Abstract
Bakgrunn
Claudins er kjent som tight junction proteiner, og deres uttrykk mønster i magekreft er fortsatt kontroversielt. Forholdet mellom de uttrykk mønstre av trange veikryss proteiner og tumor spredning i tidlig magekreft er fortsatt langt fra klart.
Mål
For å undersøke uttrykk mønstre av claudin-18 og Ki-67 i tidlig magekreft ved invasiv foran og rundt normal mageslimhinnen og å undersøke den biologiske funksjonen til claudin-18 i spredning og invasjonen av kreftceller.
Metoder
syttifem tidlig magekreft lesjoner fjernes via endoskopisk mucosal reseksjon eller endoskopisk submucosal reseksjon ble evaluert. Alle magekreft lesjoner ble diagnostisert som differensiert adenokarsinom med japanske Klassifisering av magekarsinom. For å vurdere epitelproliferasjon, farging med Ki-67 ble utført, og merkingen indeksen ble beregnet. For å vurdere ekspresjon av epitelceller tette koplingsproteiner, ble immunofluorescerende farging av claudin-18 utført. Immunreaktiviteten til claudin-18 ble gradert i henhold til antallet fargede celler. Korrelasjonsanalyse ble utført av Spearmans rang korrelasjonskoeffisient. Transfeksjon av claudin-18 liten interfererende RNA (siRNA) ble oppnådd i MKN74, et claudin-18-positive magekreft cellelinje, for å undersøke effekten av claudin-18 på proliferasjon og invasjon av kreftceller.
Resultater
claudin-18 var signifikant nedregulert i magekreft i forhold til omkringliggende mage normal slimhinne eller intestinal metaplasi. Ki-67-merkeindeksen av magekreft ved invasiv foran var inverst korrelert med claudin-18 nivå, men at på slimhinne lesjonen ikke var korrelert. Claudin-18 knockdown betydelig fremmet spredning av MKN74 sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler. MKN74 invasjon økte signifikant med claudin-18 siRNA transfeksjon sammenlignet med kontroll siRNA transfeksjon.
Konklusjoner
Nedregulering av claudin-18 er forbundet med den proliferative potensial på invasiv forsiden av magekreft, noe som tyder på at den har en sentral rolle i magekreft progresjon
Citation. Oshima T, Shan J, Okugawa T, Chen X, Hori K, Tomita T, et al. (2013) nedregulering av claudin-18 er assosiert med proliferativ og Invasive Potential av magekreft i Invasive Front. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10,1371 /journal.pone.0074757
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 28. mai 2013; Godkjent: 06.08.2013; Publisert: 20.09.2013
Copyright: © 2013 Oshima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan gjennom en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 2010-2012 (nr 22590691). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde hyppigste kreft malignitet og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødelighet på verdensbasis [1], [2]. Intramucosal GC kan curatively behandlet av endoskopisk behandling. Videre har endoskopisk submucosal disseksjon (ESD) teknikk utvidet indikasjonene for endoskopisk behandling og aktivert en bloc reseksjon av intramucosal stor og litt submucosal invasiv tidlig GCer [3]. En en bloc reseksjon av ESD muliggjør nøyaktig diagnose av kreft dybde [4].
tett veikryss (TJs) er spesialiserte membran domener som mest apikale regionen polarisert epiteliale og endotelceller [5]. Claudins er de viktigste TJ proteiner; de består av minst 27 medlems proteiner og er uttrykt i en vev-spesifikk måte, [6], [7]. De regulere paracellulære permeabilitet og etablere epitelcelle-polaritet ved sin gjerde funksjon [6], [8]. En voksende mengde nyere bevis tyder på at Claudins er viktige strukturelle og funksjonelle komponenter av TJ tråder [6], [9], og de kan spille en avgjørende rolle i tumordannelse og inflammasjon [10], [11].
Den gastrisk epitel viser en rekke endringer i claudin uttrykk fra normal slimhinne til intestinal metaplasi og adenokarsinom. Selv om GCer ble nylig klassifisert av mucin-basert uttrykk [12], [13], et claudin-baserte GC klassifiseringen er også blitt foreslått [14]. Vi har også rapportert at nedregulering av claudin-tre var knyttet til spredning av intramucosal GC [15]. Nylig ble claudin-18 knock-out mus vist seg å ha mage mucosal atrofi og paracellulære H
+ ion lekkasje [16]. Claudin-18a2 ble vist å være ofte nedregulert i GC av en intestinal fenotype, noe som tyder på at claudin-18a2 ville være en god markør for GC [17]. Men den biologiske funksjon av claudin-18, som kan være involvert i kreftcellen oppførsel, har det aldri blitt undersøkt. Videre er det ikke klart hvilken er karakteristisk for GC-celler ved invasiv fronten er relatert til den raske veksten eller aggressivitet av invasjon.
