Abstract
Bakgrunn og Sikt
I løpet av prostata utvikling, mesenchymale -epithelial interaksjoner regulere organ vekst og differensiering. I voksen prostata, stromal-epitelial interaksjoner er viktige for vev homeostase og også spille en betydelig rolle i prostata kreft. I denne studien har vi identifisert molekyler som viser en mesenchymale uttrykk mønster i utvikling av prostata, og en av disse viste redusert uttrykk i prostatakreft stroma.
Metodikk og hovedfunnene
Fem kandidatmolekyler identifisert av transkripsjon profilering av utviklings prostata mesenchyme ble valgt ved hjelp av en wholemount in situ hybridisering skjermen og studerte decorin (DCN), Semaphorin6D (Sema6D), SPARC /Osteonectin (SPARC), Sprouty1 (Spry-1) og Tsukushi (Tsku). Expression i rotte vev ble evaluert med wholemount in situ hybridisering (postnatal dag (P) 0,5) og immunhistokjemi (embryonale dag (E) E17.5, E19.5, P0.5, P6, 28 voksen). Fire kandidater (decorin, SPARC, Spry-1, Tsukushi) ble immunolocalised i human fetal prostata (uke 14, 16, 19) og ekspresjon av decorin ble evaluert på en human prostata kreftvev microarray. I embryonale og perinatale rotter decorin, Semaphorin6D, SPARC, Spry-en og Tsukushi ble uttrykt med varierende fordelingsmønstre gjennom hele mesenchyme på E17.5, E19.5, P0.5 og P6.5. I P28 og voksen prostata der var enten en reduksjon i uttrykket (Semaphorin6D) eller en bryter til epitel ekspresjon av SPARC-, og Spry-1, mens decorin og Tsukushi var spesifikke for mesenchyme /stroma i alle aldre. Uttrykk av decorin, SPARC, Spry-en og Tsukushi i humane føtale prostata parallell som i rotte. Decorin viste mesenchymale og stromal spesifikke uttrykk i alle aldre og ble ytterligere undersøkt i prostatakreft, hvor stromal uttrykk ble betydelig redusert sammenlignet med ikke-ondartet prostatakreft.
Konklusjon og betydning
Vi beskriver rom-tid uttrykk for decorin, Semaphorin6D, SPARC, Spry-en og Tsukushi i utvikling av prostata og observert lignende mesenchymale uttrykk mønstre i rotte og menneske. I tillegg decorin viste redusert uttrykk i prostatakreft stroma sammenlignet med ikke-ondartet prostata stroma
Citation. Henke A, Grace OC, Ashley GR, Stewart GD, Riddick ACP, Yeun H, et al. (2012) stromal Expression of decorin, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1 og Tsukushi i utvikling av prostata og redusert nivå av decorin i prostatakreft. PLoS ONE 7 (8): e42516. doi: 10,1371 /journal.pone.0042516
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA
mottatt: 17 august 2011; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Henke et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av Medical Research Council (WBSe 1276.00.003.00004.01) og prostatakreft Charity (https://www.prostate-cancer.org.uk/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mesenchymale-epitelial interaksjoner, mediert via celle-celle-signalisering, spiller en avgjørende rolle i beskrivelsen av pattedyr organer som prostata, nyre, lunge, og brystkjertel og også i vev homeostase av voksent vev. Mesenchyme er embryonale forløperen til voksen stroma. I hanner prostata skille ut og vokser fra urogenitale sinus og reguleres av testikkel androgener. Hos kvinner utvikler urogenital sinus inn i livmoren og vagina, selv om det vil danne en prostata hvis eksogene androgener administreres. Androgen effekt formidles via androgenreseptoren (AR) og studier i gnagermodeller har vist at AR er uttrykt i første omgang i mesenchyme og deretter i epitelet i utvikling av prostata. Tissue rekombinasjon eksperimenter ved hjelp av mesenkym og epitel fra enten villtype eller AR-manglende mus viste at en prostata bare kan utvikle seg når mesenchyme har en funksjonell AR, mens epitelial AR ikke kreves [1] – [3]. Konseptet med embryonale mesenchymale og voksne stromale celler som formidlere av orgel-spesifisitet ble understreket av en studie som viste mangfoldet og posisjon hukommelse hos voksne humane fibroblaster [4]. I den normale voksent menneske prostata mesteparten av stromal rommet er satt sammen av glatte muskelceller og fibroblaster, mens resten består av endoteliale celler, pericytes, lymfocytter og makrofager [5].
