer fusjon av autophagososomes med lysosomer [8]. Vurderingen ble foretatt 24 timer etter inkubering av cellene med 100 nM bafilomycin.
SDS-PAGE og immunblotting
Celler ble vasket to ganger med PBS og lysert i en sukrose-baserte lyseringsbuffer (0,25 M sukrose , 25 mM Tris-HCl, pH 7,4) inneholdende proteaseinhibitorer (komplett mini protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics GmbH) og fosfatase-hemmere (fosfatase-inhibitor cocktail, Cell Signaling Technology). En differensialsentrifugering av det hel-celle-lysatene ført til kjernefysiske, supernatant (cytoplasma-vannoppløselige proteiner) og pellet (membranproteiner) fraksjoner. Protein kvantifisering ble utført i henhold til den Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (# 23225, Thermo Scientific).
Proteinprøver ble separert på diskontinuerlig SDS-geler under anvendelse av 10% separering av gelen for Beclin-1, mens for LC3A, og LC3B LC3C 12,5% separering av gelen ble anvendt. Dessuten ble 5% stabling gel anvendt. Førti nanogram prøver analysert på gelen. Immunoblotting ble utført anvendelse av PVDF-PSQ-membraner (Millipore Corp.). Deretter ble membranene blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (TBS) og 0,1% (v /v) Tween-20 ved romtemperatur i 2 timer, fulgt av hybridisering over natten ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranene ble deretter hybridisert i 2 timer ved romtemperatur med det sekundære antistoff, geit polyklonalt til kanin IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1706515, USA) eller geit polyklonalt til muse-IgG-HRP (1: 3.000, Biorad, 1706516, USA). Bånd ble utviklet ved hjelp av Chemidoc MP Imaging System (Biorad, USA)
De primære antistoffer som ble brukt var: i.) Kanin polyklonale til LC3A (1: 1.000, ab62720, Abcam, et syntetisk peptid PSDRPFKQRRSFADR konjugert til KLH av en cysteinrest linker, tilsvarende aminosyrene 2-15 av Menneskelig MAP1LC3A), ii) monoklonalt antistoff fra mus til LC3B (1: 1,000; LC3B 5F10 nanoverktøy), iii) kanin polyklonale antistoffer mot MAP1LC3C (1: 1.000, ProteinTechLab) og iv) kaninpolyklonalt antistoff til Beclin-en (1: 2.000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., USA)
Hver av disse blottene ble deretter strippet, tørket over natten, re-hybridisert med muse-monoklonalt antistoff mot Actin beta. (1: 5000, NB600-501, Novus Biologicals)
siRNA
LC3A sirnas ble slått sammen som (5′-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 «), (5’GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3′ ), (5»-CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3 «), (5′-GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3′), og LC3B siRNA ble slått sammen henholdsvis som (5»-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 «), (5′-CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3′), (5»- GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 «). Disse ble tilpasset syntetisert fra Shanghai GenePharma Co., Ltd (Kina). Disse ble brukt ved 20-50 nM for å transfektere celler ved hjelp HiPerfect (QIAGEN) i 24 timer, mens ved å stanse effektiviteten av sirnas ble bekreftet både ved konfokal mikroskopi og Western blot etter 24 timer.
Confocal immunfluorescens og Bildeanalyse
for immunfluorescens farging ble cellene dyrket på No. 1.5 dekkglass, fiksert i 3,7% paraformaldehyd /PBS pH 7,4 i 20 minutter ved 37 ° C og deretter permeabilisert i PBS /0,1% volum /volum Triton X- 100 pH 7,4 i 5 minutter ved romtemperatur. I tillegg ble cellene blokkert i PBS /5% vekt /volum BSA, pH 7,4 i 20 minutter og farget med forskjellige primære antistoffer: anti-Ki67 (MIB1) musemonoklonalt (1: 150; DAKO), anti-LC3A kanin polyklonale (1 : 500; Abcam), anti-LC3C kaninpolyklonalt (1: 200; Proteintech Europe), anti-LC3B musemonoklonalt (1: 200; nanoverktøy) og anti-Beclin-1 polyklonalt kanin (1: 100, ab62557, Abcam) for . 1 time ved romtemperatur
Celler ble vasket i PBS, pH 7,4, inkubert med passende CF 488 og 564 sekundære antistoffer ved RT og DNA ble motfarget med Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Etter siste vask dekk ble montert i hjemmelaget Mowiol monteringsmedium. Imaging ble utført på en tilpasset Andor revolusjon Spinning Disk Confocal System bygget rundt et stativ (IX81, Olympus) med et 60x objektiv og et digitalt kamera (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-DUTH). Bilde Kjøpet ble utført i Andor IQ to programvare. Optiske seksjonene ble registrert hver 0,3 mikrometer. Alle Konfokalmikroskopi bildene som presenteres i dette arbeidet er 2D maksimal intensitet projeksjoner av z-stack bilder og bildeanalyse for de innhentede datasettene har blitt utført ved hjelp av ImageJ 1.47v (National Institute of Health, USA). Samlokalisering analyse bilder og beregning av Pearsons koeffisienten for de analyserte bildene ble utført ved hjelp av en kombinasjon av colocalization Finder og Coloc 2 plugins i ImageJ.
Etikk
Studiet er godkjent av Democritus University of Thrace forskningsetiske komité.
Takk
studien er finansiert av «TRENING og livslang læring-ARISTEIA» prosjekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013, GGET beslutningen nummer 12605 /26.09.2012
