Abstract
Gage proteiner er svært like, primat-spesifikke molekyler med unike primærstruktur og udefinerte cellulære roller. De er begrenset til celler i kjønnsceller hos voksne friske individer, men er bredt uttrykt i et bredt spekter av cancere. I en gjær to-hybrid skjerm identifiserte vi metazoan transcriptional regulator, Kimcelle-mindre (GCL), som et samspill partner av GAGE12I. GCL binder direkte LEM-domene proteiner (LAP2β, emerin, Man1) ved kjernekraft konvolutt, og vi fant ut at Gage proteiner ble rekruttert til den kjernefysiske konvolutten indre membran av GCL. Basert på gjær to-hybrid analyse og trekke ned eksperimenter av GCL polypeptider, GCL rester 209-320 (som inkluderer TILBAKE domene) ble utledet tilstrekkelig for tilknytning Gage proteiner. GAGE mRNA og GCL mRNA ble påvist i menneskelig testikkel og de fleste typer kreft, og på Gage medlemmer protein nivå og GCL var co-uttrykt i kreftcellelinjer. Strukturelle studier av Gage proteiner viste ingen tydelig sekundær eller tertiær struktur, noe som tyder på at de er egentlig uoversiktlig. Interessant Gage proteiner dannet stabile komplekser med dsDNA
in vitro
fysiologiske konsentrasjoner, og GAGE12I bundet flere forskjellige dsDNA fragmenter, noe som tyder sekvens-spesifikk binding. Dual sammenslutning av Gage familiemedlemmer med GCL ved kjernekraft konvolutten indre membran i celler, og med dsDNA
in vitro
, implisere Gage proteiner i kromatin regulering i kjønnsceller og kreftceller
Citation.: Gjerstorff MF, Rösner HI, Pedersen CB, Greve KBV, Schmidt S, Wilson KL, et al. (2012) Gage kreftfrem kimcellelinje antigener blir rekruttert til Nuclear konvolutt med Germ Cell-Less (GCL). PLoS ONE 7 (9): e45819. doi: 10,1371 /journal.pone.0045819
Redaktør: Eugene A. Permyakov, russiske Academy of Sciences, Institute for Biological Instrumentation, Russland
mottatt: 13 april 2012; Godkjent: 22 august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Gjerstorff et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den danske Forskningsrådet, den danske Kreftforeningen, National Institutes of Health (RO1 GM48646), den danske Cancer Research Foundation, Lundbeck Foundation, LeoPharma Research Foundation, og Hørslev Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
GAGE serie med svært identiske, små oligomere proteiner er uttrykt fra et locus inneholder 13-39 eksemplarer av nesten identiske gener på X-kromosomet [1], [2]. Gage gener er bare til stede i høyere primater og har gjennomgått rask ekspansjon muligens på grunn av sterk positiv utvelgelse [3]. Hos friske individer Gage uttrykk er begrenset til kjønnsceller [4], men transkripsjon av Gage gener aktiveres ved epigenetisk feilregulering i kreftceller [5]. GAGE-proteiner blir uttrykt i en rekke kreftformer, og deres ekspresjon korrelerer med dårlig prognose i magekreft, spiserørskreft og neuroblastom, noe som indikerer en rolle i tumorgenese [6]. Gage proteiner er kjent for å øke celle resistens mot ulike cytostatika ved direkte assosiere med, og som påvirker nivået av, apoptotiske regulatorer IRF1 og NPM1 [7], [8], men lite er kjent om deres molekylære eller cellulære funksjoner.
Her er vi rapportere at Gage proteiner samhandle med GCL, en metazoan protein viktig for kjernefysisk konvolutt integritet og bakterie celle utvikling i
Drosophila Hotell og mus [9], [10]. I begge artene, lokaliserer GCL ved den indre kjernemembranen, og flere linjer av bevis tyder på at GCL hemmer transkripsjon: GCL er nødvendig for å dempe transkripsjon i
Drosophila
kjønnsceller [11], og i pattedyrceller, GCL binder den heterodimere transkripsjonsfaktor DP og dermed hemmer DP-E2F-avhengige gener, som er nødvendig for innreise til S-fase. GCL også direkte binder minst tre LEM-domene proteiner (emerin, MAN1 og LAP2β [12] – [14]) som ligger ved kjernekraft indre membran, og ser ut til å kreve LEM-domene proteiner som co-repressors
in vivo
[13], [15]. LEM-domene proteiner binde lamins (atommellomfilamenter) og er sentrale komponenter i kjernefysisk «lamina» struktur.
