Abstract
Det er en stor mengde vitenskapelig bevis som tyder på at 3,3′-Diindolylmethane (DIM), et sammensatt avledet fra fordøyelsen av indol-3-carbinol, som er rik på cruciferous grønnsaker, havner anti-tumor aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Samle bevis tyder på at AMP-aktivert protein kinase (AMPK) spiller en viktig rolle i cellulær energi homeostase og tumorutvikling og at målretting AMPK kan være et lovende terapeutisk alternativ for kreftbehandling i klinikken. Vi har tidligere rapportert at en formulert DIM (BR-DIM, heretter omtalt som B-DIM) med høyere biotilgjengelighet var i stand til å indusere apoptose og hemme cellevekst, angiogenese, og invasjon av prostatakreftceller. Men den nøyaktige molekylære mekanisme (r) for anti-kreft-effekter av B-DIM er ikke fullstendig klarlagt. I denne studien undersøkte vi om AMP-aktivert protein kinase (AMPK) er en molekylære mål av B-DIM i menneskelige prostata kreft celler. Våre resultater viste, for første gang, kan det B-DIM aktivere AMPK signalveien, forbundet med undertrykkelse av pattedyr målet for rapamycin (mTOR), nedregulering av androgenreseptoren (AR) ekspresjon, og induksjon av apoptose i begge androgen-sensitive LNCaP og androgen-insensitive C4-2B prostata kreft celler. B-DIM også aktiverer AMPK og nedregulerer AR i androgen-uavhengig C4-2B prostata tumorxenotransplantater i SCID-mus. Disse resultater antyder at B-DIM kunne brukes som et potensielt anti-cancermiddel i klinikken for forebygging og /eller behandling av prostatakreft, uavhengig av androgen respons, selv om funksjonell AR kan være nødvendig
Citation:. Chen D, Banerjee S, Cui QC, Kong D, Sarkar FH, Dou QP (2012) Aktivering av AMP-aktivert proteinkinase av 3,3′-Diindolylmethane (DIM) er assosiert med humant Prostate Cancer Cell Død
In vitro
og
In Vivo
. PLoS ONE 7 (10): e47186. doi: 10,1371 /journal.pone.0047186
Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, Kina
mottatt: 5 mars 2012; Godkjent: 13 september 2012; Publisert: 09.10.2012
Copyright: © Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Karmanos Cancer Institute (til QPD) National Cancer Institute (1R01CA120009, 3R01CA120009-04S1 og 5R01CA127258-05, til QPD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) blir uttrykt i alle eukaryote celler, og er et viktig enzym som spiller en vesentlig rolle i cellulær homeostase energi, så vel som styring av prosessene i forbindelse med tumorutvikling, inkludert cellesyklusprogresjon, celle spredning, proteinsyntese, og overlevelse. Derfor, som et anti-kreft mål, har fått AMPK intensiv oppmerksomhet i de senere år. Pattedyr AMPK er et trimert serin /treonin proteinkinase som består av en katalytisk α subenhet og to regulatoriske subenheter, β og γ. AMPK aktiveres gjennom fosforylering av Thr-172 på α-subenheten av en energireduserende stress, for eksempel økte forholdstall på AMP /ATP [1] og ADP /ATP [2], eller stimulert av cellulære kinaser inkludert lever kinase B1 (LKB1 ) [3] – [4] og kalmodulin-avhengig protein kinase kinase (CaMKK) [5]. Når aktivert, spiller AMPK to hovedfunksjoner, metabolske og ikke-metabolske. I reguleringen av metabolske prosessen, phosphorylates AMPK serin-deler i mange target proteiner og resultater i igangsetting av katabolske veier for å aktivere ATP-generering prosesser, inkludert opptak og oksidasjon av glukose og fettsyrer, og slå av av anabole veier inkludert protein, fett syre og kolesterol synteser, som forbruker ATP [6]. Når det gjelder ikke-metabolske funksjoner av AMPK, kan aktivering av AMPK indusere cellesyklus arrest og hemmer celledeling og proteinsyntese i ondartede celler gjennom flere mekanismer som for eksempel opphopning av tumor suppressor faktor p53 og cyclin-avhengig kinase hemmere p21 og p27 [7 ], så vel som nedregulering av den mTOR veien [8] – [9]. Omfattende forskning støtter rollen AMPK i kreft forebygging og terapi, noe som tyder på at målretting AMPK kan være et lovende alternativ for kreftbehandling.
