Abstract
Epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), den fenotypiske endring av celler fra en epitelial til en mesenchymale typen, er antatt å være en viktig hendelse i invasjon og metastasering av adenocarcinomer. Disse endringene innebærer tap av keratin uttrykk samt tap av celle polaritet og heft. Vi her forsøkte å finne ut om tapet av keratin uttrykk selv disker økt invasjon og metastasering i adenokarsinomer og om keratin tap fører til fenotypiske endringer knyttet til EMT. Derfor har vi anvendt et nylig beskrevet murine modell hvor betinget sletting av Keratin klyngen II av Cre-rekombinase fører til tap av hele keratinmultiprotein familien. Disse musene ble krysset inn i et nylig generert Cre-rekombinase induserbar KRAS-drevne kreftmodell muse-lunge for å undersøke effekten av keratin tap av morfologi, invasjon og metastase så vel som ekspresjon av EMT relaterte gener i de resulterende tumorer. Vi her viser tydelig at tapet av en funksjonell keratin cytoskjelettet ikke vesentlig endre svulst morfologi eller biologi i form av invasjon, metastaser, spredning eller tumorbelastning og førte ikke til induksjon av EMT. Videre fant kreftceller induserer ikke synkront uttrykk for vimentin, som ofte sees i EMT, for å kompensere for keratin tap. Oppsummert våre data tyder på at endringer i cellen form og migrasjon som ligger til grunn EMT er avhengig av endringer i signalveier som fører til sekundære endringer i keratin uttrykk og organisasjon. Dermed konkluderer vi med at tapet av keratin cytoskjelettet per se er ikke tilstrekkelig til å årsaks drive EMT i denne tumormodellen
Citation. König K, Meder L, Kröger C, Diehl L, Florin A, Rommerscheidt-Fuss U, et al. (2013) Tap av Keratin Cytoskjelett er ikke tilstrekkelig til å indusere Epitelial Mesenchymale Overgang i en roman KRAS Driven Sporadisk Lung Cancer Mouse Model. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10,1371 /journal.pone.0057996
Redaktør: Victoria Lawson, Universitetet i Melbourne, Australia
mottatt: 24 september 2012; Godkjent: 30 januar 2013; Publisert: 11 mars 2013
Copyright: © 2013 König et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av den tyske forskningsrådet via SFB 832, Projekt A5 og Z1 og den tyske kreft Aid via CIO Köln /Bonn. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fenotypiske endringer fra en epitelial til en mesenkymale celletype, referert til som epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), er viktige trinn til invasjon og metastase av cancer. Ett kjennetegn på EMT er antatt å være remodeling av cytoskjelettet, såsom nedregulering av epiteliale keratin, noe som fører til endringer i celle-til-celle-adhesjon og endringer i polaritet og cellemotilitet [1]. Disse endringene er beskrevet i de fleste typer adenokarsinomer og antas å støtte invasivitet av svulster og metastasedannelse [2] og motstand mot kjemoterapi [3].
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdødsfall på verdensbasis, har tradisjonelt vært inndelt i små-celle lunge karsinom (SCLC) og ikke-små-celle lungekarsinom (NSCLC). SCLCs utgjør 20% av lungekrefttilfellene [4]. NSCLCs er videre delt inn i tre histologiske undergrupper: plateepitelkarsinom, adenokarsinom og nevroendokrine svulster. NSCLCs danne store sammenhengende primære svulster som avviker fra SCLCs, som er klinisk svært aggressiv og avslører en dødelighet på 95% [5]. SCLCs metastaserer meget tidlig, er ikke-sammenhengende og viser en diffus og infiltrerende vekstmønster. Histologisk er de kjennetegnet ved en ufullstendig og kondensert keratin cytoskjelettet som viser en gjennomhullet og perinukleært fordeling.