Den kjernefysiske «lamina» del av nucleoskeleton består av nettverk av kjernefysiske intermediate filamenter dannet av A-type eller B-type lamins [16] i forbindelse med barriere-til-autointegration (BAF) [17], [18] og LEM-domene proteiner som emerin [19], [20]. Lamins samhandle med kromatin og en rekke strukturelle, regulatoriske og signaleringsproteiner i kjernen [21], og påvirke kjernestruktur og mange veier, inkludert utvikling, differensiering, celleproliferasjon og apoptose [22], [23]. Endringer i sammensetningen eller integriteten til nucleoskeleton kan bidra, ved mekanismer som forblir dårlig forstått, til malign transformasjon eller tumorprogresjon [24]. For eksempel A /T-rik-DNA-bindende protein SATB1 danner normalt en spesialisert kromatin-tie nucleoskeletal struktur bare i thymocytter; brystkreft celler med høy SATB1 uttrykk viser grovt misregulated genuttrykk [25], [26]. Celler som overuttrykker GCL har defekt atomstruktur, impliserer GCL som en strukturell del av kjernen [9], [10].
Vi rapporterer Gage proteiner er rekruttert til atom lamina via GCL i celler, og binder dsDNA
in vitro
. Disse resultatene tyder på at Gage proteiner kan bidra til tumorigenesis av en mekanisme som innebærer GCL og kromatin, og potensielt også atom lamina organisasjon.
Resultater
Gage Proteiner Samhandle med Transkripsjonell Regulator Germ Cell-less (GCL)
for å bedre forstå de cellulære funksjoner av Gage proteiner, brukte vi en gjær to-hybrid skjermen for å identifisere potensielle partnere. Tetrabasert screening av en testikkel cDNA bibliotek ved hjelp av full lengde GAGE12I som agn ga en klone (D2) som viser vekst på Ura- medium og blå farge på X-Gal medium, noe som indikerer samspillet mellom agn og byttedyr (Fig. 1a). Byttet plasmid av D2 inneholdt en åpen leseramme som koder rester 84-320 av menneskelig bakterie celle-mindre homolog 1 (GCL, alias GMCL1, NM178439.3). GCL tilknytning GAGE12I ble uavhengig verifisert av luciferase-baserte (Luminescence baserte pattedyr interactome kartlegging; «Lumier»; [27]) rullegardin analyser. Luciferase-merket GCL og Protein A-merket GAGE12I (eller gjensidige contructs) ble transient uttrykt i HEK293 celler. Vi deretter isolerte protein-A-fusjoner ved hjelp av IgG-belagte perler og målt luciferase-aktivitet (Fig. 1B). Normaliserte luciferasepreparater signaler (bundet /input) ble konvertert til Z-score, som representerer antall standardavvik fra gjennomsnittet av et stort sett uavhengig avledet, ikke-interagerende Lumier protein parene [27]. GAGE12I-GCL parene utstilt Z score i størrelsesorden 3.4 til 5.3 (Fig. 1B), som klart viser en interaksjon mellom disse proteinene. I denne analysen GCL også forbundet med GAGE2B (Z poengsummer.: 1.8 til 5.3; figur 1 B), som representerer den GAGE2-typen (GAGE2A-E) familien, som alle mangler en tyrosin i posisjon 11 som kan fosforyleres i andre GAGE proteiner [28]. Dette antydet GCL kollegaer direkte eller indirekte med alle karakteriserte medlemmer av GAGE familien. Siden gjær to-hybrid analyse og pull-down-analyser er både komplekse systemer, vi også testet potensialet direkte binding mellom Gage proteiner og GCL bruker rekombinante His-merket GAGE12I produsert i gjær og en kommersielt tilgjengelig bacterially-uttrykt GCL-GST fusjonsprotein (fig. 1C). Imidlertid direkte binding av GAGE12I og GCL ble ikke oppdaget under disse betingelser. Vi spekulerer i at direkte binding av GAGE og GCL kan: (a) krever en kofaktor eller posttranslational modifikasjon ikke gitt under bakteriell uttrykk; (B) bli sterisk hindret av His-tag på GAGE12I eller GST-koden på GCL. Alternativt GAGE og GCL kan knytte indirekte.