I den foreliggende undersøkelse, ekspresjonsnivået av claudin-18 i GC på invasiv fram og omgivende gastrisk mukosa ble kontrollert for første gang, og korrelasjonen mellom claudin-18-nivå og Ki-67-merkeindeksen (LI) i GC ble evaluert. Effekten av claudin-18 på spredning og invasivitet
in vitro
ble også undersøkt.
Materialer og metoder
Pasienter
En rekke av 74 pasienter med tidlig GC ble undersøkt (tabell 1). GC lesjoner (n = 75) som hadde gjennomgått kurativ eller EMR ESD ble evaluert. GCer med submucosal invasjon (n = 31) ble inkludert i denne studien. Doble kreft ble oppdaget bare i en mannlig pasient. Alle GC ble klassifisert som differensiert adenokarsinom med japanske Klassifisering av magekarsinom [18]. Pasient anonymitet ble bevart. Denne studien ble utført i samsvar med erklæringen av Helsinki og ble godkjent av etikkomiteen /Institutional Review Board of Hyogo College of Medicine. Faget ga skriftlig informert samtykke.
Immunohistochemistry
Prøvene ble fiksert med 10% formalinløsning og innebygd i parafin. Seksjoner ble kuttet til tre mikrometer tykkelse og ble farget med hematoxylin og eosin (HE). For å vurdere epitelproliferasjon, ble prøvene inkubert med Ki-67 monoklonalt antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), etterfulgt av inkubering med biotinylert heste-anti-muse-sekundært antistoff (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Streptavidin-biotin kompleks-metoden (Vector Laboratories) ble anvendt for å visualisere immunreaktivitet. Kjerner ble kontra med hematoksylin.
Immunofluorescent Farging av junctional Proteiner
Kanin anti-claudin-18 polyklonale antistoff (Invitrogen) og Cy3-konjugert geit anti-kanin IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove , PA, USA), sekundært antistoff ble anvendt for å visualisere immunreaktivitet. Spesifisiteten av reaksjonen ble testet ved inkubasjon med ikke-immun kaninserum (Dako, Glostrup, Danmark).
Skårer for Farging av claudin-18 og Ki-67
Immunreaktiviteten ble bedømt etter to uavhengige observatører (T.Ok., XC), og begge var blinde for clinicopathological funksjoner og kliniske utfall assosiert med hver prøve. Ikke neoplastisk mageslimhinnen uten intestinal metaplasi (non-IM) og med intestinal metaplasi (IM) og kreft regioner ble vurdert. Immunreaktiviteten til claudin-18 ble gradert etter følgende kriterier: 0, fravær av farging av membranen; 1+, færre enn 10% av tumorcellene med fullstendig membran flekk; 2 +, 10% til 50% av tumorcellene med fullstendig membranfarging; 3+, mer enn 50% til 75% av tumorcellene med komplett, sterk farging av membranen; og 4 +, mer enn 75% av celler med komplett, meget sterk farging av membranen. Fem høy effekt felt ble analysert i hver region av tilfellene, og gjennomsnittsskår ble beregnet. Alle seksjonene ble bedømt to ganger for å bekrefte reproduserbarheten av resultatene. Ki-67 LI ble beregnet etter teller 1000 kreftceller.
Små interfering RNA (siRNA) Knockdown Eksperimenter
For siRNA stanse all menneskelig claudin-18, ON-TARGET pluss SMARTpool og en ikke -spesifikk kontroll siRNA ble kjøpt fra Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Den MKN74 cellelinje (japansk Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank, Osaka, Japan), som er
CLDN18
-positivt, ble valgt til å studere effekter av claudin-18 knockdown på spredning og invasjonsegenskapene til GC celler . Cellene ble transfektert med 25 nM siRNA hjelp DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Kontroll og styring siRNA grupper ble behandlet med transfeksjonsagensene reagenser uten siRNA og transfeksjonsagensene reagenser med uspesifikk kontroll siRNA, respektivt. Analyser ble utført 3 dager etter at MKN74-celler ble transfektert.