Med den økende anvendelse av målrettet EGFR-tyrosinkinase-inhibitor (TKI) terapi i adenokarsinomer i lungene, flere resistensmekanismer mot denne terapi har dukket opp. På den ene siden har mutasjoner forårsaker steriske endringer i målproteinet eller omgåelse av den inhiberte målet via rekrutteringen av en andre reseptor eller signal transduseren observert. På den annen side, avstamning transformasjon ved gjennomgår epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) [6] eller tilbakefall av TKI behandlet NSCLS som småcellet lungekreft (SCLC), er blitt beskrevet [7], [8]. Dermed disse kliniske observasjoner støtter hypotesen om at progresjon fra NSCLCs til SCLCs kan utløses av EMT.
Siden tap av keratin uttrykk antas å være sentral i EMT, oppdage redusert eller mistet uttrykk for keratin
i vivo
brukes som en markør for EMT i mange
in vivo
modellsystemer samt på histologiske menneskelige seksjoner. Tap av keratin fører til tap av celle veikryss, slik som funksjonelle desmosomer og strømpebukser veikryss, og derfor sterk celle-celle adhesjon [9], [10]. Spesielt er ekspresjonen av adherens veikryss regulert av EMT gener både i adenokarsinomer og squamous cell carcinoma i lungene [11].
Men den nøyaktige funksjonelle rolle av keratin tap på tumorvekst, metastase og invasjon og sin rolle i EMT er ikke klarlagt i noen tumor modell. Vi har derfor undersøkt om fullstendig tap av keratin uttrykk induserer EMT, invasjon og metastasering. For å oppnå dette, har vi utviklet en ny induserbar musemodell for lungeadenokarsinom defekt i hele keratin type II klynge forårsake svikt under dannelse av eventuelle funksjonelle keratin filamenter. Ved å bruke denne modellen, vi her viser at fullstendig keratin tap i KRAS muterte lungetumorer ikke påvirker tumor morfologi, invasjon eller metastase, som indikerer at tapet av keratin cytoskjelettet ikke er drivende overgangen av lungesvulster til småcellet lungekarsinom eller en sarcomatoid fenotype . Videre EMT markører ble ikke opp regulert i keratin-mangel adenokarsinomer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalinger fra FELASA. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Bonn. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Generasjon av RASLO gene mus
For å indusere lungesvulster, vi generert et uttrykk vektor som uttrykker et mutert KRAS
VAL12 samt et fusjonsmolekyl består ovalbumin, en S-tag og en luciferase molekyl drevet av en 1,8-kb kylling ß-aktin promoter [4] etter Cre-mediert fjerning av et stoppkodon. RASLO mus ble samlet ved pronukleus injeksjon av C57Bl /6 x FVB f1 embryoer med onkogene KRAS konstruere avbildet i figur 1A. Mus ble avlet i den sentrale Dyreavdelingen ved Universitetet i Bonn i henhold til Federation of European Laboratory Animal Science Association retningslinjer. The Animal Care-kommisjonen i Nordrhein-Westfalen godkjent alle museforsøk.
(A) Skjematisk konstruksjon som viser strategien som brukes til å generere den induserbare KRAS kreft modell (RASLO) drevet lunge. (B) Bio-Luminescence bilde tatt med en IVIS-200 (Xenogen) kamera på halen fibroblaster kulturer av RASLO grunnlegger mus etter behandling med 2 mikrometer TAT-CRE protein og tillegg av luciferin rett før bildebehandling, og viser sterke signaler i 5 grunnlegger mus . (C) Luciferase avbildning (IVIS-200) i 1 min ved middels sensitivitet av RASLO mus 6 uker etter induksjon med 2 x 10
7 PFU av Adeno-CRE i.n (+) eller avl kontroller. (-). Mus ble injisert i.p. med luciferin i 200 mL PBS og bedøvet av isofluran innånding. (D) Makroskopisk bilde av lungen av en RASLO mus 6 uker etter administrering av AdCre, og (E) HE farget seksjon med flere tumorer ved 100x og 400x forstørrelse. (F) PCR-analyse av DNA isolert fra cellelinjer avledet fra tumor av RASLO og RASLO x KIIf /d mus viser et PCR-produkt på 240 bp som indikerer at stopp kassetten har blitt fjernet ved CRE rekombinase i tumoren. Vektoren som brukes til å generere musestamme (pRASLO) før CRE behandling viser et 1200 bp fragment. Det samme vektor følgende Cre behandling in vitro fungerer som en positiv kontroll for CRE mediert excision og viser ventet 240 bp bandet etter rekombinasjon.