A. GAGE12I ble anvendt som åte i et gjær to-hybrid skjerm av en testikkel cDNA-bibliotek. Plasmider som koder for antatte byttedyr er identifisert i den primære skjermen ble reddet og retransformert inn i EGY42 med agn GAGE12I vektor (B) eller kontroll-vektor (C). Clone D2 utstilt vekst på Ura- medium og blå farge på X-Gal medium, noe som indikerer en interaksjon mellom agn og byttedyr. Den kodede byttedyr polypeptid av D2 består menneske GCL rester 84-320, som inkluderer de foreslåtte BTB /POZ og TILBAKE domener. B. Samspill mellom GCL og GAGE12I ble verifisert av Lumier pull-downs fra HEK293 celler co-transfektert med Protein A-smeltet GAGE og Luciferase-smeltet GCL. Normalisert luciferasepreparater signaler (bundet /input) er presentert som Z-score, som representerer antall standardavvik fra gjennomsnittet av et stort sett uavhengig avledet, ikke-interagerende Lumier protein par (se Materialer og metoder for detaljer). C. Pull-down analysen med rekombinant His-tagget GAGE12I og GST-GCL.
Våre to-hybrid skjerm spesielt utvinnes GCL rester 84-320, som inkluderer anslåtte BTB /POZ og TILBAKE domener (rester 109-200 og 214-282, henholdsvis). I andre proteiner, er BTB /POZ domener innblandet i binding til DNA eller aktin [29], [30], mens back-domener er hovedsakelig alfa-heliks, men har ingen allment-tillagt funksjon [31]. For å finne ut hvilke GCL domener var tilstrekkelig for GAGE12I forening, vi gjentok Lumier analysen med Protein A-merket GAGE12I og luciferase-merkede GCL fragmenter vist i figur 2. Fra disse forsøkene, utledet vi GCL rester 209-320 ble både nødvendig og tilstrekkelig å omgås GAGE12I i cellene. Denne regionen inkluderte TILBAKE domene (rester 214-282) pluss 38 tilstøtende rester (rester 283-320). Vår Jpred 3 (University of Dundee, Skottland, UK) analyse spådde at GCL rester 209-320 har flere spiralformede motiver og tilfeldige spiral segmenter (fig. S1). Spesielt GCL-rester 232-285 er avgjørende for å binde til DP-subenheten av det heterodimere transkripsjonsfaktoren E2F-DP [29]. Dette er interessant fordi E2F-DP-avhengige gener fremme proliferasjon (inntreden i S-fase) og er viktige mål for undertrykkelse av tumor suppressor retinoblastom (pRb), som binder til E2F-underenheten [32] – [34]. GCL rester 232-285, som er avgjørende for å binde DP, er inkludert i den utledede GAGE-foreningen region (GCL rester 209-320) (fig. 2 og S1 fig.). Denne overlapping foreslått minst to scenarier. Først kan GAGE og DP konkurrerer om binding til GCL, og andre, kan Gage proteiner påvirke E2F-DP-avhengige genuttrykk.
Bindingen av ulike GCL delesjonsmutanter til GAGE12I ble testet av Lumier analysen (som i Figur 1). Regionen utledet som avgjørende for GAGE binding (GCL rester 209-320) omfatter rester 232-285, som er tilstrekkelig til å binde transkripsjonen aktivator DP (*) [29].
