Abstract
Bakgrunn
De fleste (70%) epitelial eggstokkreft (EOCs) er diagnostisert sent. Ikke-invasive biomarkører som letter sykdom deteksjon og forutsi utfallet blir nødvendig. De microRNAs (mirnas) representerer en ny klasse av biomarkører. Denne studien var å identifisere og validere plasma mirnas som biomarkører i EOC.
metodikk /hovedfunnene
Vi har evaluert plasmaprøver av 360 EOC pasienter og 200 friske kontroller fra to institusjoner. Alle prøvene ble gruppert i screening, opplæring og valideringssett. Vi skannet de sirkulerende plasma mirnas av TaqMan low-density array i screening sett og identifisert /validerte miRNA markører ved real-time PCR-analyse i treningssettet. Mottaker som opererer karakteristiske og logistisk regresjonsanalyse etablert den diagnostiske miRNA panelet, noe som ble bekreftet i valideringssett. Vi fant høyere plasma MIR-205 og lavere la-7F uttrykk i tilfeller enn i kontrollene. MiR-205 og la-7f sammen gitt høy diagnostisk nøyaktighet for EOC, spesielt hos pasienter med stadium I sykdom. Kombinasjonen av disse to mirnas og karbohydrat antigen-125 (CA-125) forbedret ytterligere nøyaktigheten av deteksjon. MiR-483-5p ekspresjon ble forhøyet i trinn III og IV sammenlignet med i trinn I og II, som var i samsvar med dets ekspresjon mønster i tumorvev. Videre lavere nivåer av la-7F var prediktiv av dårlig prognose i EOC pasienter.
Konklusjon /Betydning
Våre funn tyder på at plasma MIR-205 og la-7F er biomarkører for påvisning eggstokkreft som utfyller CA-125; la-7F kan forutsis eggstokkreft prognose
Citation. Zheng H, Zhang L, Zhao Y, Yang D, Song F, Wen Y, et al. (2013) Plasma mirnas som diagnostisk og prognostisk Biomarkører for eggstokkreft. PLoS ONE 8 (11): e77853. doi: 10,1371 /journal.pone.0077853
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 21 juni 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 01.11.2013
Copyright: © 2013 Zheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation National of China (Grants 81072363), programmet for Changjiang Scholars og Innovativ Research team ved Universitetet i Kina (Grant IRT1076), National Key vitenskapelige og teknologiske Project (Grant 2011ZX09307-001-04) og Tianjin Science and Technology Committee Foundation (Grant 09ZCZDSF04700). Vevet Banken er i fellesskap støttet av Tianjin Center og US National Foundation for Cancer Research. D.Y. er en Odyssey Fellow ved MD Anderson Cancer Center, og støttet av Diane Denson Tobola Fellowship i Ovarian Cancer Research fellesskap og The Harold C. og Mary L. Daily Endowment Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft er den femte største årsaken til kreftdød blant kvinner over hele verden, og ovarialcancer (EOC) er den mest dødelige gynekologisk svulst [1]. Fordi EOC er vanligvis asymptomatiske og få screeningtester er tilgjengelige, nesten 70% av kvinner tilstede med avansert stadium (stadium III eller IV) sykdom, med 5-års overlevelse på mindre enn 30% [2]. I motsetning til pasienter som er diagnostisert med stadium I sykdom har en 5-års overlevelse på opp til 90%, og pasienter med stadium II sykdom har en 5-års overlevelse på opp til 70% [3]. Derfor kan tidlig deteksjon av EOC betraktelig bedre kliniske resultater. Sensitive, ikke-invasive biomarkører som kan lette sykdomsdeteksjon og iscenesettelse og forutsi terapeutisk utfall er nødvendig for å bedre overlevelse og bestemme optimale behandlinger.