Screening for RASLO gene mus
Tail utklipp av grunnleggerne ble brukt til å sette opp fibroblast kulturer og PCR-analyse. Derfor hale tips ble sterilisert med 70% etanol, skåret i små biter og spaltet med kollagenase i fire timer ved 37 ° C. De ble dyrket i DMEM-medium som følger med 8% FCS, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin. Etter fem dager ble halen fibroblaster behandlet med 2 uM Tat-proteinet Cre i syv timer, og den neste dag analysert under IVIS 200 Bioluminescens kamera etter tilsetning av luciferin til kulturmediet. PCR og luciferase assay positive grunnleggerne ble brukt til å etablere flere RASLO stammer. Genotyping ble utført av halen PCR med skrå (5′-CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 «) og revers primere (5′-CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3»).
Produksjon og Administrasjon av Adenoviral CRE
HEK 293 cellene ble infisert med rekombinant adenovirus som uttrykker Cre-rekombinase (AdCre) [12] med (MOI = 5). Etter fem dager ble cellene høstet og virus ble utgitt av rask tining og frysing sykluser. Virus ble renset ved ultrasentrifugering på en cesiumkloridgradient [13] Deretter ble virusforråd ble samlet via konsentrasjon ved anvendelse Slidalyzer kassetter (Thermo Fisher Scientific).
Forut for nasal anvendelse av AdCre mus ble bedøvet med en kombinasjon av 10 mg /ml Ketamin /0,1% Rompun i PBS. Avhengig av kroppsvekt av musen mellom 150 pl og 200 pl ble injisert i.p. 2 x 10
7 PFU av AdCre ble pipettert på nesen til mus som skal inhaleres. Dyrene ble observert før helt våken og komfortabel. Det er ingen tegn til stress og ubehag ble observert. Etter svulst induksjon, ble dyrene overvåkes daglig for tegn på ubehag eller åndenød. Musene ble ekskludert for videre analyser, når mus viste symptomer på respiratorisk stress. Mus ble fotografert på en jevnlig basis etter IVIS 200 bioluminesens kamera (PerkinElmer). I korthet, ble musene bedøvd med isofluran innånding og deretter fikk 2,8 mg D-Luciferin Firefly (Sylinder) i 200 ul PBS i.p. og avbildes på en oppvarmet scene. Mus ble drept ved halshugging etter 6 uker med AdCre administrasjon. Lungene ble umiddelbart fiksert i 4% PBS-bufret formalin i 24 timer for parafin embedding, eller hurtigfrosset i flytende nitrogen for kryo-bevaring.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA ble isolert fra cellelinjer som genereres fra transgene mus lungesvulster eller fra Dypfryst (FF) lungevev med DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng av templat DNA ble anvendt pr reaksjon. Hver PCR-reaksjon inneholdt 1 x buffer, 0.2 mM dNTP, 2 mM MgCl
2, 0,2 U Taq-polymerase og 0,2 uM primer. For å vise vellykket fjerning av loxP-seter 5 «Lox5 termin: 5′-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3» og 3 «Ras5 omvendt: 5′-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3′ ble benyttet, hvilket ga et produkt på 240 bp. Uten fjerning av stoppkodonet disse primerne ga et produkt på 1,2 kb. For å bekrefte keratin locus eksisjon de følgende primere ble anvendt: DEL (forover 5»- TGAACCCAGGAGGTTGAGAC-3 «og 5′- omvendt TGGCGTCGTGATTAGTGATGA) og FLOX (forover 5′- GATAACCGTATTACCGCCTTTG-3′ og 5»- omvendt CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 «).