GAGE og GCL er Co -expressed i testikkel og Kreft
GAGE familiemedlemmer er uttrykt påviselig bare i germline celler og kort i spesifikke celletyper i løpet primat fosterutvikling (dvs. cellene i tidlig ektoderm, stromale celler av sex ledningen og foster binyrebarken -celler), som bestemt ved immunohistokjemisk [4], [35] og RT-PCR-analyse (fig. 3A) under anvendelse av antistoffer og PCR-primere forventes å gjenkjenne alle kjente medlemmer av familien GAGE. Men Gage proteiner uttrykt i 10-40% av bredt spekter av kreft hos mennesker [4]. GCL mRNA blir detektert overalt i Drosophila og museceller [10], [36] – [38], men dens ekspresjon i normale og maligne humane celler ikke hadde blitt systematisk undersøkt. For å finne ut hvilken menneskelig vev kan uttrykke både GAGE og GCL, brukte vi kvantitativ RT-PCR for å måle tykkelse og GCL mRNA nivåer i 48 ulike vev (Fig. 3a og 3b, henholdsvis). GAGE mRNA ble påvist ved lave nivåer i epididymous og milt, med høye nivåer i testikkel (fig. 3A), som forventet. I samsvar med musen og Drosophila, ble GCL mRNA påvist i alt, men en normal menneskelig vev testet; de høyeste nivåene ble funnet i hypofysen, og unntaket var muskel, hvor GCL mRNA ikke ble påvist (Fig. 3B). Siden GCL er spesielt uttrykt og nødvendig i Drosophila og mus kjønnsceller, spekulerer vi at GCL uttrykk i menneskelig testikkel er også sannsynlig lokalisert til kjønnsceller, hvor Gage proteiner er rikelig [4]. GCL-mRNA ble også påvist i alle typer kreft som ble undersøkt, inkludert bryst, lever, lunge og skjoldbruskkjertelkreft som tidligere ble vist å uttrykke også gage-proteiner [4], og det var ingen klar tendens mot opp- eller nedregulering av GCL mRNA ekspresjon i en hvilken som helst spesiell krefttype (fig. 3C). Vi undersøkte neste ekspresjonen av GCL og Gage proteiner i et panel av humane kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse ved hjelp av Western blotting (fig. 4). GCL ble påvist i åtte av ni cellelinjer, inkludert melanomer, brystkreft, lungekreft og embryonale karsinom, og var co-uttrykkes med Gage proteiner i 6 av disse 8 cellelinjer.
A-C. Kvantitativ RT-PCR-analyse av den relative ekspresjon av mRNA som koder for alle kjente medlemmer av familien GAGE (A) eller GCL (B) i normale vev, avslører ko-ekspresjon i testikkel. GCL mRNA ble også mye uttrykt i ulike typer kreft hos mennesker (C), inkludert bryst, lever, lunge og skjoldbruskkjertelkreft som tidligere ble vist til også å uttrykke Gage proteiner [4].
GCL og GAGE protein uttrykk ble undersøkt i 9 humane kreftcellelinjer avledet fra livmorhalsen (HeLa), kolon (HCT116), melanom (MZ2-MEL), bryst (BRCA-MZ01, SK-BR3, T47D, M4A4, MCF7) og embryo kreft (NTERA2 ) ved hjelp av Western blotting. A375-melanomceller med eksogent ekspresjon av GCL ble inkludert som positiv kontroll. Antistoffer: GCL pAb1, Sigma Aldrich; GCL pAb2, klone A14, Santa Cruz Biotech; GAGE mAb, klone M3 [4], beta-actin mAb, Ab6276; Abcam.
Potential samlokalisering av GCL og Gage proteiner i deler av normale menneskelige vev og kreft kan ikke undersøkes på grunn av mangel på egnede GCL antistoffer. Siden GCL mRNA er nesten allestedsnærværende i menneskelig vev, kan man forvente det samme for GCL protein. Men dette kan ikke forutsettes, ettersom GCL mRNA blir undertrykt på det translasjonelle nivå i embryoer som en mekanisme for å begrense ekspresjon av GCL proteinet til kimlinje [39]. Støtter hypotesen om at GCL-protein ekspresjon er begrenset, ble GCL-null-mus fenotyper detektert i bare tre celletyper (lever, bukspyttkjertel og testis) [10]. Selv GCL protein uttrykk kan være begrenset i normal menneskelig vev vår analyse av humane kreftcellelinjer tyder på at GCL protein er uttrykt i flere typer kreft.
Disse resultatene var konsistente med potensial sammenslutning av menneskelig GAGE og GCL i mannlig kjønnsceller og ulike typer kreftceller.