Karbohydrat antigen-125 (CA-125) er den mest brukte biomarkør for påvisning eggstokk-kreft [4], men det er bare forhøyet hos omtrent 50% av fase i EOCs og 70% -90% av avanserte tilfeller [5]. Det er derfor et kritisk behov for nye biomarkører som er mer følsom og spesifikk for påvisning EOC når de brukes alene eller i kombinasjon med CA-125. Nylig, microRNAs (mirnas), en familie av små regulatoriske RNA, dukket opp som mulig plasma markører for sykdom hos mennesker, inkludert kreft, på grunn av deres relative stabilitet i sirkulasjonen [6].
mirnas er små, ikke- protein-koding RNA som post-transcriptionally regulerer genuttrykk ved å undertrykke bestemte geografiske mRNA [7], [8]. Spesifikke sirkulerende mirnas har vært forbundet med forskjellige tumortyper, inkludert lungekreft [9], [10], tykktarmskreft [11], [12], prostatakreft [13], eggstokk-kreft [14], [15], og pankreatisk kreft [16], [17]. Taylor
et al.
[14] sammenlignet miRNA profiler av tumor-avledede exosomes som hadde blitt isolert fra serum hos pasienter med ovarialcancer de fra passet tumorvev fra de samme pasientene. Imidlertid ble disse studiene begrenset av å ha små utvalgsstørrelser og vurdere noen kliniske faktorer. Hensikten med denne studien var å identifisere og validere sirkulerer mirnas i humant plasma for bruk som diagnostiske og prognostiske biomarkører i kreft i eggstokkene. Vi ønsket å sammenligne disse identifid plasma mirnas med CA-125, spesielt for å øke følsomheten av EOC påvisning hos pasienter med normal CA-125 serumnivåer.
Materialer og metoder
Studiedesign og Befolkning
Vi har konstruert en flertrinns, retrospektiv, nested case-control studie for å finne ut om serum miRNA profiler kan brukes til å forutsi EOC utvikling. Alle prøvene ble gruppert i screening, opplæring og valideringssett (Fig. 1). Totalt 560 plasmaprøver (360 tilfeller og 200 kontroller) ble hentet fra Tianjin Medical University Cancer Institute og Hospital (TCIH) og Cancer Center of Nanjing Medical University mellom juli 2007 og juni 2010. Sakene og kontroller ble godt matchet for alder blant opplærings- og valideringssett. Alle EOC pasienter hadde blitt histopathologically diagnostisert med primær eggstokkkreft. Alle pasientene rekruttert til denne studien hadde ikke mottatt kjemoterapi eller strålebehandling før blodet trekker. Og alle blodprøver ble tatt før kirurgi. The International Federation of gynekologi og obstetrikk (FIGO) iscenesettelse system ble brukt til å iscenesette tilfeller. Alle pasienter og kontroller var genetisk urelaterte, etniske Han-kinesiske kvinner som var fastboende i urbane området i Tianjin og Nanjing. Styrer med hjerte, luftveier, fordøyelsessystemet, urin, reproduktive og endokrine sykdommer ble ekskludert
Vi skilles prøvene i tre sett. Screening, opplæring og validering. Valideringssett inkludert to faser for å validere den beste panelet.
De studieprotokoller ble godkjent av Tianjin og Nanjing Senter gjennomgang komiteer. Informert samtykke ble innhentet, og alle deltakerne ble personlig intervjuet av trente intervjuere ved hjelp av en forhåndstestet spørreskjema for å innhente informasjon om demografiske data, menstruasjons og reproduktiv historie, livsstil, miljømessig eksponering og familiens historie av kreft. Etter intervjuet, ble en 5 ml venøs blodprøve oppsamlet. Blant disse tilfellene ble 44 treff på eggstokkene tumor vevsprøver hentet fra Tianjin sentrum for denne studien. EOC svulst vevsprøver og vev RNA ble hentet fra Tissue Bank Facility av TCIH, som samler alle solide tumorvev fra kirurgiske pasienter når det er mulig.
CA-125 nivåer av plasmaprøver ble kjøpt fra elektronisk pasientjournal av de to sentrene. Pasientenes oppfølgingsdata ble kjøpt, og overlevelse varighet ble beregnet fra datoen for diagnose til dødsdato eller siste oppfølging i mars 2012.
Screening Sett
For å oppdage generell nytte miRNA signaturer, samlet vi serumprøver av 10 tidlig stadium tilfeller (stadium i), 10 sene stadier av tilfellene (stadium IIIc-IV), og 10 friske kontroller, henholdsvis, og analyserte disse tre basseng prøver ved hjelp av en TaqMan lav tetthet matrise (TLDA satt 2.0, Applied Biosystems) chip screening i oppdagelsen scenen. Den TLDA versjon 2.0 (Sanger miRBase v14 human) inkluderte 667 mennesker miRNAs. Microarray data har blitt deponert i National Center for Biotechnology Information tallet (NCBI s) Gene Expression Omnibus (NCBIGEO GSE50472).