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
følgende cellelinjer av human opprinnelse ble brukt: A549, ble H1975, H460, HCC827, DMS114, og SW1271 innhentet fra American Type Culture Collection. R. Thomas (Universitetet i Köln) ber gitt: N417 [14], PC9 [15]. GLC1, GLC2 [16], og GLC36 [17] var en slags gave av Dr. L. de Leij (University of Groningen, Groningen, Nederland). NSCLC og SCLC-cellelinjer ble dyrket i DMEM medium supplementert med 8% FCS ble inkubert ved 37 ° C og 5% CO
2
Mus lungecellelinjer ble generert fra RASLO KII + /+ og KIIf /. – mus. Svulster ble skåret med en skalpell og spaltet i minst 3 timer ved 37 ° C i DMEM medium /Ham F12-medium med L-glutamin supplert med 2% bovint serumalbumin, 0,5 ug /ml hydrokortison, 600 U /ml kollagenase, 5 ug /ml human insulin, 200 U /ml hyaluronidase, Hepes-buffer 10 mM, og penicillin /streptomycin. Cellesuspensjonen ble filtrert to ganger og røde blodceller ble lysert med ACK lyseringsbuffer. Celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med murine EGF 20 ng /ml, basisk fibroblast vekstfaktorer (bFGF) 20 ng /ml heparin-natriumsalt fra svinetarmslimhinne 4 ug /ml, B-27 Serum-Free Supplement, penicillin /streptomycin og Gentamycin 35 ug /ml.
QRT-PCR
Total RNA ble isolert fra human lunge-cancercellelinjer eller cryo-konservert mus lungevev (5 x 10 um slides) av RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng av total RNA ble transkribert til cDNA ved hjelp av Super ™ III H
– revers transkriptase og Oligo (dt) 12-18 Primer (Life Technologies). QRT-PCR ble utført med SYBR grønn (Qiagen) med primere rettet mot keratin 8 (forover 5′-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 «og 5′-revers CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3′). Som en kontroll rengjøring vi brukte 28 s-RNA (forover 5»-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 «og 5′-revers AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3′). Luciferase-primere hadde følgende sekvens: 5»-fremover TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 «og 5′- omvendt TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3»; og som en renhold kontroll 18 s.: termin 5’ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3 «og reversere 5’TGACCGCGGACAGAAGGCCC-3»
Alle QRT-PCR ble kjørt på 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems ), og analysert med SDS2.2 programvare (Applied Biosystems). Alle prøver ble analysert i tre paralleller og ekspresjonsnivået ble beregnet ved bruk av ΔΔCT metode.
Immunofluorescens av Lung Cancer Cell Lines
Cellene ble sådd ut på dekkglass over natten og fiksert i iskald metanol i 5 minutter , deretter farget med pan-Keratin (1:100, MNF116, Dako) og DP-1 (1:100, DP-1, Progen) fortynnet i TBS /1% BSA /5% NGS i 1 time ved romtemperatur. Tilsvarende sekundære antistoffer geit anti-gp
Alexa488 (1:800, Life Technologies), geit anti-mus
TexasRed (1:800, Life Technologies) og DAPI (1:1000, Life Technologies) fortynnet i TBS /1% BSA /5% NGS ble tilsatt til cellene i 45 minutter ved romtemperatur. Bilder ble tatt med en invertert mikroskop utstyrt med en ApoTome (Zeiss).
Immunohistochemistry
Vev ble fiksert i 4% PBS-bufret formalin, innstøpt i parafin (FFPE). 3 um objektglass ble anvendt for histologiske flekker. Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere [18]. Følgende antistoffer ble brukt: Ki67 (01:25, TEC-3, Dako), K8 /18 (1:100, GP11, Progen), vimentin (1:100, EPR3776, Abcam), E-cadherin (01:50 SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), SS-catenin (1:100, # 4270, Cell Signaling), CD56 (01:50, RNL-en, Abcam), Snail (1:200, Abcam), synaptophysin (1 :200, SY38, Abcam), kromogranin A (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), Perk (01:50, Cell Signaling), CD44 (01:50, Abcam). Alle lysbildene ble skannet med en Pannoramic 250 lysbilde skanner (3D Histech.com).
