Abstract
Bakgrunn
Oncogene mutasjoner er kraftige prediktive biomarkører for molekylært målrettet kreftbehandling. For mutasjon deteksjon pasienter må gjennomgå invasiv tumor biopsier. Alternativt blir arkivprøver anvendes som kanskje ikke lenger nødvendigvis den faktiske tumorstatus. Sirkulerende tumorceller (CTC) kan tjene som et alternativ plattform for å detektere somatiske mutasjoner i kreftpasienter. Vi ønsket å utvikle en sensitiv og spesifikk analyse for å påvise mutasjoner i
EGFR
genet i CTC fra lungekreftpasienter.
Metoder
Vi utviklet en roman analyse basert på virke -time polymerase kjedereaksjon (PCR), og som smelter kurve analyse for å detektere aktivering
EGFR
mutasjoner i blodcellefraksjoner anriket på CTC. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble valgt som sykdomsmodell med velig svært lave CTC teller. Analysen ble prospektivt validert i prøver fra pasienter med
EGFR
-mutant og
EGFR
-wild typen NSCLC behandlet innen en randomisert klinisk studie. Sekvensielle analyser ble gjennomført for å overvåke CTC signaler under behandling og korrelere mutasjonsdeteksjon i CTC med behandlingsresultat.
Resultater
Analyse følsomhet ble optimalisert for å muliggjøre deteksjon av en enkelt
EGFR
-mutant CTC /ml perifert blod. CTC ble påvist i forbehandling blodprøver fra alle 8
EGFR
-mutant lungekreftpasienter undersøkt. Tap av
EGFR
-mutant CTC signaler korrelert med behandlingsrespons, og dens gjentakelse innledes tilbakefall.
Konklusjoner
Til tross for lav overflod av CTC i NSCLC onkogene mutasjoner kan reproduserbart oppdaget ved å bruke en upartisk CTC berikelse strategi og svært følsom PCR og smeltekurve analyse. Denne strategien kan gjøre det mulig ikke-invasive, spesifikke biomarkører diagnostikk og overvåking hos pasienter som gjennomgår målrettet kreftbehandling
Citation. Breitenbuecher F, hoffarth S, Worm K, Cortes-Incio D, Gauler TC, Köhler J et al . (2014) Utvikling av en svært følsom og spesifikk metode for deteksjon av sirkulerende tumorceller husing somatiske mutasjoner i ikke-småcellet lungekreft pasienter. PLoS ONE 9 (1): e85350. doi: 10,1371 /journal.pone.0085350
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 01.10.2013; Godkjent: 04.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Breitenbuecher et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en Oncology Center of Excellence gi fra den tyske Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe, www.krebshilfe.de) til den vesttyske Cancer Center, egenutført forskningsmidler av det medisinske fakultet ved Universitetet Duisburg-Essen (IFORES til MS ), og en institusjonell forskningsstipend fra Boehringer Ingelheim (www.boehringer-ingelheim.com) til FB og M.S.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter. FB: Institusjonelle forskningsfinansiering (Boehringer Ingelheim). TG: Reisestøtte, honorarer og konsulenthonorarer (Boehringer Ingelheim, Pfizer, Roche, Lilly). JK: Godtgjørelse, reisestøtte (Boehringer Ingelheim, Amgen, Roche). SK: Rådgivning avgifter, honorarer, reisestøtte (Merck-Serono, Amgen, Roche). MS: Institutional forskningsmidler, konsulenthonorarer (Boehringer Ingelheim). Alle gjenværende forfattere har erklært ingen interessekonflikter. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Aktivering
EGFR
mutasjoner definere en gruppe av genetisk avhengige lunge adenokarsinomer , som er utsøkt følsomme for EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (EGFR-TKI). Terapeutiske avgjørelser hos pasienter med metastatisk NSCLC blir guidet av
EGFR
mutasjonsstatus, som bestemmes i tumor biopsier [1]. Erverv av slike biopsier kan være farlig for pasienten. Videre kan en enkelt svulst biopsi ikke fullt ut reflekterer status for en metastatisk kreft. Ikke-invasive metoder for repeterende bestemmelse av prognostiske og prediktive genetiske biomarkører kan legge til rette for personlig kreftbehandling.
