Abstract
Formål
Prostatakreft (PCA) er preget av liberaliserte uttrykk for flere tumor suppressor eller onkogene miRNAs. Målet med denne studien var å identifisere og karakterisering av MIR-la-7c som en potensiell tumor suppressor ved PCA.
Experimental Design
Nivåer av uttrykk for MIR-la-7c ble undersøkt i menneskelige PCA cellelinjer og vev ved hjelp QRT-PCR og
in situ
hybridisering. La-7c ble overexpressed eller undertrykkes for å vurdere effekter på veksten av humane PCA cellelinjer. Lentiviral-mediert re-uttrykk for la-7c ble benyttet for å vurdere virkningene på mennesker PCA xenografter.
Resultater
Vi identifiserte MIR-la-7c som en potensiell tumor suppressor ved PCA. Uttrykk av utleid-7c er nedregulert i kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) celler. Overekspresjon av la-7c redusert mens nedregulering av la-7c økt celleproliferasjon, clonogenicity og forankringsuavhengig vekst av PCA celler
in vitro
. Undertrykkelse av la-7c uttrykk forbedret evne til androgen-sensitive PCA celler til å vokse i androgen-belastede forhold
in vitro
. Tilberedning av Let-7c ved lentiviral-mediert intratumoral levering betydelig redusert tumorbyrde i xenografter på menneske PCA celler. Videre la-7c uttrykk er nedregulert i klinisk PCa eksemplarer sammenlignet med sine matchet godartede vev, mens uttrykk for Lin28, en mester regulator av la-7 miRNA behandling, er oppregulert i kliniske PCA prøver.
Konklusjoner
Disse resultatene viser at mikroRNA la-7c er nedregulert ved PCA og fungerer som en tumor suppressor, og er en potensiell terapeutisk mål for PCa
Citation. Nadiminty N, Tummala R, Lou W, Zhu Y, Shi XB, Zou JX, et al. (2012) mikroRNA la-7c Er nedregulert i prostatakreft og undertrykker prostatakreft vekst. PLoS ONE 7 (3): e32832. doi: 10,1371 /journal.pone.0032832
Redaktør: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 13 juli 2011; Godkjent: 02.02.2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Nadiminty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH CA140468, CA118887, CA109441, DOD PC080538 (AG) og DOD PC100502, American Cancer Society-IRG (NN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst forekommende kreft og den nest hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødelighet hos menn i USA. Flertallet av pasienter med avansert PCa svare i første omgang å androgen deprivasjon terapi, men tilbakefall på grunn av veksten av kastrering resistent prostatakreft (CRPC) celler. Betydelig innsats har vært fokusert på å forstå mekanismene som er involvert i utvikling og progresjon av CRPC. MicroRNAs (mirnas) er endogene små ikke-kodende RNA som kan forstyrre protein uttrykk enten ved å indusere spalting av deres spesifikke mål mRNA eller ved å hemme deres oversettelse. Moden mirnas er evolusjonært konserverte ~22nt enkelt strandet RNA som følge av en flertrinnsbehandling av større forløper molekyler via drosha og dicer. Til slutt de modne mirnas er innlemmet i RISC kompleks sammen med sine mål mRNA som er anerkjent av sekvens komplementaritet i 3′-UTR [1]. Hver miRNA kan målrette flere ulike mRNA og hver mRNA kan bli målrettet av flere mirnas, genererer et intrikat nettverk av genuttrykk regulering. Mirnas er blitt vist å regulere et raskt økende liste over komplekse biologiske prosesser, inkludert differensiering, cellesyklus, apoptose og metabolisme [2]. En overveldende mengde nye bevis peker til sine roller som tumor suppressors eller onkogener som presenterer et helt spekter av nye diagnostiske og terapeutiske muligheter [1], [3].
