Abstract
Gynura procumbens plakater (Lour.) Merr. tilhører Asteraceae familien. Anlegget er et velkjent tradisjonell urt i Sørøst-Asia, og det er mye brukt til å behandle betennelse, nyre ubehag, høyt kolesterolnivå, diabetes, kreft og høyt blodtrykk. Vår tidligere studie viste tilstedeværelse av verdifulle planteforsvars proteiner, slik som peroksydase, thaumatin-lignende proteiner og miraculin i blad av
G. procumbens
. Imidlertid har effekten av disse forsvars proteiner på kreft aldri blitt fastslått tidligere. I denne studien undersøkte vi bioaktivitet av gelfiltrering fraksjonert proteiner av
G. procumbens
blad ekstrakt. Den aktive proteinfraksjon, SN-F11 /12, ble funnet å hemme veksten av en brystkreftcellelinje MDA-MB-231, ved en EC50-verdi på 3,8 ug /ml. De mRNA uttrykk for spredning markører, Ki67 og PCNA, ble betydelig redusert i MDA-MB-23 celler behandlet med SN-F11 /12. Ekspresjonen av invasjonen markør, CCL2, ble også funnet redusert i de behandlede MDA-MB-231-celler. Alle disse funnene markere anti-kreft eiendom SN-F11 /12, derfor proteiner i denne fraksjonen kan være en potensiell kjemoterapeutisk middel for brystkreft behandling
Citation. Hew CS, Khoo BY, Gam LH (2013) The Anti-Cancer Eiendom Proteiner hentet fra
Gynura procumbens plakater (Lour.) Merr. PLoS ONE 8 (7): e68524. doi: 10,1371 /journal.pone.0068524
Redaktør: Natarajan Aravindan, University of Oklahoma Health Sciences Center, USA
mottatt: 6 mars 2013; Godkjent: 29 mai 2013; Publisert: 11.07.2013
Copyright: © 2013 Hew et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av RU bevilgning fra Universiti Sains Malaysia (Prosjektnummer nummer~~POS=HEADCOMP: 1001 /PFARMASI /815034). Forfatterne takker også Institutt for Graduate Studies av Universiti Sains Malaysia for å gi stipend til Hugg Chaw-Sen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange av de tilgjengelige legemidler er plantebasert, og plante peptider og proteiner har vist seg å være en viktig kilde til biologiske forbindelser som viste bioaktivitet som kan utnyttes som narkotika. Blant aktivitetene som blir oppdaget var anti-tumor aktivitet av peptider ekstrahert fra
Hypericum perforatum, Chelidonium majus L
.,
Inula helenium L
.,
Equiseteum arvense L
. og
kreftkjuke product: [1]; anti-HIV tilhører makrosyklisk peptid hentet fra
Palicourea
kondensat [2]; antimikrobiell aktivitet av thaumatin-lignende proteiner ekstrahert fra malting bygg [3] og i ulike typer av plantenes proteiner [4]. Den plantebaserte produkter, inkludert proteiner og små molekylære forbindelser som er blitt foreslått som den gunstige legemidler for kreftbehandling i lys av de mange uønskede bivirkninger som utøves av aktuelle kreftbehandlinger, nemlig kjemoterapi og strålebehandling. Dessuten er disse behandlinger er kostbare, noe som kan være en belastning for pasientene. Planter inneholder forskjellige aktive ingredienser som kan brukes som medisin for behandling av sykdommer så som brystkreft [5]. Brystkreft er den ledende årsak til død på grunn av kreft blant kvinner over hele verden [6]. Selv om strålebehandling og kjemoterapi er vanlige former for behandling som gis til kreftpasienter, effektiv behandling for brystkreft er fortsatt begrenset. I lys av dette, bør betydelig innsats for å streve for effektive agenter fra anlegget tas for å identifisere flere nye agenter for både forebygging og behandling av kreft hos mennesker.