Nyere studier har markert et rolle for stromal rommet i reguleringen av kreftcelle progresjon, som nå generelt akseptert [6]. Innenfor tumor mikromiljøet kreft-assosiert fibroblaster (CAF) har blitt foreslått som en viktig kilde for pro-tumorigene parakrine mediatorer [7] – [9]. TGFβ1 er en av faktorene utskilt av cancerassosierte fibroblaster (CAF) og kan virke på en autokrin eller parakrin sløyfe ved binding til reseptor-komplekset TGFβRI /II på stromale og /eller epitelceller i bryst og prostata cancerceller [10]. Den pro-tumorigen potensialet av TGFβ1 ble vist når den genetiske ablasjon av den TGFβRII i fibroblaster resulterte i redusert tumorvekst i en musemodell [10], [11]. Et annet viktig aspekt ved stromal pro-tumorigen aktivitet er heterogeniteten av fibroblast-subpopulasjoner, og mangelen på egnede markører for dem. Flere CAF markører har vært foreslått, men identifisering av forskjellige subpopulasjoner som samtidig uttrykker noen av dem, og bidraget fra disse undergruppene til tumorvekst er nylig frem [12] – [14]
Det er en klar sammenheng mellom utviklings. signalering og sykdom. I Dunning rottemodellen av prostatakreft, inkludering av embryonale mesenchyme redusert tumorvekst, understreker lærerikt makt mesenchymalceller på ondartede celler [15]. I tillegg foreslår McNeal hypotesen om at utviklingsveier er re-aktiveres i prostata sykdom [16].
Dermed identifisering av mesenchymale /stromal formidlere av mesenchymale-epitelial kommunikasjon er avgjørende for forståelsen av utvikling og sykdom et organ. Utskilt eller membranbundne proteiner ser ut til å være de mest sannsynlige meglere av stromal /epitel parakrint signalering.
I en tidligere studie fra vår gruppe, serie analyse av genuttrykk (SAGE) av mesenchyme fra neonatal rotte urogenitaltractus identifisert 219 antatte «mesenchymale» transkripsjoner som ble uttrykt på et høyere nivå i mesenchyme enn tilstøtende epitelvev. Denne listen kan inneholde kandidater til parakrine formidlere av mesenchymale-epitelial dialog [17]. Innenfor de 219 søker transkripsjoner identifiserte vi en undergruppe som kodet utskilt eller membranbundne molekyler, som er de mest sannsynlige kandidatene for mesenchymale-epitelial interaksjon. Til dags dato har vi analysert og validert uttrykk for noen av disse kandidatene i prostata utvikling. Vi viste at Dlk1 og Notch2 signale var viktig for forgrening samt epitel og glatt muskulatur differensiering i prostata organ kultur-systemer [18]. Reseptoren EphB3 og dens ligand EphrinB1 ble også påvist i prostata mesenchyme og orgel kultur med EphrinB1-Fc ligand resulterte i økt organ området, men redusert spirende med forstørrede bud tips, mens inkubasjon med EphB3-Fc reseptor redusert organstørrelse og redusert spirende [19 ]. Pleiotrofinprotein (PTN) ble funnet å bli uttrykt i utvikling av prostata mesenchyme og det regulerte vekst av utvikle mesenchyme, epitel og kafeer. I tillegg androgen signale økt PTN uttrykk [20].
Samlet utgjør disse studier tyder på at en høy andel av kandidatene identifisert av vår SAGE profilering spille en rolle i prostata utvikling og sykdom. I denne studien har vi analysert videre kandidatmolekyler fra våre tidligere SAGE studier for å identifisere de som er uttrykt i rotte og menneskelige prostata utvikling, og i prostatakreft. Vår begrunnelse var at identifikasjonen av mesenchymally uttrykt molekyler ville gi en bedre forståelse av stromal biologi. Vi valgte utskilt og membranbundne molekyler identifisert i våre SAGE studier og utført en wholemount in situ hybridisering skjerm (WISH) for å definere om de viste mesenchymale uttrykk.