Sirkulasjonstumorceller (CTC) har blitt beskrevet i flere kreft enheter. Opplisting av CTC har vært korrelert med kliniske resultater og behandlingsrespons [2] – [6]. Disse studiene har søkt immunocytokjemisk påvisning av protein markører, for det meste neglisjere genomiske biomarkører som
EGFR
mutasjonsstatus. I motsetning til leukemier, hvor maligne celler er rikelig tilstede i det perifere blod, CTC er sjeldne i pasienter med faste tumorer og en stor variasjon av CTC-tellinger er blitt observert [3], [5], [7] – [9]. CTC deteksjon basert på epitel-markører som EpCAM eller cytokeratins (CK) kan overse tumorceller som gjennomgår epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [10].
Her beskriver vi et nytt høyt sensitiv og spesifikk strategi for å detektere CTC husing somatiske mutasjoner i NSCLC pasienter. Som et proof-of-concept-modellen har vi brukt i ramme slettinger i
EGFR
ekson 19 (DelEx19), som utgjør ca 48% av alle
EGFR
mutasjoner [11]. Vi var i stand til å oppdage
EGFR
DelEx19-mutert CTC før behandling av alle pasienter med
EGFR
mutasjonsstatus kjent fra tumor biopsier som ble vurdert. Videre clearance av mutasjonspositive CTC korrelert med behandlingsrespons og sykdomskontroll.
Materialer og metoder
Genomisk DNA forberedelse
Genomisk DNA ble isolert fra PBMNC og cellelinjer ved hjelp den NucleoSpin® Blood Kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland). Hvis det er nødvendig, genomisk DNA ble amplifisert ved hjelp av Repli-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA fra cellelinjer eller plasmid DNA (pcDNA3.1V5 /HisTOPO, Clontech, Mountain View, USA) som koder for en human
EGFR
Exon 19 cDNA sekvens huse en 15 bp sletting (delE746-A750) ble fortynnet i serie. A431-cellelinjer (
EGFR
villtype, wt) og NCI-HCC-827 (
EGFR
delE746-A750) ble oppnådd fra DSMZ (Braunschweig, Tyskland) og
EGFR
mutasjonsstatus ble bekreftet av Sanger-sekvensering.
PCR forsterkning og
EGFR
DelEx19 mutasjonsdeteksjon
EGFR
DelEx19 mutasjoner ble oppdaget av smelting kurve analyse på en LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Tyskland). Optimal mutasjon følsomhet ble oppnådd ved en kombinasjon av spesielt designet hybridisasjonsprober ufullkomment binding til EGFR Exon 19 sekvenser skjuler en sletting på aminosyre posisjon 746 eller 747, låst nucleic syrer (LNA) undertrykke forsterkning av wildtypic
EGFR
sekvenser og forhindre hybridisering av sonder til wildtypic
EGFR
Exon 19 sekvenser og til slutt som gjelder asymmetriske PCR betingelser fortrinnsvis forsterke DNA-tråden hybridisasjonsprober binde seg til. Alle parametere ble empirisk optimalisert for å oppnå optimal analyse følsomhet. Hver reaksjonsblanding (20 ul) inneholdt 50 ng genomisk DNA, 2 pmol forover og 2 pmol revers primer (MWG Eurofins, Ebersberg, Tyskland; Ex19S: 5′-GTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGG-3 «, Ex19R: 5′-GGGCCTGAGGTTCAGAGC-3′), 2 ul LightCyclerFastStart DNA Master HybProbe (Roche, Mannheim, Tyskland), 3 pmol hybridiseirngsprobe 1 ( «anker»: 5’LC640-ATTTTAACTTTCTCACCTTCTGGGATCCAG-PH) og 3 pmol hybridiseirngsprobe 2 ( «sensor»: 5’TAATTCCTTGATAGCGACGGG-FL) (TIBMolbiol, Berlin, Tyskland). Alle PCR-reaksjoner ble utført med og uten tilsetning av 6 pmol bundne nukleinsyre (LNA: 5»-TAATTCCTTGATAG-NH2; TIBMolbiol, Berlin, Tyskland).