Cell Proliferation Assay
Celleformering ble bestemt ved en kolorimetrisk analyse av celle-levedyktighet basert på spaltingen av tetrazoliumsaltet WST-1 etter mitokondrie dehydrogenase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). Absorbansen av formazanet fargestoff dannet, som korrelerer med antallet av metabolsk aktive celler i kultur, ble målt ved 450 nm 1 time etter tilsetning av reagenset.
Invasion Assay
MKN74 celle invasjon ble analysert i 24-brønners BioCoat Matrigel invasjonen kamre (8 mikrometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) i henhold til produsentens protokoll. De nederste kamre ble fylt med RPMI 1640 med 10% FBS, og cellene (2 × 10
5) ble plassert i innleggs kamre, som inneholdt RPMI 1640 uten FBS. Etter 24-h inkubasjon ble ikke-invasiv cellene fjernes med en bomullspinne. De celler som har migrert gjennom membranen og fast til den nedre overflate av membranen ble fiksert med 10% formalin og farget med hematoksylin. For kvantifisering, ble cellene telles under et mikroskop i fem tilfeldige høy effekt felt. Analyser ble utført in triplo. Invasjonen ratio å kontrollere medium ble beregnet.
Statistical Analysis
Statistisk evaluering ble utført ved hjelp SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Korrelasjonsanalyse ble utført av Spearmans rang korrelasjonskoeffisient (rs). Multiple sammenligninger ble utført ved anvendelse av Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Scheffe test. Enkle sammenligninger ble utført ved hjelp av Mann-Whitney test.
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Uttrykk for claudin-18 i mageslimhinnen og Carcinoma
Totalt 75 differensierte GC tilfeller ble analysert i denne studien. Snittene ble farget med claudin-18, og graden av farging ble gradert. Claudin-18 ble påvist i høye nivåer i mage-epitelceller ved de apikale og laterale sidegrenser i ikke-IM, men ikke i IM eller differensierte adenokarcinomceller (fig. 1A). Nivåene av claudin-18 var signifikant lavere i kreftceller enn i ikke-IM og IM, samt betydelig lavere i IM sammenlignet med ikke-IM (fig. 1B).
(A) HE farging av gastrisk mucosa med ikke-intestinal metaplasi (non-IM), intestinal metaplasi (IM), og kreft. Claudin-18 blir detektert i mageslimhinnen med ikke-IM ved overflaten grensen og lateral membran av epitelcellene, men ikke med IM eller kreft. Hvit bar = 100 mikrometer, Yellow bar = 50 mikrometer. (B) claudin-18 nivået er betydelig lavere i GC enn hos ikke-IM eller IM. Nivået er også betydelig lavere i IM enn i ikke-IM.
#
P
0,05 vs. IM. **
P
. 0,01 vs. non-IM
Påvisning av claudin-18 i GCer med submucosal Invasion
Representative GC tilfeller med submucosal invasjon viste den tette claudin-18-farging var tydelig ved invasiv forsiden av submucosal invaderte-kreftceller, og Ki-67 LI var lav ved lesjon (fig. 2A). I et tilfelle med lav claudin-18 flekker på invasiv foran submukøse invaderte-kreftceller, Ki-67 LI var høy på lesjon (Fig. 2A).
HE farging viser tilfeller av submucosal invasiv GC. Ki-67 positive kjerner blir oppdaget i kreftcellene. Ki-67 LI er lav i et tilfelle av submucosal-positive claudin-18 farging (3+) (til venstre) og høy i et tilfelle av submucosal-negative claudin-18 farging (0) (til høyre). Bar = 100 mikrometer. (B) Ki-67 LI er omvendt korrelerte med claudin-18 nivå (rs = -0.550,
P
= 0,0010).
Korrelasjon av claudinet-18 nivå og Ki-67 LI
Ki-67 LI av GC i slimhinnene og submucosa ble bestemt av hvor stor prosentandel av Ki-67-positive kjerner. For å bestemme korrelasjonen mellom Ki-67 LI og claudinet-18 nivå, ble korrelasjonsanalyse utført. Slimhinnene uttrykk nivå claudin-18 ble ikke signifikant korrelert med Ki-67 LI (rs = 0,07,
P =
0,60). På den annen side ble det submucosal claudin-18 ekspresjon nivå vesentlig omvendt korrelert med den submucosal Ki-67 LI (rs = -0,550,
P
= 0,0010) (fig. 2B).