Her viser vi fem kandidatene identifisert av WISH-skjerm som ble bekreftet som viser mesenchymale uttrykk:
decorin, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 Hotell og
Tsukushi plakater (tabell 1). Disse ble undersøkt i løpet av rotte og menneskelige prostata utvikling via immunhistokjemi.
decorin og Tsukushi var de eneste kandidatene med stromal-bare uttrykk og ble senere undersøkt i prostata kreft (PCA) vev. Decorin viste en betydelig nedregulering i forhold til ikke-ondartet vev, mens Tsukushi uttrykk ikke viser noen differensial uttrykk.
Resultater
Identifisering og bekreftelse av Mesenchymally Uttrykt transkripsjoner
I en tidligere studie fra vårt laboratorium, SAGE analyse av rotte prostata mesenchyme identifisert 219 transkripsjoner som ble uttrykt i induktiv mesenchyme; disse var lovende potensielle regulatorer av organogenesen. Våre SAGE profilering studier brukt den kvinnelige prostata anlagen, kalt VMP, siden det manglet epitel og vårt mål var å identifisere ikke-epiteliale transkripsjoner. Fig. 1A viser homologi mellom mesenchyme av kvinnelige og mannlige urogenitaltractus (UGT) på P0.5, og de viktige underområder av mesenchyme er skyggelagt i grønt. Disse SAGE studier identifiserte transkripter sannsynlighet for å bli uttrykt i mesenchyme [17]. Her fokuserte vi på utskilte eller membranbundne molekyler innenfor 219 transkripsjon liste som den mest logiske kandidater for mesenchymale-til-epitelial signalering. For å definere hvilke av våre kandidatmolekyler viste mesenchymale /stromal spesifikke uttrykk mønstre, ble en liten WISH skjerm utført. Fem kandidater
decorin, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 Hotell og
Tsukushi
ble bekreftet som mesenchyme-uttrykk i denne skjermen og valgt for videre undersøkelser (figur 1B, tabell 1). Fig. 1B viser antall utskrifter (identifisert via «tags» fra 3 «enden av mRNA), normalisert per million koder til å gjøre rede for ulike tag teller mellom bibliotekene), noe som ga en tilnærming av transkripsjon uttrykk nivå. Fra vår liste over fem kandidater,
decorin Hotell og
SPARC
var de høyest uttrykte transkripsjoner, og deretter
Sema6D, Spry-1 Hotell og
Tsku
. Transkripsjonsnivåer ble målt i to forskjellige biblioteker (Vmp og VSU) og forholdet mellom disse ga en indikasjon på sannsynligheten for lokalisering til VMP mesenchyme, som VMP er et delsett av den VSU [17]. Molekyler som uttrykkes ubikvitært ga forholdstall nærmere 1, mens de som viser VMP anrikning hadde forhold på 1,4 eller høyere.
A) Skjematisk oversikt over rotte UGT anatomi ved perinatal trinn (P0.5) for den mannlige (øverst) og kvinnelig (nederst). Det grønne området tilsvarer induktiv mesenchyme, som finnes i både mannlige og kvinnelige UGTs. Den kvinnelige VMP mesenchyme ble brukt til SAGE genet profilering studier, og vårt ønske skjermen forsøkte å identifisere disse transkripsjoner uttrykt i mannens prostata mesenchyme. Figur basert på Thomson, 2001 [46]. B) transkripsjon uttrykk nivåer av
decorin, Sema6D, SPARC, Spry-1 Hotell og
Tsku
innhentet via SAGE profilering av P0.5 hunnrotte VMP [17]. Transkripsjoner ble identifisert via korte, avskrift-spesifikke sekvenser kalt tags og deres teller reflekterer transkripsjon uttrykk nivå. Forholdet mellom VMP og VSU tag teller representerer sannsynligheten for begrensning til den induktive mesenchyme; verdier ved eller over 1,4 foreslo mesenchyme spesifikke uttrykk. C) Påvisning av
decorin, Sema6D, SPARC, Spry-1 Hotell og
Tsku
mRNA distribusjon via in situ hybridisering hos hannrotte P0.5 UGTs. De små innfellinger viser UGTs behandlet med de negative kontroll fornuft RNA-prober, målestokken er 1 mm Forkortelser: AP anterior prostata, DP rygg prostata, DLP dorsolateral prostata, VP ventral prostata, VMP ventral mesenchymale pad, VSU; VMP + glatt muskulatur + urothelium, SV sædvæske.