GCL Rekrutter Gage Proteiner til Indre Nuclear konvolutt
GCL lokaliserer diffust i kjernen og også i nærheten av atom konvolutt i
Drosophila
[38] og museceller [13], i samsvar med sin direkte binding
in vitro
til kjernefysiske membran proteiner LAP2β, emerin og man1 [12] – [14]. For å avgjøre om GCL påvirket lokalisering av Gage proteiner, vi overexpressed Myc-merket GCL i HeLa celler og brukes indirekte immunfluorescens farging for å kontrollere både kjernefysiske lokalisering av GCL-Myc og dens samlokalisering med endogen A-type lamins nær atom konvolutten (fig. 5A). Når overuttrykt i seg selv i HeLa-celler, GAGE12I lokalisert diffust med de klareste signalene inne i kjernen (fig. 5B), i samsvar med lokalisering av endogent GAGE i mange andre cellelinjer og vev [4]. Også som ventet, overuttrykt GCL-Myc lokalisert både på kjerne konvolutten (fig. 5C) og diffust i nukleoplasma [10], [13]. Interessant, i HeLa celler som forbigående uttrykt både GAGE og GCL-Myc, de fleste Gage proteiner samlokalisert nær atom konvolutt med GCL-Myc, som vist for GAGE12I (Fig. 5D) og GAGE1 (Fig. 5E). De samme resultater ble oppnådd i transfekterte HCT116-celler (data ikke vist). Tilsvarende i to melanoma cellelinjer (MZ2-MEL og SK-MEL-31), forbigående uttrykk for GCL-Myc forskjøvet fordeling av endogene Gage proteiner mot kjernefysiske konvolutten (fig. 5F, G). Vi konkluderte eksogene GCL kan rekruttere eksogene og endogene Gage proteiner til den kjernefysiske konvolutten.
A. Immunhistokjemisk dobbel-farging av Myc-merket menneskelig GCL og endogene A-type lamins (lamins A /C) i transfekterte HeLa-celler; GCL samlokalisert med lamins A /C ved kjernekraft konvolutten. VÆRE. HeLa-celler ble transient transfektert med GAGE12I (B), GCL-Myc (C), eller GCL-Myc pluss enten GAGE12I (D) eller GAGE1 (E). GCL lokalisert ved kjernekraft konvolutten og rekruttert Gage proteiner fra nukleoplasma. F-G. Melanomcellelinjer MZ2-MEL (F) og SK-MEL-31 (G), som uttrykker høye nivåer av endogen GAGE, ble transfektert til å uttrykke GCL-Myc; farging avslørte GCL-mediert trans av GAGE fra nukleoplasma til kjernefysiske konvolutten. H-K. Immunhistokjemisk analyse av endogene Gage proteiner i humane normale vev og svulster avslørt en tett Gage signaler nær atom konvolutt i cellene i foster binyrebarken (H), migrerer opprinnelige kjønnsceller (I), brystkreft celler (J) og malignt melanom celle (K) prøver. (GAGE = DAB /brun; Nuclei = Mayers hematoksylin /blå). Barer, 5 mikrometer (A) og 10 mm (BK).
Selv om sammenhengen mellom endogene GCL og Gage proteiner i humane celler og vev ikke kan bli etterforsket på grunn av mangel på GCL antistoffer egnet for immunocyto – og immunhistokjemi, kan Gage proteiner er blitt forventet å lokalisere ved kjernemembranen i cancercellelinjer vist å uttrykke endogen GCL ved Western-blotting (som HeLa, HCT116, MZ2-MEL, fig. 4). Men i disse cellene ble observert Gage proteiner gjennom atomrommet. Dette kan være på grunn av et behov for høye cellulære nivåer av GCL, bare oppnåelig ved overekspresjon, å rekruttere nok av atom Gage proteiner for å avsløre sin lokalisering i kjernemembranen. Dermed kan Gage proteiner lokalisere både kjernemembranen og nukleoplasma i celler med normale GCL nivåer. Spesielt, immunhistokjemisk farging av kliniske prøver med Gage antistoffer avslørte ikke-diffuse, tette Gage signaler som syntes å konsentrere seg nær atom periferien i foster binyrebarken celler (Fig. 5H), primordial kjønnsceller av mesonephros (Fig. 5i), malignt melanom celler (fig. 5J) og bryst carcinoma celler (fig. 5K), ytterligere underbygger at Gage proteiner forbinder med den indre membran av den kjernefysiske konvolutten.
Gage proteiner er egen Disordered
foregående analyse av native og det rekombinante gage-proteiner ved SDS-PAGE og størrelseseksklusjonskromatografi viste en tilsynelatende masse på 26 kDa, som var større enn dens forutsagte og MALDI MS-bekreftede masse av ~13 kDa [2], [4]. Denne anomale migrasjon kan gjenspeile den uvanlige aminosyresammensetning av Gage proteiner, som ikke har noen hydrofobe rester (15 av 117) og mange ladede rester (36 av 117). Men disse funksjonene er også karakteristisk for egen uordnede proteiner (IDPs) [40], [41]. For å vurdere denne muligheten vi brukt to forskjellige algoritmer for proteinstrukturprediksjon, FoldIndex og metaPrDOS å GAGE12I, en representant medlem av GAGE familien. Begge algoritmer spådd en stor sannsynlighet for forstyrrelse i hele proteinet (figur 6A;. Høyre og venstre paneler, henholdsvis). Siden GAGE12I er 98% identisk med nesten alle andre kjente medlemmer av GAGE familie [6] Dette antydet at Gage proteiner mangler generelt sekundærstruktur. Det eneste unntaket var GAGE1; vår strukturelle prediksjon for GAGE1, som har en unik C-terminale domene [6], foreslått denne C-terminale region er alfa-heliks (fig. S1).