Training Set
mirnas identifisert i screening satt ble validert ved hjelp av kvantitativ revers transcription- polymerase chain reaction (QRT-PCR) på individuelle plasmaprøver av 76 EOC pasienter og 30 friske kontrollpersoner.
Validering Set
validerings~~POS=TRUNC sett bestod av en to-fase prosess. Lovende assosiasjoner fra screening og opplæring sett ble evaluert i valideringen fase jeg satt, bestående av 134 tilfeller og 70 kontroller fra Tianjin Center. En mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve basert risikovurdering analyser ble deretter utført for å bestemme den diskriminerende virkning av kandidatplasma miRNAs. Validerings fase II sett inkludert prøver av 77 EOC saker og 50 friske kontrollpersoner var fra Tianjin sentrum og 73 EOC tilfeller og 50 friske kontrollpersoner var fra Nanjing Center.
RNA Isolation
Blod ble samlet inn i EDTA-rør (BD Biosciences) og bearbeidet for å isolere plasma. Blod ble sentrifugert ved 1200 g ved omgivelsestemperatur i 10 minutter, og supernatanten plasma ble overført til et nytt rør og lagret ved -80 ° C.
RNA ble isolert fra plasmaprøvene fra friske donorer og kreftpasienter ovarian . I korte trekk, ble 250 ul plasma tint på is og sentrifugert ved 14.000 g ved 4 ° C i 10 minutter for å fjerne lymfocytter. Vi deretter lysert 200 ul supernatant med en lik mengde QIAzol lysereagensen (Qiagen, Shanghai, Kina). For plasmapooler brukes til å screene menneskelige eggstokkreft biomarkør kandidater, vi skapte bassenget prøven ved å kombinere 110 mL av hver av 10 prøver. Bassenget ble blandet ved inversjon og spant på 14 000 g for 10 min; 1 ml av supernatanten ble overført til et nytt rør for RNA-isolering. For normalisering, 5 mL av 25 fmol syntetisk
Caenorhabditis elegans
miRNA cel-MIR-39 ble lagt til hver denaturert prøve. Liten RNA ble isolert ved anvendelse av miRNeasy Mini (Qiagen) ifølge produsentens protokoll, bortsett fra at RNA ble eluert i 30 ul forvarmet nuklease-fritt vann. For å isolere total RNA fra eggstokkene tumorvev, ble de frosne prøvene første homogenisert i TRIzol reagens (Invitrogen, San Diego, CA) ved hjelp av en Omni-Mixer homogeniseringsapparater (Omni International, Kennesaw, GA). Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av standardmetoden TRIZOL (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvaliteten av total RNA ble bekreftet med en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).
miRNA profilering
miRNA uttrykk for bassenget prøven ble profilert bruker TLDA. I korte trekk ble RNA revers transkribert ved bruk av TaqMan miRNA revers transkripsjon kit, og TaqMan miRNA multipleks RT-analyser, Personell Pool Set. En mengde på 9,16 ul plasma RNA-løsningen ble transkribert i 15 ul RT blanding. Rørene ble inkubert ved 16 ° C i 30 minutter, etterfulgt av 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Den TaqMan PreAmp masterblanding kit (Applied Biosystems) er beregnet på å øke mengden av cDNA tilgjengelig for analyse før bruk TLDA. Den 25 pl reaksjonsblanding bestod av 2,5 pl ufortynnet cDNA kombinert med 12,5 ul av TaqMan PreAmp konsentrat-blanding, 2,5 ul av Megaplex forforsterker primere, og 7,5 ul av nuklease-fritt vann. Den pre-forsterkningstrinn ble utført i henhold til produsentens protokoll. Produktet ble fortynnet ved tilsetning av 75 ul av nuklease-fritt vann, og 9 pl av den fortynnede blanding ble kombinert med 450 ul av TaqMan Universal PCR masterblanding og 441 ul av nuklease-fritt vann. Etter lasting av 100 ul av hver multipleks basseng blandingen ble array (TaqMan human mikroRNA Array Set v2.0) sentrifugert og forseglet. Amplification ble utført på et Applied Biosystems 7900 HT termosykler (Applied Biosystems) ved hjelp av produsentens anbefalte sykkelforhold. Data ble analysert ved hjelp av RQ Manager Software versjon 1.2 og 7900 Sequence Detection System 2.4 (Applied Biosystems).