Deretter utførte vi ønsker på rotte nyfødte urogenitale traktater (UGT) for å bestemme uttrykket av mRNA som koder våre fem kandidatmolekyler (Fig. 1C).
decorin Hotell og
SPARC
transkripsjoner viste en svært begrenset uttrykk mønster i mesenchyme av prostata (alle lapper), mens
Sema6D
,
Sprouty1 Hotell og
Tsukushi
ble uttrykt i prostata mesenchyme samt urethral mesenchyme. Generelt er tydelig ekspresjon var synlig i mesenchyme tilstøtende til epitel-kanaler og /eller bredere Epitel-omgir mesenchyme i den ventrale prostata (VP), dorsal prostata (DP), og dorsolateral prostata (DLP).
decorin
viste mest begrenset uttrykk mønster i prostata mesenchyme (Fig. 1C) og var godt synlig i mesenchyme tilknytning til epithelial knopper, og var fraværende fra ikke-prostatic mesenchyme som urinrørs mesenchyme.
Immunolocalisation av decorin i Utvikling Rat prostata mesenchyme
Vi neste undersøkt fordelingen av decorin protein for å fastslå om det viste en tilsvarende fordeling til mRNA, og hvis det var også begrenset til mesenchyme. Ved E17.5 decorin ble uttrykt i en undergruppe av UGT mesenchyme (figur 2A.); blæren og tilstøtende til den potensielle VP (Fig. 2B), er uttrykket begrenset til enkeltceller med svak ekspresjon i cytoplasma og et sterkt signal på celleoverflaten. På E19.5 decorin viste sterkt uttrykk i prostata mesenchyme og svakere flekker rundt blæren med «hot spots» (Fig. 2D). Men den potensielle VP og DP viste også decorin uttrykk, men ikke så sterk som i det peri-uretral mesenchyme (fig. 2D, E). Neonatal P0.5 og P6.5 UGTs viste lignende farging med mesenchyme-bare uttrykk og et fullstendig fravær i både urinrør og prostata epitel (Fig. 2F-I). Interessant, dette uttrykket mønster skilte seg fra WISH mønster, hvor decorin ble funnet utelukkende i mesenchyme innenfor prostata lapper, men ikke den peri-urethral område, og kan reflektere sekresjon og spredning av decorin protein. På dag 28, ble decorin ekspresjon funnet i stroma som omgir prostata- kanaler, og var fraværende fra epithelia (fig. 2J, K). På voksenlivet VP var morfologisk fullt differensiert, som inneholder decorin-negative epitel, og decorin-positive stroma (Fig. 2L, M). Oppsummert decorin viste mesenchyme og stromal spesifikke uttrykk ved alle undersøkte utviklingsstadier og et fullstendig fravær i epitel. Videre ble det lokalisert hovedsakelig til acellulær interstitium.
utviklingsstadier E17.5 (AC), E19.5 (D, E), P0.5 (F, G), P6.5 (H , I), P28 (J, K) og unge voksne (L, M) ble undersøkt. På utviklingsstadier E17.5, E19.5 de forstørrelser viser områdene potensielle VP, mens på P0.5 og P6.5 VP eller DP vises. Decorin var fraværende i epitel og glatt muskulatur kammeret, men som er tilstede i mesenchyme /stroma. Uttrykket var særlig sterk i mesenchyme tilstøtende til urethral og prostata epitel, som antydet med sorte piler og piler. Spesielt decorin syntes å co-lokalisere med strukturelle fibre i den ekstracellulære matrise, som markeres med hvite pilspisser i I og M. Legend: B blære, BV blod fartøy, C kapillære, DP rygg prostata, E epitel, M mesenchyme, L lumen prostata kanaler, S stroma, SM glatt muskel, U urinrør, VP ventral prostata. Skala barer: 200 um i A, D, F, H og L, 400 um i J, og 50 um i alle andre. Vær oppmerksom på at panelet H er størrelsen justeres – også målestokken – og er ikke i samme forstørrelse som paneler A, D og F.