A. Sekundær struktur og forstyrrelse av GAGE-12I spådd av to algoritmer: FoldIndex (venstre panel) og metaPrDOS (panel høyre). B. Far-UV-CD-spektret av GAGE-12I innspilt 195-250 nm på 4,5 uM GAGE-12I i 100 mM NaCl og 50 mM natriumfosfat, pH 5,5 ved 25 ° C. Den minste på rundt 200 nm, pluss mangel på andre distinkte minima, tydelig viser proteinet er overveiende utfoldet. C. 1D
1H-NMR-spektrum av 4 mg /ml GAGE-12I i 100 mM NaCl, 50 mM natriumfosfat pH 5,5, 0,15 mM DSS og 10% D
2O. Den svært lav spredning av NMR-signaler, spesielt merkbart i alifatiske regionen, gir et klart fingeravtrykk av en utbrettet protein.
Potensialet lidelse av GAGE12I ble testet av sirkulærdikroismeanalyse (CD) og
1 H Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi. En Far-UV CD spekteret registrert for GAGE-12I viste bare ett minimum på rundt 200 nm (Fig. 6B). Dette minimum, og mangelen på enhver tydelig negativ ellipticity i området 210-225 nm (Fig. 6B), viste at GAGE-12I ikke har noen utvidet form for sekundær struktur. Bekrefter denne observasjonen, 1D
1H-NMR-spektrum viste en smal dispersjon av signaler (Fig. 6C). I det området av spekteret som viser signalene fra alifatiske sidekjeder, observerte vi ingen negative kjemiske skift. Den smale dispersjon ble igjen tydelig for amid protonsignaler i området fra ca. 7-9 ppm. Vi konkluderte GAGE12I har ingen tydelig sekundær eller tertiær struktur.
Gage Proteiner Bind dsDNA ved fysiologiske konsentrasjoner
Gage proteiner lokal i kjernen av både normale celler (dvs. kjønnsceller og foster binyrebarken celler) og kreftceller [4]. Vi har derfor en hypotese Gage proteiner kanskje forbinder med DNA. Denne hypotesen ble støttet av rullegardin eksperimenter som viser at rekombinant GAGE12I (uttrykt i gjær og svært renset) [2]), og endogene Gage proteiner i MZ2-MEL melanom cellelysat, bundet til mors kalvethymus DNA (fig. 7, A og B henholdsvis).
A-B. Western blot av pulldown eksperimenter testing av binding av rekombinant GAGE12I (A) eller endogene proteiner GAGE fra MZ2-MEL-lysater (B) til cellulose alene, eller cellulose-immobiliserte innfødt kalvethymus dsDNA. C. elektroforetiske mobilitet skift analyser. Hver Målt konsentrasjon av renset GAGE12I ble inkubert med
32P-merket 90-bp EcoRI-PvuII DNA fragment fra pUC19 på en pg /mL; Prøvene ble deretter løst ved agarosegelelektroforese. D. Samme eksperiment som i (C), men med tilsetning av NaCl. E. Prediksjon av antatte DNA-binding aminosyrer i GAGE12I som benytter programmet BindN. +/- = Binding /ingen binding; 0-9 = tillit bindende prediksjon.
elektroforetisk mobilitet skift analyser ble brukt for å ytterligere analysere direkte sammenheng mellom Gage proteiner og dsDNA ved hjelp av ulike restriksjonsfragmentene fra plasmid pUC10 eller pUC19 (Fig. 7C og fig . S2). Ved en konsentrasjon på ~ 10 ng /mL (730 nM), GAGE12I forårsaket en undergruppe av dsDNA-molekyler til å migrere langsomt (figur 7C.). I nærvær av 100 ng /ul GAGE12I (7,3 uM) over 50% av dsDNA migrerte langsomt (nukleoprotein «kompleks 1 «) og vi har oppdaget også en enda saktere-migrerende komplekset (Fig. 7C,» kompleks 2»), noe som tyder potensiell oligomeriseringsprosessen. GAGE12I bundet flere sekvens urelaterte dsDNA fragmenter, noe som tyder DNA sekvens uavhengig bindende (data ikke vist). Både kompleksene var stabile i 75 mM NaCl, og en liten fraksjon av komplekset 1 holdt seg stabilt på 250 mM NaCl (fig. 7D).