La-7 koder et evolusjonært konservert familie av 13 homologe mirnas ligger i genomisk steder ofte slettet i humane kreftformer [4]. Ekspresjon av la-7 i lungecancercellelinjer redusert celleproliferasjon [5] og inhiberer tumorigenesis av brystcancer-celler og samtidig redusere metastase [6]. Overekspresjon av la-7 også redusert lungekreft celle motstand mot strålebehandling [7]. Redusert ekspresjon av la-7 i humane lunge cancer har vært forbundet med forkortet postoperativ overlevelse, noe som tyder på at La-7 kan være en viktig prognostisk markør i lungekreft [8]. Tilsvarende ble 5-års progresjonsfri overlevelse funnet å være høyere i eggstokkreft pasienter med lavere HMGA2 /la-7 prosenter i forhold til de med høyere HMGA2 /la-7 prosenter [9]. Det er en klar sammenheng mellom tap av la-7 ekspresjon og utvikling av dårlig differensierte og aggressive kreft [10]. La-7 ekspresjon ble funnet å bli nedregulert i lokaliserte PCA vev i forhold til benign randsone vev [11], [12]. La-7 medlemmer har vist seg å regulere uttrykket nivåer av onkogener som HMGA2 [5], RAS [13] og Myc [14] sammen med gener som er involvert i cellesyklus og celledeling regulering. Terapeutiske strategier blir utviklet målgruppe la-7, ved hjelp av enten lenti-eller adeno-virus-kodet overekspresjon av la-7 eller transient transfeksjon av dobbel-strandet forløpere til la-7 [15], [16]. Dermed la-7 viser lover som en molekylær markør i visse kreftformer og som en potensiell terapeutisk i behandling av kreft.
Lin28, en høyt konservert RNA-bindende protein og en master regulator av la-7 miRNA behandling, er overuttrykt i primære, humane tumorer [17], [18], og er antatt å være en av de embryoniske stamcellefaktorer som fremmer onkogenese og proliferasjon av cancerceller ved undertrykkelse av den la-7 familie av tumor suppressorer [19]. Lin28 binder seg til terminalen ledd av forløperne la-7 familie mirnas og blokkerer deres behandling i modne mirnas [20], [21]. Lin28 derepresses også c-myc ved å undertrykke la-7 og c-myc aktiverer transcriptionally Lin28 [22], [23]. Dette Lin28 /la-7 /c-myc sløyfe kan spille en viktig rolle i det deregulerte miRNA uttrykket signatur observert i mange kreftformer [24].
I denne studien, viser vi at la-7c, en av de medlemmer av skuffelse 7 familie, undertrykker PCa vekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Overekspresjon av la-7c førte til inhibering av forankringsavhengige samt forankrings-uavhengig vekst av PCA-celler. Reexpression av la-7c i xenografter menneske PCA celler ved hjelp lentivirally kodet la-7c hemmet tumorvekst betydelig. I tillegg la-7c uttrykk nedregulert i kliniske PCA prøver. Våre resultater antyder at prostata tumorvekst er regulert la-7c og at tilberedning av la-7 kan ha gunstige effekter ved PCA ved å redusere overlevelse og spredning av kreftceller.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
LNCaP, C4-2B, PC-346C og DU145-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). LNCaP, C4-2B og PC346C cellene er androgen reseptor (AR) positiv og svare på androgen tilskudd, mens DU145 cellene er AR negative og er androgen-insensitive. LNCaP-S17 og LNCaP-IL6 + cellelinjer ble generert i vårt laboratorium med stabil transfeksjon av full lengde IL-6-cDNA inn i LNCaP-celler og ved kronisk behandling av LNCaP-celler med 5 ng /ml rekombinant IL-6 respektivt. Begge cellelinjer som oppviser autocrine IL-6 signalering. Antistoffer mot Actin og Tubulin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Lin28 antistoffer ble oppnådd fra Abcam (San Francisco, CA). SYBR Grønn iQ Supermix var fra Bio-Rad. Lentivector baserte la-7c konstruksjonen ble hentet fra System biovitenskap og Lin28 ORF og shRNA konstruksjoner ble oppnådd fra Open Biosystems.
Western Blot analyse
Celler ble lysert i høy salt buffer som inneholder 50 mM Hepes pH 7,9, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM Na-vanadat, 1 mM NaF, og protease-inhibitor cocktail (Roche) som tidligere beskrevet [25]. Totalt protein ble estimert ved hjelp av Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL). Like mengder protein ble applisert på 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i PBST (1 x PBS + 0,1% Tween-20) og probet med primære antistoffer i 1% BSA. Signalet ble oppdaget av ECL (GE Healthcare) etter inkubasjon med riktige HRP-konjugerte sekundære antistoffer.
