Abstract
Mål
Svinger og aktivator av transkripsjon-3 (STAT3) spiller en viktig rolle i tumorcelle invasjon og metastasering. Hensikten med denne studien var å undersøke effekten av STAT3 knockdown i nakne mus xenografter av kreft i bukspyttkjertelen celler og underliggende genuttrykk.
Metoder
En STAT3 shRNA lentiviral vektor ble konstruert og infiserte inn SW1990 celler. QRT-PCR og western immunoblot ble utført for å påvise genuttrykk. Nakne mus xenograft-analyser ble brukt for å vurdere endringer i fenotyper av disse stabile celler in vivo. HE farging ble brukt til å evaluere svulst celle invasjon og immunhistokjemi ble utført for å analysere genuttrykk.
Resultater
STAT3 shRNA hell forstummet uttrykk for STAT3 mRNA og protein i SW1990 celler sammenlignet med kontrollceller. Veksthastigheten til STAT3-stilnet tumorceller i nakne mus var signifikant redusert sammenlignet med i kontroll vektor tumorer og parentale celler-genererte tumorer. Tumorinvasjon inn i beholderen og muskelen ble også undertrykkes i de STAT3-stilnet tumorer sammenlignet med kontroller. Kollagen IV uttrykk var fullstendig og kontinuerlig omgir svulster Stat3-forstummet SW1990 celler, mens kollagen IV uttrykk var ufullstendig og usammenhengende rundt kontroll svulster. Videre microvessel tetthet var betydelig lavere i Stat3-forstummet svulster enn foreldre eller kontroll svulster SW1990 celler. I tillegg ble MMP-7 ekspresjon redusert i STAT3-stilnet tumorer sammenlignet med foreldre SW1990 xenografts og kontroller. I motsetning til dette, ble ekspresjon av IL-1β og IgT7α ikke endret.
Konklusjon
Disse data viser tydelig at STAT3 spiller en viktig rolle i reguleringen av tumorvekst, invasjon, og angiogenese, noe som kunne være handling ved å redusere MMP-7 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang T, Cao J et al. (2011) STAT3 knockdown Reduserer Bukspyttkjertelkreft Cell Invasivitet og matriksmetalloproteinase-7 Expression i nakne mus. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10,1371 /journal.pone.0025941
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: Mai 20, 2011; Godkjent: 13 september 2011; Publisert: 03.10.2011
Copyright: © 2011 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (nr 09QA1404600) tildelt av fond for vitenskapelig forskning of Science and Technology Commission av Shanghai kommune. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom, og er den fjerde vanligste årsaken til kreft-relaterte dødsfall i vestlige land [1]. De fleste nyere data anslått at 43,140 nye tilfeller ble diagnostisert i 2010, med ca 36 800 tilknyttede dødsfall i USA [2]. Selv om kirurgisk reseksjon gir en potensiell kur, er kreft i bukspyttkjertelen ofte diagnostisert på avanserte stadier på grunn av mangel av symptomer eller uspesifikke symptomer, slik operasjon umulig. Palliativ kjemoterapi kan forbedre livskvaliteten og kan påvirke overlevelse. Disse har ført til en svært sturen prognose for kreft i bukspyttkjertelen pasienter, dvs., er median overlevelse ca 3 til 6 måneder og 5-års overlevelse er mindre enn 5%. Risikofaktorer for kreft i bukspyttkjertelen er røyking, alkoholforbruk, dietter høy i rødt kjøtt, men lavt i grønnsaker og frukt, kronisk pankreatitt, og familiens historie. Imidlertid har de molekylære mekanismene som er ansvarlig for kreft i bukspyttkjertelen utvikling ikke er klarlagt, og det er ingen fastsatt retningslinjer for bukspyttkjertelkreftforebygging. Derfor tilnærminger roman å diagnostisere kreft i bukspyttkjertelen tidlig for å sikre effektiv behandling er drastisk nødvendig.