immunomagnetisk anrikning av sirkulerende tumorceller fra perifert blod
Perifert blod (20 ml) ble samlet i natriumcitrat rør (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland). PBMNC ble isolert ved tetthetsgradient sentrifugering. Median anrikning av WBC etter densitetsgradientsentrifugering var omtrent tredoblet. EpCAM-positive celler og CD45-negative celler ble anriket i to parallelle reaksjoner under anvendelse av anti-EpCAM (CD326) og anti-CD45-mikroperler (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). Genomisk DNA ble isolert fra de resulterende fire prøvefraksjoner (CD45
+, CD45
-, CD326
+ og CD326
-) og utsatt for sanntids-PCR og smeltekurve analyse
.
Mutasjon deteksjon ved sekvensanalyse
for sekvensanalyse, genomisk DNA av utvalgte prøver ble amplifisert ved hele genomet forsterkning (WGA) ved hjelp av Repli-g Midi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens bruksanvisning. All sekvens leser ble generert av en kommersiell sekvense tjeneste (LGC Genomics, Berlin, Tyskland) på en Roche 454 GS FLX + Titanium (Roche, Branford, USA) og analysert ved hjelp av CLC genomikk arbeidsbenk (CLCbio, Aarhus, Danmark). Leser ble importert til CLC genomikk benk (med * .fna og * .qual data), trimmet og tilordnet en referanse inkludert
EGFR
ekson 19 sekvens samt 50 bp opp- og nedstrøms intronsekvenser. Median dekning for ekson 19 sekvenser var 7316 leser (range 3,717-17,368).
Pasientprøver /Etikk uttalelse
Perifere blodprøver ble hentet fra pasienter med
EGFR
mutant og
EGFR
vekt NSCLC etter skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av etikkomiteen ved det medisinske fakultet ved Universitetet Duisburg-Essen (AZ. 10-4359).
statistikker
Lete statistiske analysene ble utført ved bruk av GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, La Jolla, USA) og IBM SPSS statistikk versjon 19 (IBM, Armonk, USA).
Resultater
Følsomhet og spesifisitet av mutasjonsdeteksjon
for å bestemme terskelen for
EGFR
DelEx19 mutasjonsdeteksjon ved smelting kurve analyse, vi først studert serielle fortynninger av genomisk DNA fra
EGFR
wt A431 celler og NCI-HCC-827 celler som en
EGFR
DelEx19 mutasjon (Figur 1a). Ved optimalisering av PCR-parametrene og inkludering av wt
EGFR
-spesifikk LNA sensitiviteten for påvisning ble forbedret til 0,1%
EGFR
DelEx19-mutant-sekvenser (figur 1b). I ytterligere serielle fortynninger av plasmid DNA (pcDNA3.1.EGFRdelE746-A750) mutasjonen deteksjonsgrensen var så lavt som 0,01% (data ikke vist).
A)
EGFR
DelEx19 mutasjonsdeteksjon i seriefortynnet DNA (50 ng /reaksjon) fra A431-celler (
EGFR
-wild typen kontroll) og NCI-HCC-827 celler (
EGFR
DelEx19 mutant kontroll 1). Melting topper som tyder på
EGFR
-wild typen DNA (til høyre) og
EGFR
DelEx19 (til venstre) kan være klart atskilt. Real-time PCR-reaksjoner ble utført uten tilsetning av låste nukleinsyrer (LNA) og i serielle fortynninger av DNA opp til 1:16. Vann (H
2o, bunnlinjen) og og 50 ng av ufortynnet genomisk DNA
EGFR
-wild type (A431) og
EGFR
-mutant celler (NCI-HCC-827) ble inkludert som kontroller (representative eksempler på like reaksjoner). B) Reaksjonene ble utført som i (A), men med tilsetning av LNA (6 pmol). Merk undertrykkelse av
EGFR
-wild typen signal, som tillot diskriminering av
EGFR
DelEx19 mutasjon signal opp til en utvanning av 1:1,024 ( 0,1%). C, D) Normale perifere blodprøver ble tilsatt definerte tall (0, 1, 10, 100 celler /ml) av