Mirna Kvantifisering av Real-time QRT-PCR
For å finne ut miRNA nivåer i plasmaprøver, vi anvendes ABI Mirt-PCR system, med følgende betingelser: 2,5 ul av anrikede små RNA fra plasmaprøver eller 10 ng av total RNA fra vevsprøver ble reverstranskribert ved hjelp av TaqMan miRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems) i 7,5 pl av reaksjons buffer med målspesifikke primere. Rørene ble inkubert ved 16 ° C i 30 minutter, etterfulgt av 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Etter grunning, ble en 1:20 fortynning brukt som templat for PCR-trinn ved bruk av TaqMan 2 x Universal PCR masterblanding (Applied Biosystems) på en ABI Prism 7900. Vi målte triplikate brønner ved bruk av en 15-pl endelig reaksjonsvolum og følgende sykkel betingelser: 10 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 50 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. De 7900 Sequence Detection System 2.4 programvareinnstillingene ble brukt til å beregne den relative endringen i uttrykket av 2
-ΔΔCt metode med 95% sikkerhet.
statistisk analyse
De relative nivåer av miRNA ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCt metode, og dataene ble analysert som loggen
10 av den relative mengden av målet miRNA. Den statistiske signifikans ble bestemt ved bruk av Wilcoxon signed-rank eller
t
-test mellom pasienter og kontroller. ROC-kurver ble samlet for å bedømme den diagnostiske nøyaktigheten av hver kandidat miRNA, og følsomheten og spesifisiteten av den optimale skjæringspunktet ble definert som de verdier som maksimert arealet under ROC-kurven (AUC). En trinnvis logistisk regresjonsmodell ble brukt til å velge diagnostiske markører miRNA på grunnlag av treningsdatasettet. Korrelasjonen mellom overlevelse (total overlevelse [OS] og progresjonsfri overlevelse [PFS]) og plasma mirnas ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og log-rank test. En Cox regresjonsanalyse ble brukt for å finne ut om plasma miRNA var en uavhengig prognostisk faktor for EOC.
Vi brukte statistiske programvarepakker SAS versjon 9.0 (SAS Institute, Cary, NC) og MedCalc (Mariakerke, Belgia ). Grafene ble generert med GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Alle statistiske tester var tosidig, og en
P
verdi. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Pasient Kjennetegn
Vi har samlet 560 plasmaprøver (360 tilfeller og 200 kontroller) og tilknyttede kliniske og demografiske data for denne studien; tilfellene inkluderte 179 serøs svulster (49,7%), 86 endometrioid svulster (23,9%), 33 mucinkjertler svulster (9,2%), 15 klare celle svulster (4,2%), og 47 adenokarsinomer, som ikke er spesifisert (NOS) (13,0%) . Deltakernes egenskaper er presentert i tabell 1 og tabell S1. Fordelinger av de fleste risikofaktorer var som regel lik mellom pasienter og kontroller (tabell S1). Hos pasienter, var det ingen signifikant forskjell i fordelingen av Figo etapper, histologisk grad, eller CA-125 nivåer mellom trening og validerings grupper (tabell 1).
Mirna Screening
Bruke TLDA chip, vist vi 667 mennesker mirnas å finne de vesentlig forskjellige miRNA uttrykket nivåer mellom saker og kontroller. Å effektivt screene flere miRNA biomarkør kandidater, må vi først genererte tre bassenger av plasma porsjoner som hadde blitt avledet fra tidlig- og sen-trinns EOC pasienter og friske kontroller. Sammenlignet med kontrollgruppen bassenget, var det 43 og 50 mirnas som ble forskjellig uttrykt i tidlig stadium og sent stadium saken basseng, henholdsvis. Blant disse betydelige mirnas, var det 30 mirnas krysset. Tretti forskjellig uttrykt plasma mirnas ble identifisert mellom EOC pasienter og friske kontroller (Fig. 2A og tabell S2).