Signalet svinger og aktivator av transkripsjon (STAT3) genet er medlem av STAT protein familie av transkripsjonsfaktorer. Som respons på cytokiner og vekstfaktorer, er STAT familiemedlemmer fosforylert av reseptor-assosiert kinaser, som danner homo- eller heterodimerer og translocating i kjernen av celler til å binde til DNA og regulere ekspresjonen av målgener. STAT3 aktiveres via fosforylering av tyrosin 705 og serin 727 i respons til forskjellige cytokiner og vekstfaktorer (for eksempel interferon, EGF, og interleukiner). STAT3 spiller en viktig rolle i å mediere forskjellige cellulære prosesser (for eksempel cellevekst, apoptose, differensiering og) [3]. Tidligere studier har vist at det onkogene STAT-3-protein ble konstitutivt aktivert i mange humane cancere [4] – [6]. I motsetning til inhibering av STAT-3-signalveien trykkes kreftcelle invasjon i forskjellige cancere [7] – [9]. I kreft i bukspyttkjertelen, aktivering av STAT-3 forfremmet tumorcellevekst, invasjon og metastasering, noe som fører til dårlig pasient overlevelse. Molekylært kan STAT3 regulere ekspresjonen av VEGF og MMP-2 genene [10] – [11]. Disse to gener, sammen med MMP-7, MMP-9, bFGF, IL-1β og IgT7αα er nært relatert til tumorprogresjon (angiogenese, invasjon og metastase) [12] – [14]. I denne studien, benyttet vi den STAT3 shRNA lentivirus til taushet STAT3 uttrykk. Forrige data fra vår gruppe tyder på at knockdown av STAT3 hemmet invasjon av bukspyttkjertelkreft SW1990 celler
in vitro Hotell og markert redusert VEGF og MMP-2 uttrykk [7]. I denne studien undersøkte vi om lyddemping av STAT3 i kreft i bukspyttkjertelen celler modulerer tumorcellevekst og invasivitet i nakne mus xenografter og bestemt de underliggende signalmekanismer involvert ved hjelp av et cDNA microarray.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og lentivirusinfeksjon
human bukspyttkjertelkreft cellelinje SW1990 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO
2 og 95% luft-inkubator. Til taushet STAT3 uttrykk, bygget vi en lentiviral vektor som bærer STAT3 shRNA som beskrevet tidligere [7]. SW1990-celler (1 x 10
5) ble sådd i hver brønn, og dyrket i 6-brønns plater og deretter infisert med en negativ kontroll lentiviral vektor (Genechem, Shanghai) eller den lentiviral vektor som bærer STAT3 shRNA ved et flertall infeksjon (MOI) av 40. Etter tre dager ble cellene utsatt for
vivo
invasjon analysen.
Kvantitativ sanntid revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA ble isolert fra foreldre SW1990 og negative kontroll vektor eller Stat3 vektor smittet SW1990 celler ved hjelp Trizol reagens fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA ble deretter renset ved hjelp av en RNeasy mini kit i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen, Valencia, CA, USA). Etter kvantifisering, ble 1 pg av total RNA fra hver prøve underkastet første-tråd cDNA-syntese ved hjelp av en PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc, Shiga, Japan) ved 37 ° C i 15 min og 85 ° C i 5 s.