Immunolocalisation av Tsku i Utvikling Rat prostata Mesenchyme
Tsku uttrykk ved E17.5 og E19.5 var begrenset til mesenchyme og glatt muskulatur, og viste en cytoplasmisk lokalisering i VP og DP (fig. 3A, B). Ved P0.5 og P6.5, Tsku var fraværende i epitel, men er tilstede i glatt muskulatur og mesenkym som omgir epiteliale kanaler i VP og DP (fig. 3 C, D).
Tsku
mRNA og protein viste lignende fordelingsmønster.
Utviklings stadier av E17.5 (A), E19.5 (B), P0.5 (C), P6.5 ( D), P28 (E) og ung voksen VP (F) ble undersøkt. På utviklingsstadier E17.5, E19.5 de forstørrelser viser områdene potensielle VP, mens på P0.5 og P6.5 det er enten VP eller DP. Tsku protein uttrykk var mesenchymale /stromal bare til P28 (piler). Men i voksen VP, var det ekstra lavt uttrykk i epitelet (pilspiss i F). Interessant, glatte muskelceller var også positive for Tsku (P0.5 til P28). Skala barer lik 200 mikrometer.
I dag 28, epitel manglet Tsku og stromal uttrykk var mindre intens (Fig. 3 E). Den fullt differensierte voksen VP viste en ytterligere reduksjon i flekker i forhold til P28. I tillegg Tsku ble observert i epitelceller (Fig. 3 F).
Immunolocalisation av Semaphorin6D, SPARC og Spry-en i Utvikling Rat prostata Mesenchyme
Semaphorin6D ble uttrykt i mesenchyme, inkludert VP anlagen, ved E17.5 til E19.5 (tilleggs fig. S1 A, B), perinatal VP og DP lapper, og på P6.5 UGTs men var fraværende i epithelia (fig. S1 C, D). Overraskende farging var begrenset til kjernene selv om Semaphorins blir vanligvis rapportert å være lokalisert på plasmamembranen. Likevel WISH mønster og protein deteksjon var konsekvent i P0.5 UGTs. Men i fullt differensiert voksen VP, ble bare leukocytter funnet å uttrykke Semaphorin6D (Fig. S1F). Oppsummert Semaphorin6D uttrykk var sterkest og mest konsekvente i mesenchyme av E17.5 å P0.5 UGTs med kjernefysiske lokalisering.
Farging av SPARC var ikke påvises i E17.5 eller E19.5 gamle UGTs ( data ikke vist). Svak mesenchymal uttrykk i VP og DP ble observert ved P0.5 og var fraværende fra epitelet (fig. S2A). SPARC- ble uttrykt i den mesenkym som omgir epitel-knopper på både P0.5 og P6.5 men farging var mer utbredt og intens i det siste stadium. I motsetning til dette var det ingen epitelial SPARC- uttrykk påvisbar (fig. S2B). Mønstrene for
SPARC
deteksjon via WISH og immunhistokjemi (IHC) var konsekvent i P0.5 UGTs.
På P28 og voksen, SPARC uttrykk var svært lav i stroma på P28 (Fig. S2C) og fraværende i voksen VP (fig. S2D). Det var imidlertid en sterk ekspresjon i en undergruppe av epitelceller luminal celler lokalisert til kjernen. I sammendrag, mens fraværende i embryonale og foster trinn, ble SPARC- uttrykt i mesenchyme under forgrenings periode, men det er en stromal-epitelial reversering av ekspresjon under dannelsen og opprettholdelsen av voksen prostata med sterk ekspresjon i enkelte epitel-celler, men ikke stroma .