Måling av PSA
PSA nivåene ble målt i kultursupernatantene ved hjelp av ELISA (United Biotech Inc , Mountain View, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
real-Time Kvantitativ RT-PCR
LNCaP celler ble transfektert med de angitte plasmider eller oligonukleotider og total RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens ( Invitrogen). cDNA ble utarbeidet etter fordøyelse med RNase-fritt RQ1 DNase (Promega). CDNA ble utsatt for sanntids revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) ved anvendelse av SYBR grønn iQ Supermix (Bio-Rad) ifølge produsentens instruksjoner, og som tidligere beskrevet [26], [27]. Reaksjoner ble utført med en pl RT-PCR-cDNA, 0,5 ul av hver av forover og revers primere (10 pmol /l), 10,5 ul dobbeltdestillert vann, og 12,5 ul iQ SYBR grønn Supermix. Hver reaksjon ble normalisert ved coamplification av aktin. Triplicates av prøvene ble kjørt på standardinnstillingene fra Bio-Rad CFX-96 sanntid cycler. Primerene anvendt for kvantifisering av Lin28 var: forover 5′- GCCCCTTGGATATTCCAGTC-3 «og 5′-revers AATGTGAATTCCACTGGTTCTCCT-3». miRNA qPCR ble utført med bruk av miRCURY LNA Universal RT mikroRNA PCR kit og LNA-konjugert miRNA primere (Exiqon) i henhold til produsentens instruksjoner.
Northern Blotting
20 mikrogram hver av totalt RNA fra LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 og LNCaP-IL6 + celler ble kjørt på 15% Urea-PAGE-geler og overført til nylonmembraner. Etter UV-kryssbinding ble membraner hybridisert til en sonde gjenkjenne den modne sekvensen til la-7c. U6 snRNA ble brukt som lasting kontroll.
miRNA i Situ Hybridisering
In situ
hybridisering (ISH) ble utført for å bestemme mønstre av uttrykk for la-7c i menneskets klinisk PCa vev microarray som inneholder 160 kjerner hver fra uovertruffen godartede og kreft prostata. ISH ble utført ved hjelp av låst nukleinsyre (LNA) konjugert la-7c-spesifikk probe fra Exiqon i henhold til produsentens instruksjoner.
klonogene Analyser
Anchorage-avhengige klonogene evne analysene ble utført som beskrevet tidligere [28]. Kort, LNCaP celler transfektert med enten tom vektor eller la-7c ble sådd ved lave tettheter (400 celler /parabol) i 10 cm kulturplater. Platene ble inkubert ved
oC 37 i medium inneholdende enten 10% eller 10% FBS trekull-strippet FBS (CS-FBS) og ble etterlatt uforstyrret i 14 dager. Ved slutten av forsøket ble cellene fiksert med metanol, farget med krystallfiolett, og antallet kolonier ble tellet.
Soft-agar-kolonidannelse Assays
forankrings-uavhengig koloni formasjons assays var utført ved bruk av C4-2B og LNCaP-S17-celler transfektert med de angitte plasmidene. Etter transfeksjon ble cellene sådd ut i 0,35% agarose ligger over en 1,2% agar lag. Celler ble matet to ganger i uken med komplett RPMI1640 og ble inkubert ved
0 ° C 37 i 2 uker. Ved slutten av forsøket ble kolonier farget med 0,005% krystallfiolett og tellet.
Cell Growth Assays
LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP-S17 og LN-IL6 + -celler var transfektert med plasmider som uttrykker la-7c og levedyktige celler ble bestemt på 0, 24 og 48 timer ved hjelp av en Coulter celleteller.