qPCR ble deretter utført for å påvise genekspresjon med disse nylig syntetiserte cDNA. De spesifikke primere for PCR-reaksjonen var som følger: MMP-9, 5′-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 «(fremover) og 5′-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3′ (revers) med et produkt størrelse på 118 bp; MMP-7, 5»-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 «(fremover) og 5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3′ (revers) med et produkt størrelse på 169 bp; IL1-β, 5»-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3 «(fremover) og 5′-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3′ (revers) med et produkt størrelse på 239 bp; bFGF, 5»-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3 «(fremover) og 5′-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3′ (revers) med et produkt størrelse på 224 bp; IgTα7, 5»-GCGGCCACTCGGTCTGTGTGGAC-3 «(fremover) og 5′-GGAGACTGTAGGACAAGGTCAC-3′ (revers) med et produkt størrelse på 303 bp; p-aktin-5»-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 «(fremover) og 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3» (revers) med et produkt størrelse på 294 bp. qPCR presiseringer ble utført ved hjelp av DNA Engine Opticon System (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) med SYBR Premiks Ex Taq (Takara). Spesifikt ble 1 ul revers transkripsjonsreaksjonsblanding anvendt for en kvantitativ PCR-reaksjon i et totalvolum på 20 ul. PCR-sykluser som var 95 ° C i 30 s etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. Disse data ble deretter analysert i henhold til sammenlignings Ct fremgangsmåte og normalisert til p-aktin-ekspresjonsnivåer i hver prøve. Relative uttrykk nivåer av målgener, etter normalisering til en endogen sekvens, ble gitt av to
-ΔΔ
Ct
.
Vi har også utført PCR array-eksperimenter i en RT
2 Profiler Menneskelig metastase PCR Array (PAH-028A) fra SuperArray Biovitenskap (Frederick, MD, USA). Denne matrise inneholder 89 gener og fem «husholdningsgener» i en 96-brønns plate. Vi utnyttet dette array å oppdage knockdown av STAT3-mediert genuttrykk i henhold til produsentens protokoll. Hver reaksjon inkludert 40 ng av total RNA og de riktige negative kontroller (ingen revers transkripsjon og ingen mal). Prøvene ble analysert i tre eksemplarer, og dataene ble normalisert til GAPDH nivåer ved hjelp av ΔΔCt metoden.
Protein utvinning og Western immunoblot
Celler ble lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kina) inneholdende 1 mmol /l fenylmetansulfonylfluorid på is i 15 min. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en BCA proteinanalysesett (Beyotime). Lysatene ble deretter blandet med SDS-PAGE-prøveladningsbuffer og kokt i 5 minutter. 30 ug totalt, cellulært protein ble deretter løst på 8% eller 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble deretter beiset med 0,5% Ponceau S inneholdende 1% eddiksyre for å vurdere for lik belastning og overføringseffektivitet. Membranene ble deretter blokkert i 5% bovint skummet melk over natten og med det primære antistoff i 4 timer ved romtemperatur. Etter vasking i fosfatbufret saltvann (PBS), ble membranene inkubert ytterligere med et peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. For å detektere positive proteinbånd ble forsterket kjemiluminescens reagens fra Millipore (Billerica, MA, USA) benyttet. De primære antistoffene var som følger: MMP-7 fra R og β-aktin fra Biomart (Shanghai, Kina) ved en fortynning på 1:1000. Sekundære antistoffer inkludert peroksidasekonjugert affinipure geit anti-mus eller anti-kanin IgG fra Jackson Immunoresearch (West Baltimore Pike West Grove, PA, USA).
Nude museforsøk
Seks uker gamle SPF grade BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Disse mus ble foret med en standard gnagerdiett og vann
ad libitum
i en aseptisk laminær strømning med 60% -70% fuktighet ved 25 ° C. To uker etter ankomst, 50 pl celle oppløsninger (inneholdende 2 x 10
6 logaritmiske vekstfase-tumorceller) ble injisert inn i neglen pute av mus subkutant. Musene ble deretter observert daglig for diett forbruk, avføring og mentale tilstand, og den tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt hver fem dager. Lengden og bredden av svulsten ble målt med Vernier calipers, og beregnes ved hjelp av en formel av tumorvolum = lengde x bredde
2 x 0,5. Bruk av dyr i denne studien kompilerer med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Denne studien ble godkjent av Science and Technology Commission av Shanghai kommune (License # SYXK2009-0086).