statistikker
Statistikk ble beregnet med Excel, Prism og SPSS. Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet. Den t-test ble brukt til å analysere data for signifikante forskjeller. P-verdier og 0,05 ble ansett som betydelig og angitt i tallene som følger:. * P≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001
Resultater
Generation av RASLO murine Lung Cancer Model
Vi ga en ny transgen murin modell (RASLO) for lunge adenokarsinom, som ved CRE rekombinase-indusert fjerning av et stoppkodon er drevet av en konstitutivt aktiverte onkogene KRAS
Val12 henhold kontroll av et 1,8 kb kylling ß-aktin-promoteren. Konstruksjonen uttrykker også et fusjonsgenet som består av en S-tag (for immunhistokjemi), luciferase (for in vivo deteksjon av tumorer) og kylling ovalbumin (som en modell tumor antigen) ved hjelp av en polyomavirus indre ribosomalt gjeninnføringsstedet ( fig. 1A). RASLO mus ble generert av pronukleus injeksjon av C57Bl /6 × FVB F1 embryoer. De resulterende dyr ble screenet for en vellykket integrering av en funksjonell konstruksjon, ved inkubasjon av halen fibroblast kulturer med rekombinant Tat-Cre protein [19] for å kutte ut stop kassetten og aktiver konstruere
in vitro
. Deretter ble disse fibroblaster avbildes med en IVIS 200 bioluminescens kamera etter tilsetning av luciferin til kulturmediet (Fig. 1B) for å identifisere dyr med en fullt funksjonell integrasjon av den RASLO konstruksjonen. Fem grunnleggerne ble identifisert basert på PCR og luciferase analyser, hvorav den ene viste bakterie nettoverføring.
Vi søkte en adenovirus som uttrykker CRE recombinase (AdCre) intranasalt (intranasal) til RASLO mus. Lungesvulster utviklet i disse mus etter 6 til 8 uker, som kan visualiseres
in vivo
ved påvisning av bioluminescens etter i.p. injeksjon av luciferin (Fig. 1C) og var makroskopisk påvisbar
ex vivo
som mange hvite knuter som dekker lungene (Fig. 1D). Svulster som oppstår i RASLO mus behandlet med AdCre omfattet flere papillær adenomer og invasiv papillær adenokarsinomer (Fig. 1E), som er konsistent med KRAS drevet lungekreft modellene som er beskrevet tidligere [4], [20]. Svulstdannelse ble utelukkende etablert i lungene, som vi ikke observerer tumordannelse i alle andre organer av AdCre-behandlede RASLO mus. Genomisk PCR-analyse av cellelinjer etablert fra RASLO lungesvulster avslørte vellykket fjerning av stopp kassetten (fig. 1F).
Redusert Keratin Expression i SCLC
Tap av keratin uttrykk er ofte observert i løpet av EMT samt transformasjon fra et adenokarsinom til et småcellet karsinom (SCLC) [8]. Derfor farget vi menneskelige lunge adenokarsinomer og småcellet lungekreft prøver for keratin og kun observert perinuclearly kondensert keratin flekker i SCLC prøvene sammenlignet med sterk cytoplasma flekker i cohesively voksende lunge adenokarsinomer (Fig. 2A øverste panelene). Et tilsvarende fargemønster av keratin ble observert i cellekulturer av adenokarsinom og SCLC-cellelinjer ved immunfluorescens-farging (fig. 2A, nedre paneler). Videre har vi farget for desmoplakin at når fraværende, fører til mer invasive tumorvekst og er fraværende eller reduseres i mange humane epiteliale cancere [21]. I SCLC, desmoplakin var fraværende, mens NSCLC uttrykt desmoplakin (Fig. 2A). Vi videre undersøkt om keratin er forskjellig uttrykt i NSCLC og SCLC cellelinjer. Faktisk SCLC cellelinjer uttrykte liten eller ingen mRNA for keratin 8, mens NSCLC linjer uttrykte høye nivåer av keratin 8 mRNA (Fig. 2B).