Gynura procumbens plakater (Lour.) Merr . er en velkjent tradisjonell urt i Sørøst-Asia. Anlegget tilhører Asteraceae familien. Dette anlegget er ca 10-25 cm høy, og det er presentert med saftige, elliptiske og blanke lilla blader [7]. Bladene av
G. procumbens
har blitt servert som mat i flere tiår i Malaysia, hvor det er generelt konsumeres rå som salat. Dessuten er anlegget mye brukt for å behandle betennelse, nyre ubehag, høyt kolesterolnivå, diabetisk, kreft og høyt blodtrykk [7], [8]. Faktisk
G. procumbens
brukes tradisjonelt i Sørøst-Asia for sin verdifull medisinsk eiendom. De små molekylære forbindelser hentet fra
G. procumbens
er blitt rapportert å vise anti-kreft [9], anti-oksidanter [10], anti-inflammatorisk [11], anti-hyperglykemiske og anti-hyperlipidemiske [12] aktiviteter. Videre har vi oppdaget at nærværet av verdifulle planteforsvars proteiner, slik som peroksydase, thaumatin-lignende proteiner og miraculin fra blad av
G. procumbens product: [13], [14]. Imidlertid har effekten av proteinekstrakt for kreft aldri blitt fastslått. Derfor ønsket vi å analysere cytotoksiske aktiviteten av proteinene hentet fra bladene av
G. procumbens
ved hjelp av laktatdehydrogenase (LDH) cytotoksisk analyse, og deretter for å bestemme ruten for cytotoksisitet mekanisme gjennom ekspresjon av spredning og invasjonsmarkører i de behandlede MDA-MB-231 celler ved anvendelse av semi-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (PCR). Videre ble det aktive proteiner identifisert ved hjelp av massespektrometrisk analyse. Vi håper at data innhentet vil være nyttig for fremtiden intervensjon av proteinbasert legemiddel for behandling av kreft.
Materialer og Metoder
Plant Materialer
Blader av
G. procumbens
ble samlet inn fra Penang, Malaysia. Ingen spesielle tillatelser var nødvendig for innsamling av bladene og planten er ikke en beskyttet plantearter. En kupong antall prøven (11209) ble deponert på Herbarium av School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia. Friske blader ble vasket to ganger med vann fra springen og skylles med destillert vann.
Protein Extract og rensing
Protein ble hentet av metoden for Kiba
et al. Product: (2003) [15] med små modifikasjoner. Friske blader av
G
.
procumbens product: (1 kg) ble malt til en fin pulverform i flytende nitrogen ved hjelp av blander og blandet med 3 liter av utvinning buffer [10 mM NaH
2PO
4, 15 mM Na
2HPO
4, 100 mM kaliumklorid, 2 mM etylendiamintetraeddiksyre, 2 mM tiourea, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride og 1,5% (w /v) polyvinylpolypyrrolidon]. Blandingen ble homogenisert hver 20 minutter i 2 timer og inkubert ved 4 ° C over natten. Homogenatet ble sentrifugert ved 15 000 rpm, 4 ° C i 30 minutter. Den urene ekstrakt ble holdt ved -20 ° C. To trinn av ammoniumsulfatutfelling ble anvendt, hvor fast ammoniumsulfat ble tilsatt til det rå ekstrakt av
G. procumbens
ved 4 ° C inntil 30% metning ble oppnådd. Bunnfallet ble fjernet ved sentrifugering i 30 minutter ved 13 000 rpm. Deretter ble fast ammoniumsulfat igjen tilsatt til den gjenværende supernatant for å oppnå 70% metning og oppløsningen ble sentrifugert i 30 minutter ved 13 000 rpm, og pelleten ble utvunnet. Pelleten ble deretter resuspendert i avionisert vann inntil fullstendig oppløsning. Den rå ammonium sulfat utfelt proteiner ble lastet til en gelfilterkolonne, HiPrep ™ 16/60 Sephacryl ™ S-100 High Resolution (GE Healthcare) med ÄKTAprime plus protein rensing system. Proteiner ble eluert med 50 mM natriumfosfat, pH 7,2 ved en strømningshastighet 0,5 ml /min i et samlet volum på 180 ml elueringsbuffer, ble eluatet samlet i fraksjoner på 5 ml hver. Konsentrasjonen av protein ble bestemt ved bruk av RC /DC ™ Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories).
SDS-PAGE
natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ble anvendt for å skille de innsamlede proteiner. Hver fraksjon ble blandet med ikke-redusere prøvebuffer [0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 10% (v /v) glycerol, 0,02% (w /v) SDS og 0,1% (w /v) bromfenol blå]. Elektroforese prosessen ble kjørt på en konstant spenning på 200V. Gelen ble farget med Coomassie blå.