Effekt av claudin-18 siRNA på spredning og invasjon av GC Cells
En GC cellelinje, MKN74, konstitutivt uttrykt claudin-18, og mRNA nivået av claudin-18 var signifikant redusert med siRNA mot claudin- 18 (fig. 3A). Immunofluorescens farging med claudin-18 også redusert etter transfeksjon (fig. 3B). I claudin-18 nedregulert MKN74, ble cellevekst signifikant (fig. 4A) øker, og invasjonen av cellene ble signifikant øket (fig. 4B).
(B) Farging av claudin-18 er redusert med claudin-18 siRNA behandling. Bar = 50 mikrometer. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. **
P
0,01 vs. kontroll eller kontroll siRNA
(A) claudin-18 siRNA behandling induserer cellevekst betraktelig.. (B) claudin-18 siRNA-transfektert MKN74 celler viser en betydelig høyere invasjon ratio i forhold til å kontrollere eller styre siRNA-transfekterte celler. Typiske bildene presenteres på toppen. Bar = 500 mikrometer. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. **
P
. 0,01 vs. kontroll eller kontroll siRNA
Diskusjoner
Endret uttrykk for Claudins på submucosal invasive fronten kan være relatert til progresjon av GC. Nyere studier tyder på at selv i litt submucosal invasiv GC uten lymfesystemet og vaskulær invasjon, kan ESD være gjennomførbart som en kurativ operasjon [19]. Men det er fortsatt ikke klart hvilke tilfeller av litt submucosal invasiv GC kan følges uten ytterligere kirurgi etter ESD. I foreliggende studie ble det funnet at det var en invers korrelasjon mellom claudin-18 nivå og Ki-67 positivitet i invasiv foran submucosal invasiv GC, og at claudin-18 regulert GC celle invasjon og proliferasjon. Ki-67 immunhistokjemi har blitt substituert for mitotisk telling ved vurdering av tumorcelle-proliferasjon. Studier har vist at Ki-67 er korrelert med udifferensierte og metastatiske celler i maligniteter [20]. I denne studien ble bare EMR /ESD-reseksjon GC hvor indikasjonen er begrenset til den differensierte type GC studert. Derfor er disse data indikerte at Ki-67 nivå ved invasiv forsiden var relatert til metastatiske celler i ondartede sykdommer, og at tap av claudin-18 var en av de markører for GC aggressivitet og kan være relatert til utviklingen av metastasering, noe som nødvendiggjør ytterligere kirurgi etter ESD behandling
Claudins er unormalt regulert i en rekke kreftformer som GC, leverkreft, galleveier karsinom, brystkreft, nyrecellekreft, og mesothelioma [15], [21] -. [ ,,,0],25]. Endringen i Claudins i veikryss er forbundet med tap av tett vedheft og polaritet i epitel. Tap av polaritet er forbundet med økt cellulær proliferasjon og epitelial-til mesenchymale overgang, mens forstyrrelser i trange forbindelseskomplekser forandre celle-celle-interaksjoner, som er forbundet med invasjon og metastase [23], [26], [27]. I observasjonsstudier, avtar i claudin-3 og -4 er rapportert i GC-celler ved invasiv fremre og ble funnet å korrelere med progresjon av kreft og metastase [14]. Nedregulering av Claudins er også blitt rapportert i noen andre epiteliale tumorer, inkludert tap av claudin-1 i brystkreft [28] og i tykktarmen [29], så vel som tap av claudin-7 brystkreft [30] og hode og nakke kreft [31]. Når det gjelder invasjonen av kreftceller, redusert uttrykk for claudin-7 ved invasiv foran ble funnet å være korrelert med dybden av invasjonen og lymfatiske engasjement i plateepitelkarsinom i spiserøret [32]. Selv om claudin-3 og claudin-7 uttrykk var lavere i submucosal invasiv foran enn i mukosale lesjoner i vår tidligere studie, ble claudin-3 og claudin-7 nivåer på invasiv fronten ikke korrelert med Ki-67 LI [15]. På den annen side, claudin-18 ved invasiv foran var inverst korrelert med Ki-67 LI i denne studien. Disse dataene kan være relatert til funnene som claudin-3 og claudin-fire ikke var knyttet til lymfeknutemetastase [33]. Videre kan disse observasjonsstudier ikke forklare om disse endringene direkte påvirke tumorinvasjon og metastasering.