A) Total RNA fra LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 og LN -IL6 + celler ble analysert ved hjelp av QRT-PCR. Resultatene er presentert som relativ ganger endring i forhold til uttrykk nivåer i LNCaP. Datapunkter representerer middelverdi ± SD av triplikate prøver fra to uavhengige eksperimenter. B) 20 pg av hver av de ovenfor nevnte RNA ble også analysert ved Northern blotting. U6 snRNA ble anvendt som kontroll lasting. C) QRT-PCR som viser reduksjonen i la-7c ekspresjon i LNCaP-celler som uttrykker Lin28 forhold til LNCaP-celler transfektert med tom vektor (Con). Inset Western blot viser uttrykk for Lin28. D) QRT-PCR viser økningen i la-7c uttrykk i C4-2B celler transfektert med shRNA mot Lin28 forhold til C4-2B celler transfektert med kontroll GFP shRNA. Inset Western blot viser nedregulering av Lin28. Datapunkter representerer middelverdi ± SD av triplikate prøver fra to uavhengige eksperimenter. Feilfelt betegne ± SD (*
p
0,05). E) Western blot viser uttrykket nivåer av Lin28 i PCA celler. Actin brukes som en lasting kontroll.
apoptose Analyser ved hjelp av celledød Detection ELISA
DNA fragmentering i LNCaP, DU145, LNCaP-S17 og LN-IL6 + celler transfektert med plasmider som angitt i tall ble vurdert av Celledød deteksjon ELISA kit (Roche, Indianapolis, iN) i henhold til produsentens instruksjoner.
Generering av stabile cellelinjer
stabile cellelinjer LNCaP og C4-2B uttrykke la-7c ble generert ved transfeksjon av plasmider som inneholder cDNA og valg av kloner etter påføring av seleksjonspress med egnede antibiotika.
A) Relative uttrykk nivåer av la-7c ble målt ved QRT-PCR totalt RNA hentet fra 10 parvise godartede og tumor menneskelige prostata prøver. B) La-7c nivåene ble målt ved hjelp av
in situ
hybridisering i TMA inneholder 160 kjerner hver fra uovertruffen godartede og kreft prostatabiopsier. Representative Bildene vises for godartede og kreft kjerner. Uttrykk av utleid-7c var høyere i godartet prostata forhold til kreft prostata. C) Relativ uttrykk nivåer av Lin28 i 10 paret godartede og kreft menneskelige prostata prøver. Expression nivåer av Lin28 var korrelert omvendt med de av la-7c. Feilfelt betegne ± SD (*
p
0,05).
LNCaP (A), C4-2B (B), DU145 (C), LN-IL6 + (D ) og LNCaP-S17 (E) celler ble transfektert med la-7c eller tom vektor (Con) og celletall ble bestemt etter 24 og 48 timer. Vekst av PCA celler ble undertrykt av skuffelse 7c. Innfellinger viser nivåene av uttrykk for skuffelse 7c plasmid. F) Celledød ble analysert i LNCaP, DU145, LNCaP-S17 og LN-IL6 + celler transfektert med la-7c eller tom vektor (Con). La-7c indusert celledød ved apoptose av prostatakreftceller. G) LNCaP celler transfektert med anti-sense oligonukleotider mot la-7c eller egge oligonukleotider (con) ble dyrket i FBS og CS-FBS og celle tall bestemt. Inset viser nedregulering av uttrykk for skuffelse 7c av anti-sense oligos. LNCaP celler med nedregulert uttrykk for skuffelse 7c utstilt raskere vekst i CS-FBS sammenlignet med kontroller. Datapunkter representerer middelverdi ± SD av triplikate prøver fra to uavhengige eksperimenter. Feilfelt betegne ± SD (*
p
0,05).
Dyr
6-8 uker gamle hann nakne mus ble opprettholdt i Dyreavdelingen ved UC Davis Medical Center. Alle eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité UC Davis. 1-2 × 10
6 celler /flanke ble injisert subkutant inn i begge flanker og tumorene ble tillatt å vokse. Når tumorer nådde 0,5 cm
3, 1×10
7 IFU (smittsomme enheter) av lentiviruses inneholder enten tom vektor med GFP eller la-7c forløper ble injisert intratumorally. På slutten av forsøkene, ble musene avlivet og tumorene ble skåret ut. Sera ble samlet for måling av PSA.