Immunocytochemistry og immunhistokjemi
Kreftceller dyrket på dekkglass ble vasket med PBS i tre eksemplarer og festes med 4% formaldehyd. Endogen peroksidaseaktivitet fra cellene ble blokkert med 3% hydrogenperoksyd. Objektglassene ble deretter inkubert med 1% bovint serumalbumin i PBS i 1 time ved værelsestemperatur og med primært antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med et sekundært antistoff i 30 min. Glassene ble deretter kontra med haematoxylin løsning.
For immunhistokjemisk farging, ble 4 mikrometer seksjoner kuttet fra formalinfiksert parafin-embedded tissue blokker og deretter deparaffinized i xylen og rehydrert i påfølgende vasker av etanol. Seksjonene ble deretter varmet i en mikrobølgeovn ved middels kraft i 8 min i citratbuffer, pH 6,0 for varme-induserte epitop henting. Seksjonene ble utsatt for blokade av endogen peroksydase-aktivitet og ikke-spesifikk binding av det primære antistoff og deretter målretter proteinet lokalisering med det første antistoffet og visualisering med det sekundære antistoff og farvereaksjonen som beskrevet ovenfor.
De primære antistoffene følger: MMP-7 fra R kollagen IV eller PECAM-en fra BioWorld Technology (Louis Park, MN, USA) ved en fortynning på 1:100. De sekundære antistoffer ble geite-anti-mus eller anti-kanin-IgG konjugert med peroksidase fra DAKO EnVision (DAKO Corp., Carpinteria, CA).
Farget tumorceller og parafinsnitt ble gjennomgått og avsluttet ved hjelp av et lysmikroskop ved en patolog blindet for behandlingsgruppen. Positivitet av de fargede tumorceller på dekkglass og parafinsnitt ble definert ved farging intensitet og% av tumorceller: den fargeintensitet av MMP-7-ekspresjon ble klassifisert semikvantitativt til negativ og svak, moderat og sterk positiv (0, +, ++ , og +++, henholdsvis). I vår studie ble genekspresjon positiv hvis fargeintensitet var moderat eller sterk og andelen positive fargede celler var 20%. Men tettheten av microvessels flekker positivt for PECAM-en ble definert som positiv på 400 kraften i et mikroskop felt som beskrevet tidligere [15].
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 12,0 programvare (SPSS, Chicago, IL, USA). Dataene ble oppsummert som gjennomsnitt ± SD når det er mulig og analysert ved hjelp av en Student-Newman-Keuls test for å fastslå statistisk signifikans. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
knockdown av STAT3 uttrykk ved hjelp STAT3 shRNA
For å demonstrere hvilken rolle STAT3 i kreft i bukspyttkjertelen, vi utførte genet knockdown eksperimenter bruker. STAT3 shRNA i SW1990 celler. Vi fastslått at STAT3 shRNA hell slått ned STAT3 uttrykk i SW1990 celler, dvs. QRT-PCR data viste at STAT3 shRNA vektor hemmet STAT3 mRNA uttrykk sammenlignet med kontroll vektorer (
P
= 0,004), mens vestlige immunoblottingforsøk data viste den STAT3 protein ble markert hemmet i STAT3 shRNA-transfekterte SW1990 celler (
P
= 0,003) (figur 1).
A, QRT-PCR. Stabile STAT3 shRNA og kontroll vektor-transfektert SW1990 celler og foreldre SW1990 celler ble dyrket og RNA ble isolert for QRT-PCR analyse av STAT3 mRNA uttrykk *
P
0,01 i forhold til SW1990 eller kontrollvektor transfekterte celler. B, Western immunoblot. Disse cellene ble dyrket for total cellulær protein utvinning og western immunoblot analyser av STAT3 protein uttrykk.