(A) En TLDA screening avdekket 30 store plasma miRNA endringer mellom saker og kontroller. (B) I treningssettet, vi har oppdaget 30 betydelige mirnas bruker QRT-PCR og funnet ut at 11 kandidat mirnas ble uttrykt forskjellig av vulkanen tomten. Den -log
10
P
verdier (y-aksen) er plottet mot log
2 av ganger endring mellom saker og kontroller (x-aksen). Hvert symbol er fargekodet i samsvar med den midlere ekspresjon av sonden på tvers av de to gruppene. De stiplede linjene avgrense cut-offs for betydelig nedregulert (venstre) eller oppregulert (høyre) mirnas i saker. En varmekart over de 11 viktigste mirnas er vist til høyre. (C, D) I valideringen fase I, bare MIR-205 (C, til venstre) og la-7f (D, venstre) hadde ulike nivåer. En ROC-analyse viste at AUC for MIR-205 og la-7f for å differensiere saker og kontroller var 0,609 (95% KI: 0,538 til 0,677) og 0.780 (95% KI: 0,717 til 0,835). Henholdsvis
Plasma mirnas Nivåer av pasienter versus kontroller i Training Set
i treningssettet, brukte vi QRT-PCR for å påvise de nevnte 30 betydelige mirnas i en case-control studie som inkluderte 76 EOC saker og 30 friske kontroller. Ni mirnas (MIR-205, MIR-200a, MIR-184, MIR-34a *, MIR-141, MIR-483-5p, MIR-193b *, la-7e *, og MIR-363 *) ble påvist ved høyere nivåer i tilfeller enn i kontrollene, mens MIR-98 og la 7f ble påvist ved lavere nivåer (illustrert av en vulkan tomt og varmekartet, fig. 2B).
Plasma mirnas nivåer av pasienter versus kontroller i Validering fase i Still
i valideringsfasen jeg satt, uttrykket profiler av 11 kandidat mirnas ble videre undersøkt ved hjelp av QRT-PCR-metoden i 134 EOC tilfeller og 70 kontroller. MiR-205 og la 7f hadde ulike uttrykk nivåer mellom saker og kontroller. Sammenlignet med kontroller, plasma MIR-205 nivåene var signifikant høyere (
P
= 0,012) (fig. 2C, venstre panel) og la-7F nivåene var signifikant lavere (
P
= 1.97 × 10
-10) i EOC pasienter (fig. 2D, venstre panel).
En ROC-analyse ble brukt for å evaluere sensitivitet og spesifisitet av de to kandidat plasma miRNA markører. AUC for MIR-205 og la-7F var 0,609 (95% CI, 0,538 til 0,677; følsomhet = 30,1%, spesifisitet = 94,2%) (figur 2C, panel til høyre.) Og 0.780 (95% CI, 0,717 til 0,835; følsomhet = 66,9%, spesifisitet = 84,2%), henholdsvis (fig. 2D, panel til høyre).
kombinasjon av MIR-205 og Let-7f for EOC Diagnose
En trinnvis logistisk regresjonsmodell ble brukt for å estimere felles kraft MIR-205 og la-7f til å forutsi risikoen for EOC i valideringen fase jeg satt. MiR-205 og la-7F var effektiv på å skille saker fra kontroller [Fig. S1 A; logit (P = EOC) = -0.610-3.075 × la-7F + 1,532 × MIR-205 ble brukt til å konstruere ROC kurven]. AUC for miRNA panelet (la-7F og MIR-205) var 0,831 (95% CI, 0,772 til 0,880; følsomhet = 62,4%, spesifisitet = 92,9%) (figur 3A.), Som var betydelig høyere enn AUC for MIR-205 (
P
0,001). og la-7f (
P
= 0,008) alene (fig. S1B)