Menneskelige PCA eksemplarer
Koblede godartede og svulst prostata vev ble fremstilt som beskrevet tidligere [29]. Kirurgiske prøver brukt i denne studien var radikal prostatektomi prøver (en fra robotkirurgi) samles ved Johns Hopkins University fra 2002 til 2007. Prøvene ble valgt ut fra den frosne prostata svulst bank hvis paret frosne blokker beriket for histologisk normale og svulst områder var tilgjengelig. Frosne blokker ble manuelt trimmet for å ytterligere berike histologi av interesse. Frysesnitt (7 mm) ble fremstilt fra hver blokk før RNA-ekstrahering. Svulsten Innholdet i tumorprøver var større enn 80%, mens normale prøver hadde minst 60% epitel-innhold og ingen tegn på tumor til stede. Den første og siste avsnitt for hver blokk var H E farget og brukes for% epitel beregningen. Bruken av avidentifiserte kirurgiske prøver for molekylær analyse ble godkjent av IRB.
Statistiske analyser
Data er vist som gjennomsnitt ± SD. Multiple gruppe sammenligning ble utført ved enveis ANOVA etterfulgt av Scheffe fremgangsmåte for sammenligning av midler.
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
La-7c er uttrykt i PCA Cells
Våre tidligere studier ved hjelp av miRNA mikromatriser viste at utleid 7C var blant de mest modul mirnas i PCA celler (upubliserte data). For å bestemme relative nivåer av uttrykk for la-7c i PCA celler, isolert vi totalt RNA fra LNCaP (androgen-avhengige, AR-positive), PC-3, DU145 (kastreringsresistent, AR-negative) celler samt LNCaP -S17-celler som uttrykker IL-6 [30] og LN-IL6 + celler kronisk behandlet med IL-6 [31]. cDNA ble analysert ved kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av primere forsterke den modne formen av la-7c (Exiqon) spesifikt. Våre resultater viste at la-7c er uttrykt i høye nivåer i LNCaP-celler sammenlignet med de hormon ildfast PC-3 og DU145-celler (Fig. 1A). Tidligere rapporter har vist at IL-6 og la-7 oppviser gjensidig regulering av ekspresjon. LNCaP-IL6 + og LNCaP-S17-celler (autocrine IL-6 signal) viste reduksjon i la-7c nivåer, i samsvar med rapporten at IL-6 reduserer la-7-ekspresjon i PCA-celler og som la-7 regulerer IL-6-ekspresjon [ ,,,0],18]. Disse resultatene ble også bekreftet av det nordlige blotting ved hjelp av en sonde mot modne la-7c sekvens (Fig. 1B), noe som tyder på at la-7c nivåene er redusert i mer aggressive og kastreringsresistent PCA celler.
Nye rapporter viste at uttrykk for skuffelse 7 familie av miRNAs er regulert av Lin28, en mester regulator av miRNA behandling [18], [20]. I samsvar med funn, fant vi at overekspresjon av Lin28 ført til en reduksjon i la-7c nivåer i LNCaP celler (Fig. 1C), mens nedregulering av Lin28 hjelp Lin28 shRNA ført til en økning i la-7c nivåer (Fig. 1 D) i C4-2B celler som uttrykker endogen Lin28 (fig. 1E). Nedregulering eller overekspresjon av Lin28 ble bekreftet ved Western blotting (Innfelt figur 1C . D). Disse resultatene viser at Lin28 spiller en avgjørende rolle i regulering av la-7c uttrykk i PCA celler.
La-7c Expression er nedregulert i Human PCa
For å avgjøre om nivåene av la-7c uttrykket er nedregulert i klinisk PCA analyserte vi RNA fra 10 paret godartede og kreft menneskelige PCA eksemplarer av kvantitativ RT-PCR. RNA ble isolert fra humant vev, revers transkribert og underkastet QRT-PCR ved anvendelse av LNA-konjugert la-7c primere (Exiqon). Nivåene av la-7c var signifikant redusert i 8/10 tumorer i forhold til sine passet godartet prostata-vev (fig. 2A). Vi har også analysert to microarray som inneholder godartede og kreft prostatabiopsier henholdsvis
in situ
hybridisering ved hjelp av LNA-konjugert moden la-7c-spesifikk probe (Exiqon). Bildene ble analysert ved hjelp av en Olympus IX81 mikroskop og DP Controller Software. Våre resultater viste at la-7c ble sterkt uttrykt i benign PCa, mens dens ekspresjon ble nedregulert i kreft prostata (Fig. 2B). Sammen er disse resultatene tyder på at tapet av la-7c ekspresjon kan være forbundet med prostata tumorgenese.