A. Dot blots for å estimere GAGE proteininnholdet i MZ2-MEL og SK-MEL-31 helcellelysater ved sammenligning med rekombinant GAGE12I. Blotter ble analysert med antistoffer som forventes å føre alle GAGE familiemedlemmer; antall under hver prikk indikerer den relative signalintensiteten. B. Relativ kvantifisering av Gage proteiner i kjerner og cytoplasma MZ2-MEL og SK-MEL-31 celler basert på farging intensiteter av confocal bilder målt ved hjelp ImageJ64 programvare.
Vi brukte BindN nukleinsyre prediksjon programmet [42] satt til en spesifisitet på 95% for å forutsi potensielle DNA-bindingsrester i GAGE12I. Dette programmet identifisert GAGE12I rester 4-17 som en antatt DNA-bindende domene (Fig. 7E), men dette må bekreftes eksperimentelt.
Resultatene ovenfor viste en GAGE konsentrasjon på minst 10 ng /mL (730 nM) var nødvendig for å binde DNA ved en konsentrasjon på 1 pg /pl (17 pM), tilsvarende et molforhold på 43:1 (GAGE12I: DNA). For å finne ut om disse Gage konsentrasjonene var fysiologisk relevant, målte vi GAGE innhold i MZ2-MEL og SK-MEL-31 melanomcellelysatene mot kjente mengder av rekombinant GAGE12I bruker dot blotting. MZ2-MEL og SK-MEL-31-celler ble funnet å inneholde 0,53 pg og 0,29 pg GAGE protein per celle, henholdsvis (fig. 8A). Basert på en estimert melanomcellediameter på ~15 um (forutsatt en sfærisk form), ble konsentrasjonene konservativt beregnet til å være 299 ng /ul (23 pM) i MZ2-MEL-celler og 164 ng /mL (12 pM) i SK- MEL-31 celler. I begge cellelinjer, konfokal mikroskopi antydet at GAGE-signalet var 2-3 ganger mer intens i kjernen enn i cytoplasma (fig. 8B). Vi konkluderte med at den kjernefysiske konsentrasjonen av Gage proteiner i disse cellene er godt over det (7,3 mm) som kreves for -50% binding til DNA
in vitro
.
Diskusjoner
funksjonell karakterisering av Gage proteiner er viktig for å forstå sine roller i kreftcelle og bakterie cellebiologi og å vurdere deres terapeutiske potensial som kreft mål. Denne studien viste at Gage proteiner samhandle direkte eller indirekte med GCL, og at GCL rekrutterer Gage proteiner til den kjernefysiske konvolutten i cellene. Vi videre vist at GCL og Gage medlemmer co-express i humane testikkel og kreftceller. GCL er viktig for kjernefysisk konvolutt integritet og bakterie celle utvikling i både
Drosophila Hotell og mus [9], [10]. GCL konsentrerer nær atom indre membran, muligens gjenspeiler dens direkte binding til LEM-domene proteiner [12] – [14]. I
Drosophila
er GCL nødvendig for å dempe transkripsjon i kjønnsceller [11]. I pattedyrceller, binder GCL DP direkte og reduserer uttrykk for E2F-DP-aktiverte gener [29]. Disse funnene implisere GCL som en negativ regulator av DP-aktivitet. Vår tyder GCL rekrutterer også Gage proteiner til kjernefysiske konvolutten. Hvorvidt dette rekrutterings sequesters og utarmer GAGE fra andre steder av handlingen (som foreslått for visse transkripsjonsfaktorer; [43]), eller er nødvendig for GAGE å fungere, eller om GCL selv er regulert av GAGE, er fortsatt ukjent