(A) Immunohistochemistry av FFPE tumorprøver for pan Keratin av adenokarsinom lunge og en typisk SCLC (øvre paneler av A). Immunfluorescens av et adenokarsinom (HCC827) og SCLC cellelinje (GLC36) farget for pan Keratin (rød) og desmoplakin (DSP i grønt) (A, nedre paneler). (B) Total RNA ble isolert fra et panel av humane SCLC og NSCLC-cellelinjer. Relative mRNA-ekspresjon av keratin 8 ble målt ved QRT-PCR Midlere relativ ekspresjon av fire eksemplarer analyser for hver cellelinjer er avbildet og SEM er indikert. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en t-test: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representant for tre uavhengige eksperimenter.
Keratin Loss in vivo ikke fører til EMT eller en mer aggressiv tumorbiologi
For å undersøke om tap av keratin uttrykk i adenokarsinomer i lungene funksjonelt leads til verre tumorbiologi ved å indusere EMT eller en liten celle fenotype, krysset vi RASLO mus med induserbar keratin KO linje (KII). RASLO mus med en vill-type type II keratin klynge (KII + /+) eller huse en vill-type og en knockout-allelet (KII +/-) eller en floxed og en knock-out allel (KII f /-) ble behandlet med AdCre intranasalt. Alle tre grupper av mus utviklet svulster som var påviselig
in vivo
av bioluminesens bilde innen 6 uker (Fig. 3A). Seks uker etter AdCre behandling ble musene avlivet og tumorbelastning og morfologi ble vurdert. For å bekrefte genotypen til mus og lungesvulster, vi utførte PCR-reaksjoner på DNA ekstrahert fra hele lungen av musene med primere som er spesifikke for RASLO konstruere, den slettede og floxed Keratin type to klynge (Fig. 3B). Alle mus viste tilstedeværelse av RASLO konstruere, og som forventes bare KII +/- og KII f /- viste innsettelse av DEL locus, og utelukkende musene med KII f /- allelet ga det forventede PCR-båndet (Fig. 3B) . Vi brukte tre forskjellige tiltak for å kvantifisere tumorbelastning av KII + /+, KII +/- og KII f /- dyr. For det første, kvantifisert vi tumorbyrden ved å måle mengden av luciferase mRNA i tumorbærende lungene hjelp av QRT-PCR (fig. 3C). Luciferaseekspresjon kan være korrelert med tumor belastning som det er co-uttrykt av RASLO konstruere. Vi observerte ikke en statistisk signifikant forskjell i luciferase mRNA nivåer mellom gruppene. Dette indikerer at en redusert Keratin uttrykk ikke fører til økt tumor belastning.
(A) Grupper av RASLO transgene mus krysset på forskjellige Keratin II klase alleler ble bedøvet med ketamin /Rompun, og 2 × 10
∧7 pfu AdCre ble administrert i seks ukers tidligere. For svulst deteksjon, ble musene injisert intraperitonealt med luciferin i 200 mL PBS og avbildes med en IVIS-200 (Xenogen) kamera. Biolumine-scerende sammenligning av representative villtype (ctrl), RASLO transgen med vill-type Keratin locus (KII + /+), RASLO transgen med heterozygot Keratin klynge II uttrykket (KII +/-) og RASLO transgene mus med en knock-out og ett floxed Keratin klynge II allel (KII f /-) her vises. De forskjellige gruppene viste Bioluminescens signaler med tilsvarende intensitet. (B) Allele spesifikk PCR-analyser for DNA isolert fra kryo-konservert lungesvulster av RASLO mus for å påvise FLOX, DEL, og RASLO alleler ble utført. (C) Luciferase-mRNA-ekspresjon ble bestemt nivå i kryo-konserverte lungene ved QRT-PCR for å estimere tumorbelastningen. Expression nivå ble normalisert til 18 s RNA. (D) Kvantifisering av tumorbyrden etter område på tre seksjoner per lunge. Tre representative HE snitt per lunge ble analysert med hensyn på prosentandelen av tumorområdet (øvre panel) og tumorstørrelse (nedre panel). FFPE- seksjonene ble farget for K8 /18 og avbildes med Pannoramic250 (3DHistech) lysbilde skanner. Maksimal svulst diameter på opptil tretti svulster representant kreft per lysbilde ble målt med 3DHistech Pannoramic Viewer og gjennomsnittlig maksimal diameter sammenligne mellom de ulike genotyper. (F) Immunhistokjemisk farging for keratins 8 og 18 i svulster RASLO Kii f /- mus. (G). Målestokk representerer 100 mikrometer. Ville typen RASLO svulster (til venstre) sammenlignet med KII – /- svulster på høyre vises som HE flekker (øverste panelene) og Keratin 8 og 18 (nedre paneler) verdier er avbildet som gjennomsnitt +/- SEM. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en t-test: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Representant for tre uavhengige eksperimenter.