Rat Spry-1 protein ble påvist i mesenchyme i utviklingen av VP i E17.5 og E19.5 UGTs (fig. S3A, B). Ved perinatal stadium P0.5 (fig. S3C), Spry-1 påvisning var sterkest i mesenchyme tilstøtende til epiteliale kanaler og mindre intens i mesenchymale celler mellom kanaler, og det ble lokalisert i tilknytning til kjernen i stedet for å bli fordelt i cytoplasma (fig. S3F). Mønstrene for Spry-en oppdagelse via WISH og IHC var sammenlignbare i P0.5 UGTs (Fig. S3C).
Det var svak påvisning av Spry-en innen prostata epitelceller kanaler på P0.5 og var mer uttalt på P6.5, mens mesenchymale Spry-1 uttrykk forble uendret (fig. S3D). I kontrast, prostata lapper på dag 28 og voksen VP viste en reversering av Spry-1 uttrykk sammenlignet med P0.5 UGTs. I den differensierte tilstand, ekspresjon var begrenset i stromale celler, men sterk i epitelet, hvori Spry-1 er fordelt over hele cytoplasmaet av basale og luminal-celler (fig. S3E, F).
Fordelingen av decorin, SPARC, Spry-en og Tsukushi i human foster~~POS=TRUNC prostata
Deretter undersøkte vi protein lokalisering av decorin, SPARC, Spry-en og Tsukushi i human foster prostata. En wk 14 human prostata viser tidlig epitelial spirende, i likhet med rotte perinatal stadium P0.5 [21]; se også fig. 4, to øverste radene). Imidlertid er nøyaktig korrelasjon av utviklingsstadier vanskelig på grunn av anatomiske forskjeller, som gnagere viser sammenkoblet og diskrete lober mens den humane prostata er kompakt uten at organisasjon lobul [21].
human fetal prostata ved svangerskapsuker 14 og 16 og 19 er vist i de to øverste, midterste to og to nederste radene, henholdsvis (hver alderstrinn n = 1 vev). A-S, C-U og E-W rader representerer oversikter (skala bar = 200 um), mens B-T, D-V og F-X radene viser forstørrelser (skala bar = 50 um). Hver kolonne viser farging for ett protein over uttalt utviklings tidsperiode, og innfellinger vise IgG negative kontroller. Bare decorin ekspresjon ble begrenset til mesenchyme, mens SPARC- og TSKU var også mesenchymale med en liten epitelial uttrykk ved wk 19. SPRY-1 viste ekspresjon i mesenchyme og noen epitelial uttrykk med økende alder. Piler angitt eksempler på mesenchymale uttrykk mens pilspisser indikerer epitelial uttrykk. Legend: d. Dorsal, e epitel, ed efferent duct, s stroma, u urinrør, v ventral
decorin uttrykk i humane foster prostata ble begrenset til mesenchymale rommet og var helt fraværende i urothelium og prostata epitel på alle utviklingsstadier (fig. 4A-F). Spesielt decorin uttrykk i ventral glatte muskel områder var ekstremt lav eller fraværende (f.eks fig. 4C, nederst i panelet).
Vi klarte ikke å lokalisere Semaphorin6D i human foster prostata på grunn av dårlig antistoff reaktivitet til menneskelig Sema6D (data ikke vist).
SPARC- ekspresjon viste sterkere farging med økende alder foster og er hovedsakelig uttrykt i mesenchyme (fig. 4G-L). Ved wk14, ekspresjon var tilstøtende til endotelceller, og var også til stede i glatt muskulatur på wk16 (fig. 4K-L). På begge trinn, Epitel var blottet for SPARC uttrykk. Ved wk19, stromal farging var intens og finnes i de fleste mesenchymale celler (fig. 4K-L), inkludert endotelceller kapillære celler, og med svak farging i epitel. Fargingen i det apikale området av epitelceller antyder at SPARC- epiteliale signal kan være ikke-spesifikk (pilspiss i fig. 4L) som prostata sekretoriske proteiner kan ikke-spesifikt binder noen antistoffer.