EGFR
DelEx19 mutante NCI-HCC-827-celler. Etter Immunomagnetisk berikelse genomisk DNA ble ekstrahert og utsatt for real-time PCR og smeltekurve analyse inkludert kontroller som i (B). Representative resultatene av genomisk DNA isolert fra leukocytt-utarmet cellefraksjoner (CD45
-, C) eller CD326-beriket cellefraksjoner (CD326
+, D) vises. I begge cellefraksjoner
EGFR
DelEx19 mutasjon signaler kan være tydelig atskilt fra
EGFR
-wild typen bakgrunn opp til en følsomhet terskel på en celle /ml. Ingen mutasjon signaler ble påvist i CD45
+ eller CD326
– cellefraksjoner (data ikke vist)
Neste, vi piggete blodprøver fra friske frivillige med definerte celle tall av NCI-. HCC-827 celler. Prøvene ble behandlet slik det er beskrevet for å berike spiked tumorceller og alle resulterende cellefraksjoner ble underkastet genomisk DNA, sanntid PCR og smeltekurve analyse. I disse eksperimentene reproduserbar nedre deteksjonsgrense var en
EGFR
-mutant celle per 1 ml perifert blod (Figur 1 c, d). Denne protokollen ble deretter brukt til blodprøver fra tre NSCLC pasienter med
EGFR
wildtypic svulster og to friske frivillige. DNA isolert fra alle cellefraksjoner testet negativt for
EGFR
DelEx19 mutasjoner (Suppl. Figur S1 a-e).
analysen validering i kliniske prøver
For å validere vår strategi for CTC-berikelse og mutasjonsdeteksjon vi prospektivt fått perifere blodprøver fra 8 pasienter med metastatisk NSCLC husing
EGFR
DelEx19 mutasjoner, behandlet på vårt senter i LUX-Lung 3 studie (EudraCT-nr. 2008-005615-18 [12]). Per studieinklusjonskriterier alle pasientene hadde histologisk bekreftet, medisinsk ubehandlet stadium IIIB /IV lunge adenokarsinom (tabell 1). Alle
EGFR
mutasjoner ble bekreftet av sentrale analyse.
En blodprøve ble betegnet «negative» for
EGFR
-mutant CTC hvis ingen mutasjon signal ble oppnådd ved real time PCR-analyse av genomisk DNA isolert fra alle cellefraksjoner (CD45
+, CD45
-, CD326
+ og CD326
-) oppnådd ved de respektive tidspunkt. Basert på våre titrering eksperimenter dette indikerte at
EGFR
-mutant CTC falt under en celle /ml blod. Ved en
EGFR
DelEx19 mutasjon ble funnet i genomisk DNA fra minst en cellefraksjon prøven ble erklært «positive» for
EGFR
-mutant CTC.
Base linje prøvene ble oppnådd i løpet av 7 dager før studere terapi, ble sekvensielle blodprøver tatt med jevne mellomrom etter behandling og oppfølging. Ved klinisk progresjon og /eller slutten av behandlingen ble det oppnådd en ytterligere blodprøve. I alt 148 Blodprøvene ble samlet opp i løpet av en periode på 36 måneder og analysert for tilstedeværelse av
EGFR
-mutant CTC (middelverdi: 12 prøver /pasient; område 7-56). Base linje blodprøver fra åtte av åtte pasienter (100%) var «positive» for
EGFR
-mutant CTC. Interessant, sekvensielle prøver fra fire av åtte pasienter viste «negative» for
EGFR
-mutant CTC innenfor en median på 34 dager (range: 20-84 dager) studiebehandling (figur 2 a-j). «CTC negativitet» (dvs. mindre enn en
EGFR
DelEx19-mutert celle per milliliter blod) vedvarte med en median på 109 dager (range: 35-199 dager). Genomisk DNA fra prøvene viser en sterk
EGFR
DelEx19 mutasjon signal i våre nyutviklede analyse (vist i figur 2A-2C og 2F), ble analysert på et Roche 454 GS FLX + Titanium sequencer. Til vår overraskelse, ikke i noen av disse prøvene en sletting i
EGFR
Exon 19 kunne påvises (data ikke vist).