I tillegg har vi anslått svulsten belastningen ved å vurdere% av lunge området som dekkes av svulst på tre sagittal deler av lungene ved to blindet uavhengige observatører. Dette viste at svulster av tilsvarende størrelse som er utviklet i de RASLO mus som bærer de forskjellige keratin genotyper (Fig. 3D). I tillegg ble tumorstørrelse bestemt ved måling av tumordiameter ved hjelp av bilder av skannede histologiske preparater. En sammenligning mellom de ulike genotypene viste ingen signifikante forskjeller (Fig. 3E). Disse data antyder at fraværet av minst ett allel av type II keratin klynge ikke i betydelig grad påvirke tumorbiologi i denne KRAS drevet modell av lunge adenokarsinom.
Aktiveringen av KRAS konstruksjonen krever skapingen mediert fjerning av et 800 bp stort DNA-fragment inkludert et stoppkodon (fig. 1A). For å slette hele type II keratin klynge, trenger en DNA fragment av 0,68 Mbs fjernes [10], [22]. Derfor kan vi ikke forvente at alle svulster i RASLO × KIIf /- mus ville være helt blottet for keratin. For å visualisere disse svulster i lungene av RASLO × KIIf /- mus der floxed KII-allelet ble fjernet, farget vi parafinsnitt for keratins 8/18. Omtrent 30% av tumorene fullstendig manglet keratin ekspresjon, noe som indikerer at faktisk cre-mediert delesjon av KII klynge var ikke så effektiv som aktivering av KRAS konstruksjon (fig. 3F). Morfologisk, keratin-mangel svulster var typisk papillær adenomer og adenokarsinomer utvisket fra nabo keratin positive svulster på samme lysbilde (Fig. 3F) eller fra KRAS-indusert lungesvulster fra keratin villtype dyr (Fig. 3G). For å undersøke om keratin tap hatt innflytelse på spredning eller apoptose rate i KRAS drevet lungesvulster, har vi konkludert med spredning priser og apoptose priser ved Ki67 og kløyvet caspase 3 flekker, henholdsvis, men ikke observere signifikante forskjeller (Fig. 4A, B) . Oppsummert disse data gir bevis for at tap av keratin uttrykk ikke påvirker tumorcellestørrelse på KRAS drevet murine lunge adenokarsinomer og at nærværet av 30% keratin negative tumorer endret ikke samlet tumorbyrden, noe som tyder på at tap av keratin uttrykk er ikke direkte som er involvert i etableringen av småcellet og aggressiv fenotype av SCLC
(A) Ki-67 immunhistokjemi av en KII -. /- mangelfull tumor (sammenlign figur 5 fra den samme serie av seriesnitt). (B) Formell analyse av 6 områder per lunge av seks Keratin villtype og KII – /- svulster avslører lignende Ki-67 spredning indeksen. Kløyvet caspase 3 farging viste bare enkelt positive celler (rød pil) i i Keratin mangelfull (- /-). Og Keratin uttrykker svulster (Kii)
Keratin Loss påvirker ikke uttrykk for EMT og Nevroendokrine markører i lungesvulster
reduksjonen av keratin uttrykk og kondens i et Punktum perinukleær mønsteret er karakteristisk for nevroendokrine småcellet lungekreft og er mye brukt som en markør for EMT i adenokarsinomer. Selv om keratin negative svulster som oppstår i AdCre behandlede KRAS × KIIf /- mus skilte seg ikke morfologisk fra sine naboland keratin positive tumorer, undersøkte vi om keratin negative tumorer uttrykte flere markører assosiert med EMT og SCLC fenotype