Vi fant at Gage proteiner er egentlig-uordnede proteiner som kan binde dsDNA direkte. Andre egen-uordnede dsDNA-bindende proteiner inkluderer Mobility Gruppe Høy (HMG) domene proteiner og metyl-CpG bindende protein 2 (MeCP2) [44], [45]. Kreften-germline antigen Side4, som er både evolusjonært og strukturelt relatert til Gage proteiner (32% identitet til GAGE12I), er også egentlig uordnede og viser DNA-bindende egenskaper [46]. Ustrukturerte polypeptider ofte vedta foldede strukturer ved binding sine biologiske mål [41], [47]. Både DNA-bindende regionen GAGE, og den strukturelle grunnlaget for GAGE binding til DNA eller kromatin, er viktige temaer for fremtidige undersøkelser. Vår nåværende Resultatene tyder Gage proteiner binde dsDNA i en sekvens-uavhengig måte, i likhet med HMG domene proteiner. Imidlertid potensial fortrinnsvis binding (f.eks, til A /T-rike DNA-sekvenser, som vist for kromatin regulator SATB1; [25]) ikke er utelukket. Våre gel-shift eksperimenter viste påvisbar binding til 90-bp dsDNA fragmenter (17 PM) på en GAGE12I konsentrasjon på 0,73 mikrometer, og ca 50% binding på en GAGE12I konsentrasjon på 7,3 UM. Disse konsentrasjonene var godt under de estimerte GAGE proteinkonsentrasjonen i kjernen av melanomceller, og foreslo en
in vitro
binding støkiometri av 43-til-1 (GAGE12I-til-DNA) på 50% bindende. Siden Gage proteiner danne stabile dimerer og høyere ordens oligomerer [2], vi hypoteser dette høyt molforhold reflekterer konsentrasjonsavhengig oligomerisering av Gage proteiner.
Vi har ikke ennå forstår betydningen av GAGE binding til DNA
in vivo
, eller om dette er påvirket av GCL. Men vi spekulere Gage proteiner kan bygge bro kromatin til GCL-assosiert protein komplekser ved kjernekraft konvolutten og dermed regulere kromatin organisasjon og funksjon [22], [48]. I menneske bakterie celle avstamning, Gage proteiner er til stede i primordial kjønnsceller (PGCs) og forsvinner like før første meiotisk divisjon [35], [49]. PGCs sprer og migrere fra ryggplommesekken via rygg mesenteriet å invadere og kolonisere gonadale rygger [50]. Denne prosessen innebærer en sekvens av epigenetiske hendelser som reorganisere og omprogrammere kromatin, og til slutt skifte cellen fra en somatisk til en bakterie celle tilstand [51]. Disse epigenetiske endringene er fremdeles dårlig karakterisert, men inkluderer genome-wide tap av DNA metylering, gradvis tap av H3K9me2 og global gevinst på H3K27me3 [52]. Spesielt, epigenetiske forandringer er også sentralt i tumorigenesis, og fenotypiske likheter mellom kjønnsceller og kreftceller foreslå potensialet aktivering av en kjønnscelle-relaterte differensiering program i kreftceller [5]. Vi har derfor spekulerer i at Gage familiemedlemmer har romanen roller i høyere orden kromatin omorganisering og omprogrammering i kjønnsceller og kreftceller.
Materialer og metoder
immunanalyser
Antistoffer brukes i denne studien var: Mouse anti-GAGE (M3 [4]; immunocytochemistry [ICC], 1/100 fortynning, western blot [WB], 1/5000 fortynning), kanin anti-Myc (A14, Santa Cruz Biotech, Heidelberg, Tyskland ; ICC, 1/100), kanin anti-GCL (Santa Cruz Biotech, WB, 1/1000), kanin anti-GCL (Sigma Aldrich, Brøndby, Danmark, WB, 1/1000), mus anti-beta-Actin ( Ab6276; Abcam, Cambridge, UK, WB, 1 /200,000); FITC-konjugert geit anti-mus IgG (Dako, Glostrup, Danmark, ICC, 1/400), Cy3-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA; ICC, 1/400).
Western blot og cellefarging ble beskrevet tidligere [4]. For dot blot, oppdaget vi rekombinant GAGE12I eller mobillysatene (laget i PBS ved hjelp av kulemølle homogenisering) på aktivert PVDF membran; lufttørket membraner ble behandlet som beskrevet for vestlige blotter og kvantifisert ved hjelp av en Fusion Fx7 imager (Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell, Deutschland).
Gjær to-hybrid skjerm
gjær to- hybrid skjermen ble gjort av ProteinLinks (Pasadena, California, USA).