Representative eksempler på
EGFR
-mutant CTC analyser og kliniske forløpet av pasienter av den potensielle validering kohort. Alle pasientene ble behandlet i LUX-Lung 3 studie for stadium IV
EGFR
-mutant NSCLC. Behandlingsforløpet, bildebehandling tidspunkter (CT) og tidspunkter av CTC analyser er illustrert i E og J. Solid pilene indikerer «CTC positivitet», stiplede piler «CTC negativitet». Stjernene viser tidspunkter av CTC analyser /CT vist i A-D og F-I. (A) Base line analyse av pasient 018 viste sterk
EGFR
DelEx19 signaler i to cellefraksjoner (CD326
+ og CD45
-). (B, C) Sekvensiell analyser i pasient 018 avsløre sterk
EGFR
DelEx19 signaler i det minste i en relevant cellefraksjon. (D) Representant CT-bilder fra pasient 018 på grunnlinjen, og på dag 84 av studien behandling bekrefter progressiv sykdom. (F) Base line analyse av pasient 017 viser sterk
EGFR
DelEx19 signaler i to cellefraksjoner (CD326
+ og CD45
-). (G, H) Sekvensiell analyse i pasient 017 viste nedsatt (G) og negative (H)
EGFR
DelEx19 signaler i begge aktuelle cellefraksjoner. (I) Representant CT-bilder fra pasient 017 på grunnlinjen, og på dag 84 av studien behandling bekrefter en delvis respons.
Association of EGFR muterte CTC med kliniske resultater
Basert på denne observasjonen vi spurte foreningen av
EGFR
-mutant CTC med behandlingsrespons og varighet i vår validering kohort. Vi definerte en pasient som «
EGFR
-mutant CTC ryddet» hvis to påfølgende blodprøver ble testet «negative», dvs.
EGFR
-mutant CTC teller falt under en celle /ml. «CTC tilbakefall» ble erklært når to påfølgende blodprøver testet «positivt» for
EGFR
-mutant CTC. Resultater fra CTC mutasjonsanalyse ble korrelert med radiologisk respons vurderes innenfor LUX-Lung 3-studien. Alle 4 pasienter som «ryddet»
EGFR
-mutant CTC oppnådd sykdomskontroll, med 3 partiell respons (PR) og en stabil sykdom (SD) per RECIST. I 4 pasienter med vedvarende CTC i sin perifert blod og som dermed ikke klarte å «klar»
EGFR
-mutant CTC bare ett objektiv respons (PR) ble observert, mens 2 pasienter oppnådde SD og en pasient progressiv sykdom (PD ). På oppfølgings alle 4 pasienter med «clearance» av
EGFR
-mutant CTC utviklet PD.
EGFR
-mutant CTC tilbake til «positive» ved en median på 140 dager (range 0-960 dager) før radiologisk dokumentert PD. Derfor, en økning på
EGFR
-mutant CTC teller over terskelen til en celle /ml kan være en tidlig indikator på sykdom tilbakefall og motstand hos pasienter som har «ryddet» CTC. Ved utforskende statistiske analyser vi observert en signifikant sammenheng (Spearman-Rho korrelasjonskoeffisient 0,868, p 0,01) mellom varigheten av «CTC negativitet» og tid til behandlingssvikt. Pasienter som hadde «ryddet»
EGFR
-mutant CTC under nivået for påvisning viste en betydelig lengre tid til behandlingssvikt (median: 355 dager, fra: 189-1,086 dager; p = 0,006, log-rank test ) sammenlignet med pasienter som fort «positive» for
EGFR
-mutant CTC (median: 116 dager, range:.. 84-173 dager, figur 3)
Kaplan-Meier analyse som sammenligner TTF av pasientgrupper med og uten klarering fra CTC under behandlingen. Pasientene ble gruppert i henhold til «clearance» (median TTF 355 dager) eller «non-clearance» (median TTF 116 dager) av
EGFR
-mutant CTC ved behandling med afatinib eller pemetrexed /cisplatin. Gruppene ble sammenlignet med utforsk Kaplan-Meier analyse (p = 0,006, Log-rank test).