Siden Lin28 er en viktig regulator av la-7c uttrykk, undersøkte vi Lin28 uttrykk i den 10 sammenkoblede godartede og tumorprøver prostata ved QRT-PCR bruke primere som forsterker Lin28 mRNA spesielt. Ekspresjonsnivåene av Lin28 ble funnet å være signifikant forhøyet i 9/10 par av passet godartede og tumor prostata prøver (fig. 2C). Uttrykk for Lin28 var korrelert omvendt med uttrykk av la-7c med en korrelasjonskoeffisient på -0,4, noe som tyder på at la-7c uttrykk reguleres primært av Lin28 i menneskelig PCa.
La-7c Reduserer Vekst av PCA Cells in vitro
for å finne ut om la-7c påvirker veksten av PCA celler, LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP-S17 og LN-IL6 + celler ble transfektert med plasmider som koder la-7c eller tom vektor og celle tallene ble tellet etter 24 og 48 timer. Cellenumrene til alle PCA-cellelinjer som overuttrykker la-7c ble redusert med ~40% etter 48 timer (fig. 3A-E). Innfellinger viser nivåene av ekspresjon av la-7c plasmidet i disse cellene. For å avgjøre om den observerte nedgangen i cellevekst skyldes apoptotisk celledød, ble DNA-fragmentering analysert ved celledød Detection ELISA. Som vist på fig. 3F, apoptose i celler overuttrykkende la-7c ble forbedret sammenlignet med kontroller, noe som tyder på at inhibering i cellevekst indusert av la-7c er delvis på grunn av økt apoptotisk celledød.
klonogene (A) og myk agar kolonidannende (B) evner av LNCaP-S17 og C4-2B celler transfektert med let-7c eller tom vektor (Con) ble analysert. La-7c hemmet cellevekst og overlevelse i forankringsavhengige og-Uavhengig forhold. C) klonogene assay-Øvre og nedre paneler representere koloni størrelser av C4-2B og LNCaP-S17 celler som uttrykker kontroll (tom vektor) eller la-7c hhv. D) Soft agar assay-Øvre og nedre paneler representere koloni størrelser av C4-2B og LNCaP-S17 celler som uttrykker kontroll (tom vektor) eller la-7c hhv. E) Antall kolonier dannet i klonogene analyse av C4-2B-celler som stabilt uttrykker la-7c. La-7c redusert antall kolonier dannet ved PCA-celler. Datapunkter representerer middelverdi ± SD av triplikate prøver fra to uavhengige eksperimenter. Feilfelt betegne ± SD (*
p
0,05).
I tillegg testet vi om nedregulering av la-7c vil styrke evnen til androgen-sensitive PCA celler til vokse i androgen-belastede forhold. Vi transfektert anti-sense oligonukleotider mot la-7c eller kontrollegge oligos inn LNCaP celler supplert med enten FBS eller kull-strippet FBS (CS-FBS) og overvåkes cellevekst. Resultatene viste at nedregulering av la-7c ved hjelp av anti-sense fremmet androgen-avhengige LNCaP-cellevekst under forhold med androgen deprivasjon (Fig. 3G). Nedregulering av utleid-7c av anti-sense oligonukleotider ble bekreftet ved hjelp QRT-PCR (Fig. 3G, innfelt). Disse resultatene antydet at kastrering-resistente vekst av PCa kan være kjennetegnet ved nedregulering av la-7c uttrykk.
C4-2B (A), PC346C (B) og DU145 (C) celler ble injisert i begge flanker nakne mus og svulstene mottatt en eneste intratumoral injeksjon av lentiviruses uttrykker enten GFP (kontroll) eller la-7c. Tumorvekst ble målt to ganger i uken over 3 uker. Datapunkter representerer middelverdi ± SD av tumorvolum (mm
3) av alle mus ved de angitte tidspunkter. D) sekresjon av PSA ved C4-2B og PC346C xenografter ble målt i musesera med ELISA. Tilberedning av utleid-7c i svulstene redusert utskillelse av PSA av xenografter. På slutten av forsøkene ble det tumor vev ble skåret ut, total RNA fremstilt og utsatt for QRT-PCR for å vurdere mRNA-nivåer av la-7c (E) og Lin28 (F). Feilfelt betegne ± SD (*
p
0,05).