Vi etablerte MIR-205 og la-7F panel i valideringen fase i og bekreftet det på uavhengige utvalg i fase II. I fase I, (A) AUC var 0,831 (95% CI, 0,772 til 0,880; følsomhet = 62,4%, spesifisitet = 92,9%) for tilfeller; (B) 0,895 (95% CI, 0,822 til 0,967; følsomhet = 77,8%, spesifisitet = 90,0%) for tidlig stadium tilfeller versus kontroller; og (C) 0,814 (95% CI, 0,700 til 0,929; Følsomhet = 68,4%, spesifisitet = 92,9%) for lav CA-125 ( 35 U /ml) saker versus kontroller. I fase II, (D) AUC var 0,813 (95% CI, 0,759 til 0,860; følsomhet = 71,3%, spesifisitet = 82,0%) for tilfellene versus kontroller; (E) 0,783 (95% CI, 0,699 til 0,853; følsomhet = 70,0%, spesifisitet = 82,0%) for tidlig stadium tilfeller versus kontroller; og (F) 0,726 (95% CI, 0,634 til 0,805; følsomhet = 64,3%, spesifisitet = 72,0%) for lav CA-125 ( 35 U /ml). tilfellene versus kontroller
de to-miRNA panel også skilt mellom tidlig stadium tilfeller (stadium i) og kontroller, med en AUC på 0,895 (95% CI, 0,822 til 0,967; følsomhet = 77,8%, spesifisitet = 90,0%, fig 3B.). I valideringsfasen jeg satt, om 89,3% av EOC pasientene hadde CA-125 høyde, de andre pasientene ikke klarte å bli oppdaget av CA-125. Den diagnostiske nøyaktigheten av miRNA panelet ble evaluert i henhold til CA-125-nivå. I lav CA-125 ( 35 U /ml) (n = 14, 10,7% av alle tilfeller, tabell 1) i valideringen fase jeg satt, AUC av miRNA panelet var 0,814 (95% CI, 0,700 til 0,929;.. følsomhet = 68,4%, spesifisitet = 92,9%, fig 3C)
Validating miRNA Panel i validering fase II Set
de to-miRNA panel ble videre vurdert i validering fase II sett 250 plasmaprøver (150 EOC pasienter og 100 friske kontroller). AUC for miRNA panelet var 0,813 (95% CI, 0,759 til 0,860; følsomhet = 71,3%, spesifisitet = 82,0%, Fig 3D.) I all validering fase II prøver. AUC var 0,783 (95% CI, 0,699 til 0,853;. Følsomhet = 70,0%, spesifisitet = 82,0%, figur 3E) i tidlig stadium tilfeller (stadium I) og kontroller, henholdsvis. Den diagnostiske nøyaktigheten av miRNA panelet ble så evaluert i henhold til CA-125-nivå. I lav CA-125 ( 35 U /ml) (n = 14, 9,3% av tilfellene, tabell 1) validering fase II, AUC av miRNA panelet var 0,726 (95% CI, 0,634 til 0,805; følsomhet = 64,3%, spesifisitet = 72,0%, fig. 3F).
Plasma miRNA nivåer og Survival
for å kunne fastslå om plasma la-7F og MIR-205 nivåer er prediktive for prognose, vi utført en analyse av OS og PFS hos alle pasienter fra trening og valideringssett. En Kaplan-Meier overlevelseskurver analyse viste ikke en sammenheng mellom la-7F eller MIR-205 nivåer og OS (fig. S2). Men lavere plasma la-7F uttrykk var signifikant korrelert med dårlig PFS hos alle pasienter (
P
= 0,006, log-rank test) (fig. 4A), spesielt i stadium III og IV tilfeller (
P
= 0,002, log-rank test). En multivariat Cox regresjonsanalyse viste at plasma la-7f var en signifikant prognostisk indikator på EOC i PFS (HR = 2,07, 95% CI = 1,27 til 3,37) (tabell 2).
(A) En PFS analyse for alle pasienter (n = 360) viste at lavere plasmanivåer av la-7F var assosiert med dårlig prognose (
P
= 0,006). Stage-spesifikke Kaplan-Meier overlevelseskurver avslørte at
P
verdier av log-rank test var 0,576 og 0,002 for trinn henholdsvis I og II (B) og III og IV (C),. Overlevelses data ble sammenlignet med log-rank test, og la-7F uttrykk nivåer hos pasienter ble definert som høy eller lav i forhold til medianen. NP, ingen progresjon; P, progresjon.