Diskusjoner
Foreløpig påvisning av genetiske avvik i tumorvev er klinisk mest kraftig biomarkør for lagdeling av «målrettede» farmakoterapi i metastatisk lungekreft [13], [14]. Behandling med gefitinib og crizotinib, samt førstelinje erlotinib, er betinget av at demonstrasjon av
EGFR
mutasjoner og
ALK
rearrangements. Mutasjon deteksjon er ofte utført i små og /eller arkiverings vevsprøver, som kanskje ikke gjenspeiler den nåværende genomisk profilen ved behandlingsoppstart [15]. Dessuten endrer den mutasjons spekteret av en kreft under selektivt trykk for en gitt behandling, som bare kan bli avslørt av sekvensielle biopsier. På denne bakgrunn har påvisning av kreft-spesifikke mutasjoner i andre formater enn tumor biopsier fått interesse. I NSCLC ble vellykket påvisning av muterte DNA-sekvenser rapportert i serum, plasma eller bronchioalveolar vaskevæske [16] – [19]. Ikke desto mindre, har de fleste av disse rapportene viste et nivå av følsomhet under kliniske krav.
tidlig systemisk spredning av kreftceller er regnet av biologisk relevans. Ved hjelp av primære antistoffer mot epiteliale markører, formidlet tumorceller og CTC er påvist i benmarg og blod fra pasienter med ulike kreftformer. Blant et stort utvalg av alternative strategier søkt om CTC-berikelse og analyse, har et automatisk system for immunocytometric deteksjon og kvantifisering av CTC blitt utviklet, som ble validert i bryst, prostata, tykk- og lungekreftpasienter [2], [5], [8], [20] – [23]. Interessant, den absolutte mengden CTC påvist i avansert stadium kreftpasienter varieres betydelig, avhengig av CTC-isoleringsteknikker. Mens høyt antall CTC ble påvist hos pasienter med småcellet lungekreft, absolutte CTC tall og dynamisk område i NSCLC virket altfor lavt for bred klinisk anvendelse. Likevel har det blitt stadig klarere at CTC bestandene er fenotypisk heterogen og epitel-markør uavhengig berikelse tilnærminger er garantert å vise hele bildet av CTC i en kreftpasient på et gitt tidspunkt. Flere nyere rapporter støttet denne oppfatningen ved konsekvent viser høyere CTC tall når man sammenligner epitel-markør-uavhengige CTC berikelse teknikker (f.eks berikelse av cellestørrelse) med mye brukt CTC isolasjon ved valg av EpCAM og CK-positive celler bruker CellSearch system [5 ], [8], [24], [25].
på denne bakgrunn vi begrunnet om sondering for kreftspesifikke somatiske mutasjoner i stedet for mikroskopi-basert parametere øker følsomheten for CTC deteksjon i NSCLC. Vi har valgt
EGFR
DelEx19 mutasjoner som en modell for å utvikle en svært følsom, spesifikk og robust metode for mutasjonsdeteksjon i blandinger av genomisk DNA som ble hentet fra CTC-beriket perifert blod celle populasjoner. Romanen metoden anvendt i denne studien har blitt utviklet for å oppdage det store flertallet av
EGFR
DelEx19 mutasjoner, særlig all mulig mutant varianter forstyrre kodon 746 og 747 av
EGFR
genet. I motsetning til en tidligere studie analysere bare EpCAM-positive blodceller [26] vi har valgt en objektiv, epitelial markør uavhengig CTC berikelse strategi der prøvene ble delt og CTC berikelse ble oppnådd ved en tosidig tilnærming, nedbrytende leukocytter i en halvdel av et prøve og valg av EpCAM-positive celler i den andre halvparten. Dette tar hensyn til den fenotypiske variasjon av CTC, som kan miste en eller flere markører epiteliale samtidig som felle fra en primær tumor eller metastase [27] – [29]. I pilotforsøk, immunfluorescens farging av utvalgte CTC prøver fra NSCLC pasienter faktisk viste heterogene populasjoner av CTCs viser epitel, mesenchymale og blandede fenotyper (data ikke vist). Bruk av dette objektivt CTC-berikelse tilnærming, oppnådde vi en 100% treffprosent i en pilot kohort av 8 pasienter med
EGFR
-mutant NSCLC. Mest interessant, observerte vi en sammenslutning av
EGFR