Vi har også analysert klonogene evne PCA celler uttrykker la-7c i begge forankringsavhengige og forankringsuavhengige forhold . LNCaP-S17 og C4-2B celler ble transfektert med let-7c eller tomme vektor- og kolonidannelse ble utført. Begge klonogene (Fig. 4A) og bløt agar-koloni (Fig. 4B) formasjons evner av LNCaP-S17 og C4-2B celler ble undertrykket ved overekspresjon av la-7c. Antallet kolonier dannet på substrater av LNCaP-S17-celler ble redusert fra 142 ± 15 til 46 ± 10 og antall kolonier dannet av C4-2B-celler ble redusert fra 122 ± 10 til 34 ± 7 (fig. 4A). På lignende måte ble antall kolonier dannet i bløt agar av LNCaP-S17-celler reduseres fra 82 ± 4 til 15 ± 2, og antall kolonier dannet av C4-2B celler ble redusert fra 61 ± 5 til 21 ± 5 (fig. 4B ) ved overekspresjon av utleid-7c. Videre, størrelsen av kolonier som dannes ved hjelp av styre-transfekterte celler ble større i forhold til koloniene dannet av la-7c-transfekterte celler (figur 4C . D). Disse resultater antyder at la-7c kan hemme PCa cellevekst i forankringsavhengig, så vel som-Uavhengig forhold. Disse funnene ble også bekreftet med klonogene analysen i C4-2B-celler som stabilt uttrykker la-7c (fig. 4E).
La-7c hemmer tumorvekst of Human PCA Cell xenografter
Vi generert lentiviruses koding GFP-taggede la-7c forløper bruker Lentivector Expression System (System biovitenskap). For å avgjøre om la-7c viser anti-proliferative effekter på PCA xenografter
in vivo
, vi injisert 2×10
6 C4-2B eller PC346C (begge cellelinjene er AR-positive) celler subkutant i begge flankene av mannlige naken mus og overvåkes svulst utvikling. Når tumorer nådde en størrelse på 0,5 cm
3, ble mus randomisert i to grupper. Den eksperimentelle mus mottok en enkelt intratumoral injeksjon av lentivirally kodet la-7c, mens kontrollmusene mottok lentiviruser som uttrykker GFP. Tumorvekst ble overvåket i 3 uker, og tumormålinger to ganger ukentlig. Ved slutten av 3 uker, ble tumorene skåret ut, RNA fremstilt og QRT-PCR utført for å vurdere nivået av la-7c i xenotransplantater. Resultatene viste at tumorvekst av C4-2B (Fig. 5A) og PC346C (fig. 5B) xenografter ble hemmet signifikant i mus injisert med la-7c holdige lentiviruses sammenlignet med mus injisert med kontroll lentiviruser. I tillegg har vi også testet om la-7c kan undertrykke tumorvekst av AR-negative xenografter. Vi injisert 1×10
6 DU145 celler /flanke subkutant til hann nakne mus og utført tilsvarende forsøk med halvparten av musene som fikk en enkelt intratumoral injeksjon på lentiviruser som koder for la-7c og den andre halvparten mottok lentiviruser som koder for den tomme vektoren. Resultatene viste at la-7c var vellykket i å undertrykke tumorvekst av DU145 xenotransplantater i likhet med C4-2B eller PC346C xenotransplantater (fig. 5C). Nivåer av PSA, ble en klassiker target gen av AR, skilles ut av AR-positive xenografter målt i musesera ved hjelp av en human-spesifikke PSA ELISA kit og ble normalisert til tumor vekter. Resultatene viste at injeksjon av la-7c-uttrykker lentivirus redusert sekresjon av PSA ved tumorxenografter av C4-2B og PC346C sammenlignet med kontroll lentiviruses (fig. 5D). QRT-PCR viste at la-7c nivåer ble forbedret i svulstene injisert med la-7c-koding lentiviruses, mens nivåene av Lin28 ble redusert (figur 5E . F). Disse funnene tyder på at overekspresjon av la-7c undertrykker prostatatumorvekst, og at rekonstituering av la-7c nivåer kan presentere en attraktiv terapeutisk strategi mot menneskehandel PCa.