bekjempelse av vekst og invasjon av STAT3 shRNA-transfekterte SW1990 celler i nakne mus
Vi injisert stabile STAT3 knockdown eller kontrollceller inn spikeren pute av nakne mus. 10 dager etter tumorinokulasjon, fant vi at veksten i de Stat3-forstummet tumorceller ble betydelig redusert (figur 2). Vi fant også at uttrykket av kollagen IV protein rundt kreftceller i kontroll svulster var ufullstendig og usammenhengende, mens det var fullstendig og kontinuerlig i svulster i Stat3-forstummet SW1990 celler følgende immunhistokjemisk farging (figur 3A B). Tumorcelle invasjon evne ble oppdaget på HE-farget vev xenografter av lysmikroskop. Videre, tumor invasjon inn i beholderen og muskelen var hyppigere hos kontroll tumorer enn STAT3-stilnet tumorer (figur 4). Prosentandelen av fartøyet og muskel invasjon av STAT3-stilnet tumorer var 22,22% (2/9) og 33,33% (3/9) sammenlignet med 60% (6/10) 80% (7/10) og 70% (7 /10), 80% (8/10) i SW1990 tumor og negative kontrolltumor, respektivt. Microvessel Tettheten var signifikant lavere i Stat3-forstummet svulster enn foreldre eller kontroll svulster SW1990 celler (
P
= 0,007 og
P
= 0,021, henholdsvis figur 5). Disse dataene indikerer at STAT3 spiller en avgjørende rolle i reguleringen av tumorvekst, invasjon, og angiogenese.
Foreldre eller kontroll vektor og STAT3 shRNA-transfekterte SW1990 celler ble dyrket i cellekultur og injisert inn i nakne mus spiker pads . Tumor volum ble målt hver fem dager opp til 30 dager etter tumorcelle inokulasjon .. *
P
. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen vektor eller foreldre svulster
tumorxenotransplantater fra kontroll vektor og STAT3 shRNA-transfekterte celler ble utsatt for immunhistokjemisk farging av kollagen IV protein. Disse dataene antyder at kollagen IV uttrykk (rød pil) er fullført og kontinuerlig i STAT-3-forstummet tumor (A), men integriteten av kollagen IV ble ødelagt dokumentert av ufullstendig og usammenhengende (rød pil) farging (B). × 400 forstørrelse.
Disse nakne mus xenotransplantater ble tatt fra vev bearbeidet for HE farging. A og B, x 400 forstørrelse, C og D, x 100 forstørrelse. Tumorcelle invasjon inn i microvessel er hyppig i kontrollvektor svulster (markert med rød pil i A), men ikke opplagt i Stat3-forstummet svulster (B). Den muskelen ble invadert og ødelagt (svart pil) av tumorceller (rød pil) av SW1990 celler i C, men grensen er klart mellom muskel (svart pil) og tumor (rød pil) i D.
Vevssnitt av nakne mus xenotransplantater ble farget for immunhistokjemi med anti-PECAM-1-antistoff. PECAM-1-positive mikrokar i tumorer ble tellet under et mikroskop og sammenfattet. Antallet microvessel var 13,00 ± 2,36 per høy effekt felt (N = 9) i Stat3-forstummet svulster sammenlignet med 16,30 ± 2,45 (N = 10) i foreldre SW1990 svulster og 15,80 ± 2,57 (N = 10) i vektorkontroll svulster . Disse forskjellene var statistisk signifikante. * P 0,01 vs. foreldre SW1990 svulster, ** P . 0,05 vs. kontrollvektor svulster
Uttrykk for svulst invasjon og metastase gener følgende STAT3 knockdown
Vi er fast bestemt gen uttrykk i disse Stat3-knocking down svulster ved hjelp av et menneske metastase PCR array (# PAHS-028A) fra SuperArray Bioscience. PCR-array-data antyder at tre gener, det vil si, MMP-7, IL-1β og IgT7α, ble nedregulert (reduksjon av 2,54-fold, 23,90-fold, og 5,39 ganger, henholdsvis) i STAT3-stilnet tumorer sammenlignet med kontrollen og foreldre SW1990 svulster. Imidlertid ble åtte gener oppregulert,: SYK (3,38 folder), MYCL1 (4.85 folder), MMP-11 (4.59 folder), MMP-3 (10.88 folder), MMP-10 (19.93 folder), CST-7 (3,34 folder ), CDH11 (2.01 folder) og IL-8Rβ (7.06 folder).