Mirna Expression i EOC Tissue
Vi avgjort om uttrykket av miRNAs i plasma på ulike stadier var korrelert med det i matchende tumorvev. Vi undersøkte 11 signifikante mirnas (MIR-205, MIR-200a, MIR-184, MIR-34a *, MIR-141, MIR-483-5p, MIR-193b *, la-7e *, MIR-363 *, speil 98 og la-7F) trening satt i matchet svulst vevsprøver. Den komparative analysen viste at svulsten uttrykk for MIR-483-5p, men ikke la-7f, var sterkt korrelert med plasma uttrykk (r = 0,541,
P
= 1,52 × 10
-4) (fig. S3A). Vi fant også at Mir-483-5p ble uttrykt på et høyere nivå i fase III og IV tumorvev enn i stadium I og II (
P
= 0,048) (fig. S3b), i samsvar med nivåene i plasma (
P
= 0,043) (fig. S3C). MiR-483-5p ble uttrykt på et høyere nivå i plasma i avansert stadium (stadium III og IV) enn i tidlige stadier (stadium I og II) (Fig. S3C). Ingen andre miRNA nivåer i plasma ble korrelert med nivåer i tumorvev.
Diskusjon
EOC står for det meste på eggstokkene maligniteter. Siden oppdagelsen av CA-125 i 1981, har en rekke studier dokumentert sin rolle som et diagnostisk og tilbakefall verktøy i EOC pasienter [18], [19]. Omtrent 80% av EOC pasienter har CA-125 høyde. CA-125 er nyttig for å overvåke sykdoms, vurdering av terapi respons, og detektering av tilbakefall [20], [21]. Imidlertid utfører den dårlig i å detektere de tidlige stadier av eggstokkreft utvikling [22]. Nye diagnostiske markører for ovarian cancer er nødvendig for screening. Foreløpig har flere sirkulerende mirnas er identifisert for bruk i forskjellige typer kreft [13], [23], [24], [25]. I denne studien fant vi at la-7F og MIR-205 er svært lovende som diagnostiske og progressive biomarkører i EOC.
Ved hjelp av en streng validering prosess og en logistisk regresjonsmodell, viste vi at la-7f- MIR-205 miRNA panel hadde stor nøyaktighet i EOC diagnose, spesielt hos pasienter med stadium i sykdom. Viktigere, kan dette panelet brukes i lav-CA-125 pasienter for å identifisere tidlig stadium EOC.
la-7 /MIR-98 familien var en av de første pattedyr mirnas å bli identifisert [26]. La-7 ble opprinnelig observert i nematode
C. elegans product: [27], og uttrykket nivåer av mange la-7-familiemedlemmer er blitt funnet å være redusert i forskjellige cancere [28], [29], [30], [31], [32]. La-7F er involvert i fysiologiske og patologiske prosesser, herunder kreftutvikling [33]. Tidligere studier har vist at den fungerer som en tumor suppressor i mange kreftformer, inkludert nyrecellekreft [34], papillær skjoldbruskkjertelkreft [35], og magekreft [36]. Den la-7 miRNA familien blir selektivt utskilt i det ekstracellulære miljøet via exosomes, noe som kan være viktig i kreft overvåking. En reduksjon i la-7 i det ekstracellulære miljø, for eksempel i plasma, kan således skape en kreft-metastase og vennlige omgivelser. I vår studie fant vi at plasma la-7F kan brukes som en EOC deteksjon og prognose biomarkør. Sammenliknet med friske kontroller, kreftpasienter på eggstokkene har lavere nivåer av plasma la-7f. I EOC pasienter, disse lavere nivåene var også prediktive for dårlig prognose.
MiR-205 er et svært konservert miRNA blant ulike arter, inkludert mennesker. Mir-200 familien (MIR-200A, MIR-200b, MIR-200c, MIR-141, og MIR-429) og Mir-205 er ofte nedregulert i avansert kreft [37]. Studier har vist at ved å målrette transkripsjons repressors av E-cadherin, ZEB1 og ZEB2 er MIR-200 familien involvert i epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) og tumorinvasjon [38]. Økt uttrykk av MIR-205 har også blitt observert i livmor adenokarsinom [39], hode og nakke plateepitelkarsinom cellelinjer [40], plateepitelkarsinom lungekreft [41], og eggstokkreft [37]. I motsetning til dette har redusert ekspresjon av MIR-205 er rapportert i melanoma [42] og kreft i spiserøret [43], nyre [44], blære [45], [46], bryst [47], og prostata [48] . MiR-205 kan fungere som et onkogen eller tumorsuppressorgen, avhengig cellulær kontekst. I vår studie var plasma MIR-205 uttrykt ved høyere nivåer i EOC pasienter enn hos friske kontroller. Men det var ingen forskjell i Mir-205 uttrykk mellom EOC tumorvev og tilstøtende friskt vev.