-mutant CTC med behandlingsrespons og utfall. Disse funnene er mest sannsynlig å være knyttet til romanen og svært sensitive mutasjonsdeteksjon metoden anvendt i denne studien. Det har blitt anerkjent for en stund at påvisning av mutasjoner på nivåer under 1% er ikke sikkert mulig ved neste generasjons sekvense applikasjoner på grunn av iboende feilrater av denne teknologien [30]. Bare nylig forbedret teknologi ble rapportert, rende påvisning av mutasjoner i nivåer på 0,1% og under mulig [31], [32]. I tråd med disse resultatene, vi var ikke i stand til å oppdage
EGFR
Del19 mutasjoner av neste generasjons sekvensering i genomisk DNA fra prøvene viser entydige mutasjon signaler i vår nyutviklede mutasjonsdeteksjon analysen. Disse funnene tyder på at vår nyutviklede mutasjonsdeteksjon analysen tilsynelatende viser høyere følsomhet enn standard neste generasjons sekvensering teknikker. En annen bemerkelsesverdig aspekt ved vår mutasjonspåvisningsmetode var den observasjon at forskjellig
EGFR
DelEx19 mutasjoner ga opphav til forskjellige smeltekurver (se figur 2 og suppl. Fig S1). Dette er mest sannsynlig på grunn av egenskapene til en av hybridiseringsprober, som er utformet for å binde seg til
EGFR
Exon 19 wildtypic sekvenser i regionen av potensielle delesjoner som fører til dissosiasjon av sonden under smelting kurve analyse hos forskjellige temperaturer avhengig av sekvensen av den respektive sletting.
Selv om disse resultatene er lovende, er vi klar over at pasientpopulasjonen analysert her er veldig liten og validering i større pasientpopulasjoner inkludert ekstra mutasjoner er nødvendig. Foreløpig er like følsomme mutasjonsdeteksjon analyser som dekker flere terapirelevante områder av
EGFR
genet (f.eks kodon L858 og T790) og andre onkogener under utvikling.
I sammendraget har vi beskrevet en roman strategi basert på CTC berikelse og svært følsom påvisning av somatiske mutasjoner, som kan brukes for mutasjons profilering og oppfølging av behandlingseffekt hos pasienter med
EGFR
-mutant NSCLC. Ved analysen optimalisering har vi vist at problemet med ekstremt lav CTC teller i trinn IV NSCLC kan overvinnes. Dette kan være et nytt skritt mot visjonen om en «flytende biopsi» for farefritt molekylær diagnostikk og sykdomsovervåkning hos pasienter med metastatisk lungekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
EGFR
DelEx19 mutasjon analyse i blodprøver fra NSCLC pasienter med
EGFR
-wild typen svulster og friske kontrollpersoner. Perifere blodprøver fra tre pasienter med
EGFR
-wild typen NSCLC (A, B, C) ble og to friske frivillige (D, E) anriket, separert i cellulære fraksjoner og utsatt for DNA-isolasjon som beskrevet. Mutasjon detektert ble utført ved sanntids-PCR og smelting kurve analyse i nærvær av LNA. Nei
EGFR
DelEx19 signal ble oppdaget. H
2o (bunnlinjen) og 50 ng av ufortynnet genomisk DNA fra NCI-HCC-827 celler ( «
kontroll en
«), plasmid DNA inneholder en
EGFR
DelEx19 sekvens ( «kontroll 2») og A431-celler ( «
EGFR wildtypic kontroll
«) ble tatt med som negative og positive kontroller. For klarhet bare enkeltverdier av duplikater vises
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085350.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker alle pasienter for deltakelse i denne studien. Alle medvirkende ansatte i avdelingene for Medical Oncology, patologi og nevropatologi, West German Cancer Center, Universitetssykehuset Essen, og divisjonene Thoracic Oncology og Intervensjonslunge, Ruhrlandklinik, er takket. Sabrina Schilling og Sarah-Luise Stergar er anerkjent for utmerket teknisk assistanse og Sabine Kasimir-Bauer for nyttige diskusjoner og råd. Vi er takknemlige for Ivonne Nel og Andreas-Claudius Hoffmann for råd og god hjelp i forbindelse med immunfluorescens stainings. Den tyske Research Foundation (DFG) gitt støtte til publisering avgifter.