Redusert MMP7 mRNA og protein uttrykk i Stat3-forstummet svulster
Vi validert data fra tabellen eksperimenter og utført tilleggs analyser ved hjelp QRT-PCR (fig 6A . S1) og vestlig immunoblotting (figur 6B) og fant at MMP-7, ble MMP-9 mRNA uttrykk betydelig redusert i Stat3-forstummet svulster i forhold til foreldre og kontroll svulster (
P
= 0,033 og
P
= 0,002
vs.
SW1990, henholdsvis eller
P
= 0,0001 og
P
= 0,011
vs
kontroll svulster, henholdsvis). IL-1β mRNA ekspresjon ble også betydelig redusert i Stat3-forstummet svulster i forhold til foreldre og kontroll svulster (
P
= 0,01 og P = 0,0001
vs.
SW1990 og kontroll svulster, henholdsvis). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i bFGF eller IgT7α mRNA-ekspresjon mellom de STAT3-stilnet tumorer eller kontrollene (fig. 6A). MMP-7 ekspresjon på proteinnivået ble markert undertrykket i STAT3-stilnet tumorer, men MMP-9 ble ikke signifikant påvirket (figur 6B).
A, QRT-PCR. RNA ble isolert fra tumorxenografter og underkastet QRT-PCR-analyser. B, Western blot. Totalt cellulært protein ekstrahert fra det nakne mus xenotransplantater og utsatt for Western blot analyser. **
P
0,01; *
P
. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen vektor eller foreldre svulster, henholdsvis
Redusert MMP-7 uttrykk i Stat3-Silenced tumorceller og transplantater
For å bekrefte dataene ovenfor, utførte vi immunocytochemistry på Stat3 knockdown celler og nakne mus xenografter. Våre data antyder at STAT3-stilnet SW1990 celler eller xenografter uttrykte lavere nivåer av MMP-7-proteinet i cytoplasma i forhold til foreldre og kontrollcellene og xenotransplantater (figur 7), noe som er konsistent med invasjon beherskelse i nakne mus xenotransplantater. Disse data indikerer at STAT3 regulering av invasjon kapasitet i kreft i bukspyttkjertelen celler er assosiert med nedregulering av MMP-7 uttrykk.
Tumorceller fra foreldre, vektorkontroll og STAT3-stilnet SW1990-celler ble dyrket i et monolag eller i nakne mus. Monolagcellene og tumorxenografter ble deretter utsatt for immunocytokjemi og immunhistokjemi farging av MMP-7-proteinet. A, foreldre celler; B, Stat3-forstummet celler; C, foreldre svulster; D, Stat3-silecnced svulster. X 400 forstørrelse. Rød pil, tumorceller.
Diskusjoner
STAT3 shRNA hell slått ned uttrykk for STAT3 mRNA og protein i SW1990 celler i forhold til å kontrollere vektor transfektert SW1990 celler. Vi deretter injisert subkutant styrevektor og STAT3 shRNA-transfekterte celler SW1990 inn i nakne mus. Våre data antyder at veksthastigheten til STAT3-stilnet tumorceller i nakne mus var signifikant redusert i forhold til kontroll vektor celler. Tumorinvasjon i beholderen og muskel var mer sjeldne i Stat3-forstummet svulster enn i kontroll svulster. Uttrykk av kollagen IV protein rundt kreftceller var fullstendig og kontinuerlig i svulster i Stat3-forstummet SW1990 celler, mens kollagen IV uttrykk var ufullstendig og usammenhengende innenfor kontroll svulster. Videre microvessel tetthet var betydelig lavere i Stat3-forstummet svulster enn foreldre og kontroll svulster SW1990 celler. På molekylært nivå, ble MMP-7 ekspresjon redusert i STAT3-stilnet tumorer sammenlignet med kontroll og sperre SW1990 xenotransplantater. Data fra denne studien viser tydelig at STAT3 spiller en avgjørende rolle i reguleringen av tumorvekst, invasjon, og angiogenese.