Diskusjoner
I denne studien har vi fant at la-7c uttrykk er nedregulert i kastreringsresistent PCA celler og kliniske prøver. Transfeksjon av lentiviral-kodet la-7c hemmet veksten og clonogenicity av PCA celler samtidig forbedre apoptotisk celledød. Motsatt, nedregulering av la-7c av anti-sense oligonukleotider dratt en overlevelsesfordel på PCA celler i androgen-replete samt androgen-utarmet miljøer. Intratumoral injeksjon av lentivirally kodet la-7c hemmet PCa xenograft tumorvekst, noe som viser at la-7c fungerer som en tumor suppressor som hindrer prostata tumorvekst. Disse resultater antyder at miRNA la-7c spiller en viktig rolle i PCa celleproliferasjon, og kan utnyttes for terapeutiske anvendelser.
Mekanismene for undertrykkelse av prostatatumorvekst hos la-7c kan være direkte eller indirekte regulering av ekspresjon nivåer av onkogener som Myc og Lin28. I en fersk rapport viste vi at la-7c rettet uttrykk for AR via målretting uttrykk for Myc [32]. AR er et nøkkel overlevelsesfaktor for prostata tumorceller og reduksjon av dets ekspresjon er vist å undertrykke prostatatumorvekst [33]. Som bekreftelse på disse funnene, ekspresjon av PSA, en av de klassiske målgener av AR, ble funnet å være undertrykket ved la-7c i xenotransplantater av C4-2B og PC346C celler i denne studien.
Det er godt dokumentert at Lin28 spiller en viktig rolle i reguleringen av utleid-7c uttrykk [18], [21]. Dette er i tråd med våre studier viser at Lin28 undertrykker la-7c uttrykk i PCA celler. Overekspresjon av Lin28 hemmet la-7c uttrykk i LNCaP celler, mens knockdown av Lin28 uttrykk økt la-7c i C4-2B celler. I tillegg viste vi at overekspresjon av la-7c reduserte nivåene av Lin28 uttrykk i svulster i PCA xenograft modeller (Fig. 5F), noe som indikerer at en negativ feedback loop eksisterer mellom Lin28 og la-7c.
flere rapporter har etablert den viktige rollen av la-7, som viser at medlemmer av la-7-familien er nedregulert i lunge cancer, og at denne nedregulering er korrelert med dårlig overlevelse [8]. En svulst suppressor rolle har blitt tilskrevet utleid-7 familie av miRNAs og ser ut til å være ubestridt bortsett fra i sjeldne tilfeller, for eksempel la-7a, som har blitt rapportert å målrette caspase-3 i kreft hos mennesker [34], og dermed undertrykke mottakelighet av kreftceller overfor kjemoterapeutiske-indusert celledød. I ondartet mesothelioma, ble la-7b * funnet å være sterkt uttrykt [35] og oppregulering av la-7b og la-7i var assosiert med høy grad av omdannelse i lymfom [36]. Disse motstridende data om deregulering av la-7 i ulike kreft hos mennesker viser at enkelte la-7 familiemedlemmer kan ha forskjellige og varierende aktiviteter i ulike celler og ikke bare vise redundante funksjoner.
En tidligere studie av Dong et al. [37] rapporterte at la-7a undertrykker prostatatumorvekst ved å målrette E2F2 og CCND2. Våre studier tyder på at La-7c undertrykker prostatatumorvekst med flere veier, inkludert regulering av IL-6, Myc, Lin28 og AR [32]. I tillegg direkte tilberedning av la-7c ved injeksjon av lentivirally kodet la-7c i etablerte xenografttumorer markerer et viktig skritt i retning av potensielle terapeutiske strategier bruker la-7c. Selv om medlemmene av skuffelse 7 familien kan utvise noen overflødige funksjoner, kan enkelte komponenter være gjenstand for forskjells og vev spesifikk regulering i ulike celletyper.