For å nå dette målet, metformin, en anti-diabetiker narkotika, har vist seg å aktivere AMPK , heve en hypotese at metformin kan redusere risikoen for cancer i pasienter med type 2 diabetes gjennom aktivering av AMPK veien [10]. Faktisk har rapporter fra kliniske studier har vist at diabetespasienter som behandles med metformin hadde en signifikant lavere forekomst av kreft tilfeller og kreft relatert dødelighet sammenlignet med pasienter eksponert for andre anti-diabetes medisiner [10] – [12]. Prekliniske studier har også vist at metformin ikke bare hemmer veksten av kultiverte kreftceller [13] -. [14] og svulster hos mus [15], men også selektivt er rettet mot kreftstamceller [16]
I tillegg metformin, noen naturlige forbindelser, inkludert quercetin, genistein [17], capsaicin, EGCG [18], og curcumin [19], har vist seg å ha kreft effekter assosiert med aktivering av AMPK signalveien. Faktisk har naturlige produkter vært den mest produktive kilde til ledningene for utvikling av anti-kreft medikamenter. I henhold til litteraturen, ble omtrent 73% av anticancermedikamenter oppdaget fra naturlige opprinnelse eller er avledet fra naturlige forbindelser i løpet av det siste halve århundre [20]. Den naturlige sammensatte indol-3-carbinol (i3c), som finnes i relativt høye nivåer i cruciferous grønnsaker som brokkoli og kål, og dens dimer 3,3′-diindolylmethane (DIM) har vist anti-tumor aktivitet
i vitro Hotell og
in vivo product: [21] – [22]. Nylig rapporterte vi at et formulert DIM (BR-DIM, hentet fra BioResponse Nutrients, LLC., Boulder, Colorado, heretter forkortet til B-DIM), viste ca 50% høyere biotilgjengelighet
in vivo product: [23] sammenlignet med DIM. B-DIM indusert apoptose og inhiberte cellevekst, angiogenese, og invasjon av prostata kreftceller, som er forbundet med reguleringen av Akt, NF-kB, VEGF og Ar signalveier [24] – [25]. Dessuten har nylige resultater vist at B-DIM behandling av prostatakreft-celler
in vitro
eller B-DIM intervensjon hos pasienter med prostatakreft førte til den kjernefysiske utelukkelse av AR forbundet med aktivering av MIR-34a [24 ]. Men den nøyaktige molekylære mekanismen (e) der B-DIM spiller sin anti-kreft og kreft-forebyggende roller er ikke fullstendig klarlagt; mer spesifikt, har det ikke blitt rapportert om den biologiske aktiviteten til B-DIM er knyttet til induksjon av AMPK signal.
Derfor, i denne studien undersøkte vi effekten av B-DIM på AMPK signal og dens relaterte nedstrøms mål i både androgen-sensitive LNCaP og androgen-insensitive C4-2B prostatakreftceller som inneholder funksjonell AR. Våre resultater viste, for første gang, at B-DIM kan fungere som en AMPK aktivator. Aktivering av AMPK av B-DIM resulterte i nedregulering av AR og prostataspesifikt antigen (PSA) ekspresjon, og som skyldes induksjon av celle apoptose, undertrykkelse av mTOR vei, og hemming av prostasphere dannelse i humane prostatakreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre funn viste også at AMPK veien er en av de nye molekylære mål av B-DIM for sin anti-kreft effekt mot menneskelig prostatakreft.