Tapet av la-7 i kreft resultater i revers embryogenese og dedifferentiation [49], og MIR-205 har vært identifisert som en kraftig regulator av EMT [50]. Nyere funn har koblet la-7 med stamcelle vedlikehold og foreslår en sammenheng mellom EMT og stamcelle formasjon. Konverteringen av en epitelial celle til en mesenchymale celle spiller en nøkkelrolle i både fosterutviklingen og kreft invasjon og metastasering. Celler som gjennomgår EMT miste sine epitelceller morfologiske egenskaper, omorganisere sin cytoskjelettet, og skaffe seg en bevegelige fenotype gjennom opp- og nedregulering av flere molekyler, inkludert stramme og tilhenger junction proteiner og mesenchymale markører. I eggstokkreft EMT, la-7F og MIR-205 delta i EMT prosessen ved å regulere sine mål gener [49]. Sirkulerende nivåer av la-7F og MIR-205 kan være en refleksjon av EMT prosessen; således, er det viktig å undersøke deres rolle i regulering av det ekstracellulære miljø.
Mange studier har vist at sirkulerer mirnas i blodprøver stammer fra tumorvev, [14], inflammatoriske foci [51], endotelial celleskade [52 ], og normale perifere mononukleære blodceller og blodplater [53]. I denne studien analyserte vi eggstokkreft vev og funnet ut at Mir-483-5p uttrykk ble korrelert med plasmanivå. Dette resultatet tyder på at tumoravledet exosomes kan forklare en liten del av opprinnelsen til plasma miRNA. I tillegg ble det høyere MIR-483-5p uttrykk som finnes i avansert EOC enn i begynnelsen av EOC, både i tumorvev og plasma. Så vidt vi vet, er dette den første studien for å finne at MIR-483-5p kan være relatert til kreft progresjon eggstokkene. Nylig ble serum MIR-483-5p identifisert som en potensiell biomarkør for å påvise leverkreft [54].
I sammendraget, vi identifisert plasma la-7F og MIR-205 som potensielle biomarkører for eggstokkreft diagnose, spesielt for tidlig deteksjon av EOC. La-7F kan også være en prognostisk markør for eggstokkreft. Sirkulasjons mirnas har blitt funnet å være stabile, spesifikke og sensitive biomarkører. På grunnlag av våre data foreslår at bestemte mirnas som er forbundet med sirkulerende exosomes er tidlige markører for ovarian cancer, og kan brukes til å bestemme stadiet, prognose og behandling respons.
Hjelpemiddel Informasjon
figur S1.
Diagnostic ytelsen miRNAs. (A) De mirnas ble bygget ved hjelp av en logistisk regresjonsmodell. (B) Resultatene av en ROC analyse indikerte at MIR-205 og la 7f panel diskriminert mellom saker og kontroller. AUC-ROCer av MIR-205, la-7, og miRNA panel (MIR-205 og la 7f) for å skille saker og kontroller var 0.780, 0,609 og 0,831, henholdsvis. Panelet hadde en AUC = 0,831 (95% KI: 0,772 til 0,880), som i betydelig grad ble bedret sammenlignet med de to mirnas alene (MIR-205 [
P
0,001] og la-7F [
P
= 0,008])
doi: 10,1371 /journal.pone.0077853.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
PFS og OS av alle pasienter ved la-7F eller MIR-205 nivå. Kaplan-Meier overlevelseskurver avslørte at lav la-7F uttrykket var forbundet med PFS (
P
= 0,006, fig. A), men ikke med OS (
P
= 0,589, fig. B) . Det var ingen forskjeller mellom MIR-205 nivå og PFS (
P
= 0,969, C) eller OS (
P
= 0,576, D). Overlevelses data ble sammenlignet med log-rank test, og la-7f eller Mir-205 uttrykk nivåer ble definert som høy eller lav i forhold til medianen. NP, ingen progresjon;