Immunhistokjemi viste at den type III mellomliggende filamentprotein vimentin, som ofte er oppregulert i løpet av epitelial til mesenchymal overgang (EMT) etter tap av keratin uttrykket (Mani ua, 2008), ble det heller ikke uttrykt i keratin-positive eller -negative tumorer av KRAS × KIIf /- mus (fig. 5). Videre chromogranin A, CD56, og synaptophysin, er immunhistokjemiske markører uttrykkes vanligvis i små celle nevroendokrine karsinomer i lunge [23], [24]. Men begge keratin-positive og -negative tumorer i KRAS × KIIf /- fikk mus ikke uttrykk for noen av disse markørene (fig 5.). Positive kontroller for spesifisitet stainings er vist i figur S1. Vi deretter analysert markører assosiert med tap av celle-celle-kontakter i løpet av EMT. Spesielt tapet av E-cadherin indusert av flere transkripsjons repressors som sneglen, og Slug [25] er typisk for EMT. Men vi fant ikke at keratin-mangeltumor uttrykt transkripsjons repressors Snail, Slug eller tapt E-cadherin uttrykk (Fig. 6).
Mus ble bedøvet og 2 × 10
7 PFU Adeno -CRE virus ble pipettert på nesen til mus som skal inhaleres. Mus ble avlivet etter 6 uker og lungene av mus ble fjernet og formalinfiksert og parafin innebygd. IHCs for K8 /18, vimentin, kromogranin A (chromo), CD56 og synaptophysin (synapto) vises. En høyere forstørrelse av en Keratin negativ svulst er vist i høyre kolonne og området eske til venstre.
Seks uker etter Adeno-Cre administrasjon, ble musene avlivet og lungene av musene ble fjernet og formalinfiksert og parafininnebygd. En høyere forstørrelse av en Keratin negativ svulst er vist i høyre kolonne og området eske til venstre. Stainings av serie seksjon for EMT markører, dvs. E-cadherin, Snail, Slug, og β-catenin vises.
Utvikling og vedlikehold av adherens veikryss avhenger av en multiprotein kompleks av β-catenin, α -catenin og E-cadherin. Ved aktivering av Wnt signalering, en betydelig andel av P-catenin i blir translokert til kjernen for å slå på genekspresjon assosiert med EMT [26]. Vi farget for ß-catenin men kunne ikke oppdage noen kjernefysisk ß-catenin uttrykk i keratin villtype eller sviktende svulster (Fig. 6). Vi har tidligere vist i cellelinjer som mangler KII klyngen, ZO1 og Desmoplakin er ikke lenger plassert på membranen [22] Vi har forsøkt å farge for Desmoplakin og ZO1 på murine FFPE materiale. I figur S2 + /+ for ZO1 vises farging av villtype mus hud og KII. Vi kunne oppdage noen membran flekker på huden prøven som tjente som en positiv kontroll. Men vi fikk ikke se noen membran flekker i vill type eller KII – /- svulster. I tillegg farget vi RASLO vill typ og keratin mangel svulster for pMAPK og CD44 og ikke observere og forskjell (fig. S2). Oppsummert har keratin tap i vårt KRAS lungetumor modellen ikke føre til utvikling av svulster med en liten celle fenotype eller ekspresjon av markører assosiert med EMT. Disse dataene indikerer at keratin tap i seg selv er ikke ansvarlig for utbruddet av EMT eller utvikling av en liten celle fenotype i adenokarsinomer i lungene i musemodellen som presenteres her.
Diskusjoner
Loss av keratin uttrykk er et kjennetegn på både småcellet lungekreft og EMT og har blitt foreslått for å forbedre invasjon og metastasering. Videre i adenokarsinomer i lungene som har blitt behandlet med romanen EGFR tyrosinkinasehemmere, konvertering til en liten celle fenotype og EMT har blitt identifisert som en av flere resistensmekanismer for å unngå terapi [8].
For