Spry-1 ble funnet å uttrykkes i begge, epiteliale og mesenkymale kamrene ved alle tre aldersgrupper (fig. 4 M-R). Ved wk14, epiteliale lokalisering var på basalmembranen og på toppen av den apikale siden av luminal epitelceller. Mesenchymale uttrykk var begrenset til små men intense flekker som ble spredt over hele mesenchyme (Fig. 4K-L). Ved wk16, epitelial ekspresjon var fraværende fra den basalmembranen, men fremdeles er til stede ved den apikale overflate mens mesenchymale ekspresjon ble lokalisert til cytoplasmaet til en undergruppe av celler, inkludert endotelceller. Ved wk19, ble epitelial uttrykk jevnt fordelt over basale og luminal cellelag, lokalisert til cytoplasma og celleoverflaten. Mesenchymale ekspresjon ble igjen begrenset til små flekker innen en undergruppe av fibroblastisk og endotelceller.
Tsukushi ble funnet i små subregioner mesenkymale sammenlignet med de tre andre proteiner, og dens utbredelse var minimal i alle tre faser (fig. 4S-X). Det var ikke klart til uttrykk mønster med hensyn til celletype eller område, i stedet ble det funnet i fibroblaster og endotelceller, og ble påvist på den apikale side av enkelte luminale epitel-celler i uke 14, 16 og 19.
decorin, SPARC, Spry-en og Tsukushi viste slående likheter i forhold til mesenchymale lokalisering samt økning i fargeintensitet i både menneskelige og gnager, mellom P0.5 til P6.5 og wk14 til wk19, henholdsvis. Likhetene i proteinfordeling mellom rotte og menneske tyder på at disse molekylene mesenchymally uttrykt og kan spille en viktig rolle i utviklings vekst og fordelingen av prostata.
Uttrykk for decorin er redusert i Prostate Cancer
decorin og Tsukushi demonstrerte de mest mesenchyme spesifikke uttrykk mønstre i utviklingen av rotte og menneske prostata, mens Semaphorin6D, SPARC og Spry-en viste både mesenchymale og epitel uttrykk. Vi bestemte oss for å fokusere på molekyler som viser mesenchyme beskyttet uttrykk og dermed decorin og Tsukushi ble tatt frem for evaluering av uttrykk i prostatakreft og pasient matchet kontroller.
Tissue micro arrays (TMA) og prøver av vår egen samling av PCa ble farget for Tsukushi, men ble ikke observert noen forskjell mellom PCa og ikke-ondartet vev (data ikke vist). Deretter undersøkte vi decorin uttrykk.
Representative områder av decorin farging er vist i fig. 5A, B. decorin farging ble scoret av en enkelt blindet etterforsker for omfanget av stromal decorin farging (0 = ingen farging, 1 = ~1-20%, 2 = ~20-50%, 3 = 50% av stromal område). Dessuten ble den mest utbredte intensiteten av fargingen i hvert vev flekk vurdert (uavhengig av det fargede området størrelse) med en ikke-lineær poengsystem 0,1,2,3 der 0 er fravær av farging, og 1, 2, og 3 representerer økende flekken intensitet. Vi antok at fargeintensitet var proporsjonalt med den faktiske mengden av decorin protein. Mellom maligne og ikke-maligne vev, det var ingen forskjell i omfanget av stromal område av decorin uttrykket (Mann-Whitney-test, p = 0,45). Men vi fant en redusert intensitet decorin flekker i maligne områder sammenlignet med ikke-maligne kontrollområder. Totalt analyserte vi 186 vev flekker fra kommersielle TMA og vevssnitt av TURP chips fra 10 pasienter.
PCa vev ble farget via IHC for decorin. A) En representant PCa vev stedet viste mindre intens farging enn B) en representant ikke-ondartet vev spot. Samtidig behandlet prostatavev fra vårt eget vev bank ble brukt med ikke-spesifikk IgG som negativ kontroll C) og anti-decorin antistoff som positiv kontroll (D), noe som viser spesifisiteten av farging. Evalueringen av DAB fargeintensitet for hvert vev plass er vist i E), noe som viser en betydelig lavere scoring på PCa (n = 91) sammenlignet med ikke-maligne kontroller (n = 20) (Mann Whitney test, to-tailed, p 0,0001). Boksene angir 25-75 prosentilene, mens kinnskjegg angir 10-90 prosentiler.