Men vi fant ikke signifikante endringer i MMP-9 protein uttrykk, selv om uttrykket av MMP9 mRNA ble redusert. Årsaken til denne uoverensstemmelse kan skyldes vevsinhibitor av metallproteinaser 1 (TIMP-1) reduseres når STAT3 lyddemping ført til aktivert MMP-9 øker, noe som reduserte ekspresjon av MMP9 mRNA gjennom negativ tilbake [16], [17]. Videre vår nåværende data antyder også noen avvik mellom PCR matrise og QRT-PCR data. Faktisk er PCR rekke en ny teknikk for å undersøke differensial uttrykk for målgener på mRNA-nivå med høy gjennomstrømning, sensitivitet og spesifisitet. Men disse dataene må alltid bekreftes ved hjelp QRT-PCR, noen som kan verifiseres (bekreftet) ved hjelp av qPCR. Av denne grunn kan være på grunn av konstruksjons av primeren, og vanskeligheten med å kontrollere glødetemperaturen som fører til ikke-spesifikke amplifikasjoner i PCR-array. Dermed kunne QRT-PCR data være mer konkret og pålitelig. Selv om vi har vist noen gener som ble oppregulert etter å kneble av STAT3 uttrykk, ønsker vi å understreke de gener som ble nedregulert følgende STAT3 stillhet i denne studien.
STAT3 er en nøkkel transkripsjonsfaktor som er onkogene i menneskelig -celler [18], [19]. Janus kinase (JAK) /STAT3 signalisering spiller en viktig rolle i regulering av cellevekst og differensiering og tumorinvasjon og metastase i forskjellige humane cancere [20] – [22]. I kreft i bukspyttkjertelen, har nyere studier vist upassende og konstitutiv aktivering av STAT3 [23], [24]. I en tidligere studie av vår gruppe, rapporterte vi nedregulering av STAT3 uttrykk trykkes invasjon kapasitet på kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro product: [7]. I denne studien fant vi at kneble av STAT3 uttrykk undertrykte tumorvekst og invasjon og microvessel tetthet i nakne mus. Disse dataene er konsistent med en tidligere
ex vivo
studie [25] hvor forfatterne viste at uttrykket av fosforylert STAT3 i menneskets magekreft signifikant korrelert med tumorinvasjon og prognose
ex vivo
.
Tidligere undersøkelser av andre, og vi har vist at STAT3-microvessel øket densitet kan skyldes STAT3 induksjon av VEGF-ekspresjon [7], [26]. En annen studie også gitt bevis for at undertrykkelse av invasjon og metastasering av STAT3 knockdown avhengig av VEGF nedregulering av tykktarmskreftceller [27]. Videre redusert uttrykk av MMP-2 er en viktig årsak til undertrykkelse av tumorcelle invasjon og metastase følgende stanse av STAT-tre uttrykk i menneskelig melanom [5]. MMP’er spiller viktige roller i tumorcelleinvasjon og metastase ved nedbrytning av komponenter i basalmembraner og ekstracellulær matriks [28] – [30]. Et økende antall studier indikerer at visse MMP proteiner er målrettet av STAT3 [31], [32]. Xie et al fastslått at STAT3 aktivering fremmet invasjon av melanomceller gjennom regulering av MMP-2 gentranskripsjon [33]. I tillegg ble MMP-1 og MMP-9 funnet å være regulert av STAT3, som spiller en avgjørende rolle i tumorinvasjon og metastase [34], [35]. I denne studien, viste vi at knockdown av STAT3 uttrykk redusert MMP-7 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler og nude mus xenografter. MMP-7 er den minste proteinet i MMP-familien, men har den høyeste ekstracellulære matriks (ECM) -degradative aktivitet mot en rekke ECM komponenter; således, er den i stand til å utløse aktivering av en MMP kaskade og er knyttet tett til tumorinvasjon og metastase [36] – [39]. I kreft i bukspyttkjertelen, har MMP-7 blitt vist å være involvert i tumorcelle dissosiasjon fra det opprinnelige området og senere få invasjon kapasitet [40], [41]. Andre studier har antydet at MMP-7 kan være en direkte mål for STAT3 i mage og bryst kreft celler [42], [43], som er konsistent med vår konklusjon i kreft i bukspyttkjertelen celler.