Metoder
Cell Culture, Protein Extraction, og Western blot analysen
Menneskelig prostatakreft C4-2B (henvendelse til professor Leland Chung, Emory University, School of Medicine, Atlanta, GA, og for tiden på Cedars-Sinai, Los Angeles, California) og LNCaP (American Type Culture Collection Manassas, VA, USA) celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin, 100 enheter /ml penicillin, og 2 mM glutamin, i en fuktet inkubator med 5% CO
2 og 95% luft ved 37 ° C. En hel celleekstrakt ble fremstilt som tidligere beskrevet [26]. For Western blot-analyse, ble en lik mengde protein fra hver celleekstrakt underkastet denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Individuelle membraner ble undersøkt med angitte antistoffer. Immunoreaktive bånd ble utviklet ved hjelp av pepperrot-peroksydase-konjugerte sekundære antistoffer og SuperSignal WestPico kjemiluminescerende substrat (Pierce) og visualisert ved bruk av røntgenfilm.
Prostasphere Formation Assay
Prostasphere formasjon analyse ble utført for å vurdere evnen av kreft stamcelleselvfornyelse følge våre publiserte prosedyre [27]. I korte trekk, enkeltcellesuspensjoner av C4-2B celler ble grundig suspendert og sådd ut i ultralave adherente-brønner i 6-brønners plater (Corning, Lowell, Massachusetts) ved 1000 celler /brønn i 1,5 ml sfære dannelse medium (DMEM 01:01 /F12-medium supplementert med 50 enheter /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin, B-27, og N-2). En milliliter sfære formasjon medium ble tilsatt hver 3. dag. Etter 6 dagers inkubering med ulike konsentrasjoner av B-DIM eller metformin (som en kontroll), ble de dannede sfærer oppsamlet ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter og prostasphere tall ble tellet under et invertert fasekontrastmikroskop. Andelen av kule-genererende celler, ble beregnet ved å dividere antall celler sådd med antall prostaspheres.
forsøksdyr
Mann homozygotiske CB-17 SCID-mus (4-5 uker gamle) ble kjøpt fra Taconic Farms (Germantown, New York). Musene ble plassert og holdes under sterile forhold i anlegg akkreditert av American Association for akkreditering av Laboratory Animal Care og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health and Human Services, og NIH. Musene ble brukt i samsvar med Animal Care og bruk Retningslinjer for Wayne State University under en protokoll godkjent av Wayne State University Animal Care og bruk komité. Mus fikk Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN).
Menneskelig Bone og Implantasjon av tumorceller
Menneske mannlig foster benvev ble innhentet av en tredjepart ideell organisasjon ( avanserte Bioscience Resources, Alameda, CA), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra donor familie, i samsvar med forskrift gitt av hver stat involvert og den føderale regjeringen. Etter en uke med akklimatisering ble musene implantert med en enkel, human fetal benfragmentet som tidligere beskrevet [28] – [29]. C4-2B celler ble høstet fra subsammenflytende kulturer etter en kort eksponering til 0,25% trypsin og 0,2% EDTA. Trypsinering ble stoppet ved tilsetning av et medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble vasket en gang i serumfritt medium og resuspendert. Bare suspensjoner som består av en enkelt celle med 90% levedyktighet ble anvendt for injeksjonene. -Celler (1 x 10
6) i 20 mL serumfritt RPMI-medium ble injisert intraosseously ved innføring av en 27-gauge nål og Hamilton-sprøyte gjennom musehud direkte inn i margen overflate av den tidligere implanterte benet. I vår tidligere erfaring med denne modellen, har vi funnet en svulst opptak hastighet på mer enn 95% i forhold til hud xenograft hvor svulsten opptaksraten var relativt mindre med lengre latenstid. Så snart flertallet av benimplantater begynte å forstørre (nå kalt en «bone svulst») som bestemt ved kalibermålinger (30. dag etter kreftcelle-injeksjon), ble musene tilfeldig delt inn i følgende behandlingsgrupper (n = 7): ( a) ubehandlet kontroll; (B) bare B-DIM, 