Statistisk analyse med en ikke-parametrisk Mann-Whitney test bekreftet en betydelig reduksjon av intensitet av stromal decorin flekker i maligne områder sammenlignet med ikke-maligne kontrollområder (p = 0,0001, fig. 5E). Resultatene tyder på en nedregulering av decorin ved PCA. Vi neste undersøkt en mulig sammenheng mellom decorin fargeintensitet og Gleason score, men det var ingen tegn til korrelasjon (data ikke vist).
Diskusjoner
molekyler uttrykt i prostata mesenchyme og stroma spiller sentrale roller i utvikling, vev homeostase og sykdommer som kreft. Vi dro ut for å identifisere molekyler som viste mesenchyme spesifikke uttrykk i prostata, og senere de som også viste feilregulert uttrykk i prostatakreft. Utgangspunktet vårt var en utviklings genuttrykk profilering studie fra vår gruppe som ga en liste over 219 molekyler som ble potensielt begrenset til induktiv prostata mesenchyme. Transkripsjon fordeling av flere av disse kandidatene ble undersøkt ved wholemount in situ hybridisering, som fører til identifisering av fem mesenchymally uttrykt molekyler i løpet av prostata utvikling. En av disse molekylene, den antatte tumor suppressor decorin, viste også nedregulering i prostatakreft stroma.
Expression of Mesenchymale Molekyler i Utvikling prostates
Vi har identifisert mesenchymale uttrykk for
decorin, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1 og Tsukushi
i perinatale P0.5 mannlige rotter UGTs via WISH og deres respektive proteinene via IHC. I alle tilfeller var det en meget god korrelasjon mellom WISH-farging og IHC påvisning av molekylene. Fordelingen av decorin protein viste peri-epitelial lokalisering som ikke ble gjen via WISH. Den decorin antistoff ble validert i det humane proteinet Atlas Project (https://www.proteinatlas.org/) som er spesifikt for humant decorin og som det er et utskilt protein, vi spekulere at den sterke farging ved siden av urothelium er et resultat av sekresjon og diffusjon.
decorin, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1 Hotell og
Tsukushi
ble uttrykt i rotte mesenchyme under E17.5 til P0.5. På P6.5 fire molekyler viste mesenchymale-bare uttrykk med bare Spry-en viser uttrykk i både mesenchyme og epitel. Når prostata differensiering var nesten eller helt komplett på P28 og voksen, henholdsvis, var det klare forskjeller mellom gruppene: proteoglykaner decorin og Tsukushi hadde stromal lokalisering, Semaphorin6D fått en svak uttrykk i Epitel men var nesten helt fraværende i stroma, mens Spry -1 og SPARC viste en reversering av mønstre med sterke uttrykk mot epiteliale rommet og nesten fravær i stroma. Fra disse dataene kan vi konkludere med at blant de nåværende undersøkte molekyler to beholde stromal uttrykk i den differensierte prostata og resten enten opphøre stromal uttrykk eller bytte til epitelial uttrykk.
Mesenchymale Expression i Rat and Human Prostata Development
Det er nyere anmeldelser for komparativ anatomi mellom mennesker og gnagere [21] samt sammenligninger av global genekspresjon programmene i prostata utvikling kontra kreft [22]. Men få studier så langt i forhold mesenchymally uttrykte gener og deres proteinprodukter mellom utviklings gnager og menneskelige prostata [23]. I denne studien fant vi at uttrykket av decorin, SPARC, Spry-en og Tsukushi i menneskelig prostata korrelert godt med de respektive utviklingsstadier hos rotte prostata, noe som tyder på at rotta er en passende modell for studiet av menneskelige prostata utvikling.
En rolle for decorin i prostata Development and Cancer
Flere funksjoner er beskrevet tidligere for decorin i utvikling.