claudin-18 er i hovedsak uttrykt i magen og lunge epitelceller. Claudin-18a2 er den formen for magen, og isoformene er litt annerledes. I en tidligere rapport, ble mage typen claudin-18 tapte i GCer [17]. Men under intestinal metaplasi, allerede er forskjellig ekspresjon mønster av Claudins fra den normale gastriske epitel. Forsvinningen av claudin-18 ble funnet å være assosiert med intestinal metaplasi i magen [17]. Derfor kan tapet av claudin-18-ekspresjon i avansert GC [17] ikke bare å demonstrere karakteren av kreft. Selv i ferd med GC progresjon, kan uttrykket nivå endres. For å utforske funksjonen til disse målmolekyler, trodde vi det var viktig å undersøke svulster på samme scene, og vi har vurdert nivået av claudin-18, som kan påvirke invasjon og metastasering, i litt submucosal invasive GC lesjoner. Videre kan gastrisk mucosal claudin-18 ikke fungerer like ved TJs, fordi det uttrykte lokalisering på celleoverflaten ikke var bare ved TJS. Videre undersøkelser er nødvendig for å undersøke fysiologiske og patofysiologiske TJ protein uttrykk ved lateral membran.
For å undersøke om endringer i claudin-18 nivåer ved submucosal invasiv foran bidratt til spredning og invasjonen av kreftceller, en siRNA tilnærmingen ble anvendt for å knockdown proteinet i MKN74 GC-cellelinjen, noe som er positivt for claudin-18. Foreliggende studie viste for første gang funksjonen av claudin-18 i GC ved anvendelse av en genetisk måte, og at tap av claudin-18 var involvert i både proliferasjon og invasjon av GC-celler. Sammen med disse data, tap av claudin-18 på submucosal invasiv foran indikerte oppkjøpet av mer aggressive egenskaper og kan tillate celle-celle dissosiasjon under invasjonen. Imidlertid er en begrensning av denne studien var det bare MKN74 kunne bli undersøkt, fordi det var den eneste differensiert magekreft cellelinje som uttrykte claudin-18 så langt vi undersøkt. Derfor kan lignende fenomener ikke reproduseres med andre gastrisk cancer-cellelinjer.
Både oppregulering og nedregulering av Claudins er blitt rapportert å være involvert i kreftprosessen [34], [35]. For analyse av funksjonen av Claudins i kreftceller, har genetiske tilnærminger til Claudins også blitt rapportert i forskjellige kreftceller. Knockdown av claudin-1 ved siRNA resulterte i inhibering av migrering i kolon kreftceller [36]. Overekspresjon av claudin-6, claudin-7, eller claudin-9 forbedret invasiv potensialet av en gastrisk adenokarsinom-cellelinje [37]. Slike claudin-indusert spredning og invasjon kan virke paradoksalt, fordi Claudins er kjent for å være involvert i tetting epitel veikryss. Disse kontroversielle data tyder på at funksjonene Claudins er både subtype- og celletype-spesifikke.
Som en begrensning i denne studien, er det fortsatt ikke klart at dette redusert claudin-18 nivå på submucosal invasive fronten er faktisk er involvert i kreft metastase, fordi det er vanskelig å følge den naturlige historien til tidlig GCer. Men dataene i denne studien viste at et lavere claudin-18 nivå ved invasiv foran var forbundet med større proliferativ tendens. Det er nødvendig å prospektivt undersøke om denne reduksjon i claudin-18 nivå kan brukes som en metastatisk og prognostisk biomarkør etter endoskopisk reseksjon i en fremtidige studier.
I sammendrag, er det blitt vist for første gang claudin-18 er heterogent uttrykt i submucosal invasiv foran tidlig GC, og nedregulering av claudin-18 er forbundet med den proliferative og invasive potensialet av GC. Disse funnene tyder på at claudin-18 har en sentral rolle i utviklingen av GC og kan være en kandidat biomarkør for sykdomsutvikling. En claudin-18 knockdown forsøket bekreftet at undertrykkelse av junctional claudin-18 forfremmet spredning og invasjonen av GC-celler.
Takk
Vi takker Ms. Noriko Kamiya for teknisk assistanse.