5 mg /mus matet hver dag oralt med sonde for 4 uker siden behandlingsstart. Volumet av benet tumoren i hver gruppe ble bestemt ved to ganger ukentlig kalibermålinger. Kroppsvekten til musene i hver gruppe ble også målt. Alle mus ble avlivet dagen etter siste dose av B-DIM behandling (5 uker) fordi store tumorer ble dannet i kontrollmusene, noe som kreves for terminering, og deres endelige kroppsvekt og tumorvolumet ble registrert. Ved autopsi ble tumoren pent skåret ut, befridd for eventuelle uvedkommende klebende vev, og en del av vevet ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin for farging og H 0,05, ** P. 0,01
B-DIM Aktiverer AMPK og nedregulerer AR i Androgen Uavhengig C4-2B Prostata tumorxenotransplantater i SCID mus
de ovennevnte resultatene fra vår
in vitro
studier viste tydelig at AMPK signalveien er en av de nye molekylære mål av B-DIM i prostatakreftceller. For å bekrefte dette funnet
in vivo
, har vi designet og brukt den eksperimentelle bein metastasedyremodell (se Materialer og metoder) som etterligner bein metastasering av menneskelig prostatakreft. Vi har funnet at B-DIM behandling
in vivo
hemmet C4-2B tumorvekst inne i benet mikromiljøet til en viss grad (20%; data ikke vist). De tumorvev ble fjernet og analysert ved hjelp av immunhistokjemi anti-fosfor-AMPKα, fosfor-ACC og AR antistoffer. Resultatene viste at p-AMPK- og p-ACC-positive cellepopulasjoner økt betydelig, mens AR-positive celler ble redusert i stor grad i de tumorer som ble behandlet med B-DIM sammenlignet med kontrollen (Fig. 5). Disse funnene bekrefter at B-DIM er i stand til å aktivere AMPK veien
in vivo
, i forbindelse med sin anti-kreft aktivitet.
ICR SCID-mus implantert med C4-2B celler og behandlet med 5 mg /mus av B-DIM av muntlige gavages daglig i 4 uker. Tumorvev ble analysert ved immunhistokjemi hjelp av anti-fosfor-AMPKα (t172), fosfor-ACC (S79) eller AR antistoffer. De fargede seksjoner ble visualisert under mikroskop (400 x forsterkning). I motsetning til løsemiddel behandlet kontroll, mus behandlet med B-DIM presenteres med aktivering av AMPK og betydelig tap av AR i tumorsnitt.
Diskusjoner
Letingen etter nye antitumormedikamentene fra naturlig kilder er en av de mest lovende fremgangsmåter for kreft forebygging og terapi. Vi har studert formulert 3,3′-Diindolylmethane (B-DIM) og viste at B-DIM kan indusere apoptose og hemme cellevekst, angiogenese, og invasjon av prostata kreft celler ved å regulere NF-kB, Akt og AR signalveier [ ,,,0],24] – [25]. Men den nøyaktige molekylære mekanisme (r), der B-DIM utløse sin anti-kreft effekt på human prostatacancer er ikke fullstendig klarlagt. I denne studien, oppdaget vi at AMPK er en av de direkte molekylære mål av B-DIM i prostatakreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
.
AMPK signal veien har nylig blitt et viktig fokus for interessen for kreft forebygging og behandling. Bowker
et al
. undersøkt forekomsten av kreft i 10,309 diabetespasienter behandles med insulin, metformin eller sulfonylurea i en periode på 5 år. De rapporterte at pasienter behandlet med metformin hadde en signifikant lavere forekomst av kreft-relaterte dødelighet sammenlignet med pasienter eksponert for andre anti-diabetes medisiner [12]. Den store anti-kreft mekanisme av metformin var assosiert med aktivering av AMPK signalering [34]. Aktivering av AMPK hemmer energikrevende trasé, proteinsyntesen og celledeling, gjennom undertrykkelse av mTOR veien
via
tuberous sklerose 2 protein (TSC-2) [38]. Hirsch H
et al
. rapporterte at metformin selektivt er målrettet kreft stamceller og hemmer tumorvekst i musemodeller som medieres ved aktivering av AMPK veien [16]. Det har blitt rapportert at enkelte naturlige forbindelser inkludert genistein (rik på soyabønne), EGCG (rikelig i grønn te), og capsaicin (fra hot pepper) er i stand til å aktivere AMPK vei [17]. Funn av flere AMPK aktivatorer fra naturlige kilder er blitt en attraktiv tilnærming til kreft forebygging og behandling.