I denne studien , vi utnyttet naken mus spikermatte modell i stedet for den rutinemessige naken mus flanke modell av tumorceller. Fordelen med spiker pute-modellen er at denne modellen tester ikke bare invasjonen muligheten av tumorceller inn i beholderen og muskelen, men også en viss metode for lyske lymfeknuter metastaser av tumorceller. Ikke desto mindre er det ortotopisk tumormodell den beste for å detektere invasjon og metastasering evne til tumorceller. I kreft i bukspyttkjertelen, vi møtte flere problemer, blant annet teknikk for å injisere kreftceller i bukspyttkjertelen, kirurgi indusere høy dødelighet, og usikkerheten i tumorinvasjon og metastaser (forskjellige fra de primære svulster i bukspyttkjertelen). I denne sammenheng, er enkel og pålitelig i naken mus spikermatte modell. Disse aktuelle data antyder at STAT3 knockdown signifikant endret invasjon evnen som kreft i bukspyttkjertelen celler, uten noen metastatiske svulster i lymfenodene i både eksperimentelle og kontrollgrupper. Dette kan være på grunn av den tidsperioden av forsøkene (30 dager). Denne studien viste også effekten av STAT3 knockdown på kreft i bukspyttkjertelen celler
in vivo
, som bekreftet våre tidligere
in vitro
data som STAT3 spiller en viktig rolle i å fremme tumorvekst, invasjon, og angiogenese , mens undertrykkelse av STAT3 uttrykk gjorde inhibere kreft i bukspyttkjertelen celle vekst, angiogenese, og invasjon. Disse funksjoner av STAT3 kan opptre gjennom regulering av nedstrømsgener, inkludert cyclinD1, Bcl-2, VEGF, og MMP-2, som alle ble nevnt i tidligere studier [26], [44], [45]. I vår studie fant vi at STAT3 hemming kan redusere MMP-7 uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler. Fremtidige studier bør fokusere på om å stanse all STAT3 uttrykk ved hjelp STAT3 shRNA eller dens inhibitor som ikke-reseptor tyrosin kinase er nyttig som en roman adjuvant behandling med kjemoterapi for kreft i bukspyttkjertelen pasienter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1 .
QRT-PCR-analyse av Syk, MYCL1, MMP-11, MMP-3, MMP-10, CST-7, CDH11, og IL-8Rβ ekspresjon i nakne mus xenotransplantater. RNA ble isolert fra mus tumorxenografter og underkastet QRT-PCR-analyse. Dataene viste at ekspresjon av MYCL1, MMP-3, MMP-10 og IL-8Rβ ble regulert opp, men SYK ble nedregulert i STAT3 stillhet tumor sammenlignet med kontrollen vektoren eller sperre tumorer. I motsetning til ekspresjonen av CST-7, CDH11, MMP-11 mRNA var ingen forskjell i hver tumorprøve
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025941.s001 plakater (TIF)