Vår nåværende funn viser at B-DIM kan aktivere AMPK signaliserer så tidlig som tre timer i både androgen-sensitive LNCaP og androgen -ufølsomme C4-2B prostatakreftceller, målt ved: (i) økte protein nivåer av fosfor-AMPKα (t172), (ii) økte nivåer av fosforylert ACC på serinrest 79 [30] – [31], (iii) øket protein nivåer av fosfor-Raptor (S792), som er et direkte mål for AMPK og en mTOR bindingspartner og-inhibitor [8], og (iv) reduserte nivåer av fosfor-mTOR (fig. 1). Konsekvenser av AMPK aktivering av B-DIM å være mediert gjennom hemming av AR og PSA uttrykk, som fører til induksjon av apoptose ved ytterligere behandling i ytterligere 21 timer (fig. 1, 6). AMPK aktivering av B-DIM kan bli blokkert av forbehandling med forbindelse C, en AMPK inhibitor, i prostata kreft celler (fig. 2).
androgen reseptor (AR) er en kritisk faktor for prostatakreft utvikling og progresjon. Prostatakreft er avhengig av androgen stimulering mediert ved AR, og AR selv spiller en viktig rolle i kreftutvikling og medikament-resistens i androgen-uavhengig prostatacancerceller. Alternative mekanismer for AR aktivering i androgen-uavhengig prostatakreft er foreslått gjennom andre signalveier, inkludert ERKs, Akt, β-catenin og caveolin [39] – [41]. Derfor undertrykkelse av AR er en av de terapeutiske strategier for prostata kreftpasienter. Casodex er en anti-androgen medikament klinisk anvendt for pasienter i metastatisk /avansert stadium. Eventuelle naturlige forbindelser som kan forbedre effekten av Casodex- har potensiell terapeutisk nytte i klinikken. Vi viste i denne studien at samtidig behandling av celler med Casodex og B-DIM ført til en betydelig økning i fosfor AMPKα og undertrykte AR uttrykk i prostatakreftceller (Fig. 3), viser en ny mekanisme for synergi av anti- AR terapi.
Prostatakreft vev inneholder en sjelden populasjon av multi-potente kreftstamceller med kapasitet til å fornye seg selv. Disse prostatakreft stamceller kan bli beriket og målt ved hjelp av en kolonidannelsesbestemmelsen i tredimensjonale kulturer, referert til som prostasphere formasjonen. Prostata kreftceller med stamcelle egenskaper har evnen til å danne prostaspheres fra enkeltceller som en betingelse for selvfornyende i kulturbetingelser ikke-adherente [42]. For å finne ut om B-DIM kunne målrette prostata stilk /stilk-lignende celler, vi testet den i prostasphere formasjonstester. Resultatet viste at etter seks dagers inkubasjon av C4-2B celler med forskjellige doser av B-DIM, ikke bare var antall dannet prostaspheres betydelig redusert, men størrelsen på prostaspheres ble redusert i tillegg (Fig. 4). Funnene fra
in vitro
studier ble ytterligere bekreftet av immunhistokjemiske resultatene fra tumorvev av prostatakreft xenografter behandlet med B-DIM (Fig. 5). Positive cellepopulasjoner farget med fosfor-AMPK eller fosfor-ACC ble betydelig økt, mens AR-positive celler ble redusert i B-DIM behandlede tumor vev (fig. 5).
Oppsummert tilveiebringer foreliggende studien det første bevis på at AMPK signalveien er en av de molekylære mål av B-DIM for sin anti-kreft-aktivitet. Aktivering av AMPK av B-DIM resulterer i undertrykkelse av sin nedstrøms mål mTOR, nedregulering av ekspresjon AR og induksjon av apoptose i både androgen-følsomme LNCaP og androgen-insensitive C4-2B prostatakreftceller (Fig. 6). Aktivering av AMPK av B-DIM ble også observert i behandlede prostatakreft. Våre funn viser at B-DIM kunne brukes som en potensiell middel i klinikken for forebygging og /eller behandling av prostatakreft, uavhengig av androgen respons av cellene.
Takk
Vi takker Ms Sara Schmitt for kritisk lesing av manuskriptet.