LDH Cvtotoksisitetsmålinq
MDA-MB-231 (HTB-26 ™) cellelinjen var en slags gave fra John Hopkins Research Centre, som ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Gibco BRL) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco BRL), 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco BRL ). Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som besto av 5% (v /v) CO
2. Den cytotoksiske aktivitet ble utført ved anvendelse av laktat-dehydrogenase (LDH) cytotoksisitet analysesett (BioVision, USA), LDH er et cytoplasmisk enzym tilstede i alle celler, slik at det vil bli frigjort i dyrkningsmediet når skade på celleplasmamembranen finne sted. LDH-aktiviteten ble bestemt ved en kombinert enzymatisk reaksjon hvor LDH oksyderes laktat til pyruvat, pyruvat dannede deretter omsatt med tetrazoliumsalt INT å danne farmazan. Økningen i mengden av formazan er direkte korrelert til økningen i antallet lyserte celler. Den formazanet fargestoff Intensiteten ble målt ved en ELISA-leser. En total på 1,0 x 10
5-celler /ml MDA-MB-231-celler ble sådd ut i 24-brønners kulturplate som ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære bestående av 5% (v /v) CO
2 til cellevekst oppnådd ca 70% konfluens. Mediet fra hver brønn ble kastet, cellene ble forsiktig vasket med PBS og 2% av vekstmedium (DMEM supplert med 2% (v /v) FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin) ble tilsatt. Cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av ekstraktet (triplo). Ett hundre ul kulturmedium ble trukket tilbake og LDH cytotoksisitet analysen ble utført i henhold til bruksanvisningen gitt. Ett hundre ul av kulturmedium ble overført til et immuno plate og 100 ul reaksjonsblanding (blanding av katalysator og fargeløsning) ble tilsatt til hver brønn. Platen ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Absorbansen av alle prøvene ble målt ved 490 nm og referansebølgelengde var 680 nm. Prosentandelen av cytotoksisitet ble beregnet som [(testprøve – lav kontroll) /(høy kontroll – lav kontroll)] x 100, hvor lav kontrollen er absorbansen til dyrkningsmediet uten tilsetning av noen ekstrakt og høy kontrollen er absorbansen til dyrkningsmediet hvor ble cellene behandlet med 1% (v /v) Triton X-100 for å frigi 100% LDH.
Polymerase Chain Reaction (PCR) Analyse
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved bruk av RNeasy Mini Kits (Qiagen, USA). Den totale RNA ekstrahert ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Uttrykk for to proliferative markører, Ki-67 og PCNA, og to invasjons markører, CCL2 og IL6, ble undersøkt i behandlede og un-behandlet MDA-MB-231 celler ved hjelp av PCR og gel densitometry. Nivåene av mRNA ble uttrykt som bandet intensiteten av markører av PCR-produkter i forhold til kontroll beta-aktin PCR-produkt. Primerne anvendt for PCR-reaksjonene var som følger: antigen Ki-67, Forward: 5′-AACTATCCTCGTCTGTCCCAACAC-3 «, omvendt: 5′-CGGCCATTGGAAAGACAGAT-3′; prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), Forward: 5»-AGAAGGTGTTGGAGGCACTCA-3 «, Omvendt: 5′-GGTTTACACCGCTGGAGCTAA-3»; chemokine (c-c motiv) ligand 2 (CCL2), Forward: 5’GCTGTGATCTTCAAGACCATTGTG-3 «, Omvendt: 5′-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3′; interleukin 6 (IL6), Forward: 5»-CCAGTACCCCCAGGAGAAGATT-3 «, Omvendt: 5′-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3′; beta aktin, Forward: 5»-CATTGCCGACAGGATGCA-3 «, Omvendt: 5′-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3». PCR-reaksjoner besto av 5 pl av cDNA (5 ng), 12,5 mL av Master Mix, 1 ul av hver 20 pmol forover og revers primere og DNase /RNase-fritt vann til et sluttvolum på 25 ul. Reaksjonene ble satt i 30 sykluser med følgende betingelser; pre-amplifisering: 94 ° C i 10 minutter, denaturering: 94 ° C i 20 s, annealing: 55 ° C i 20 s, forlengelse: 72 ° C i 30 s, avslutning: 72 ° C i 10 min. Hver PCR-reaksjon ble utført i triplikat og PCR-produktene ble underkastet elektroforese på 2% (w /v) agarosegel inneholdende 0,1 ug /ml EtBr. Band av PCR produktet på gelen ble tatt ved hjelp av Gene Genius Bilde Analyser og bandet intensiteten ble analysert ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad, USA).
I-gel Fordøyelse
I -gel fordøyelse ble utført ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av [16]. Proteinbånd ble skåret ut fra SDS-PAGE. Gelstykkene ble vasket med 100 mM ammoniumbikarbonat i 10 minutter og deretter med acetonitril (ACN) i 5 minutter. Dette trinn ble gjentatt to ganger. Gelbitene ble deretter tørket i en speed-vakuumsentrifuge. De tørkede gelbitene ble tilsatt med 10 mM DTT i 100 mM ammoniumbikarbonat og inkubert i 1 time ved 56 ° C. Overdreven oppløsning ble fjernet. Gelstykkene ble så inkubert med 55 mM jodeddiksyre i 100 mM ammoniumbikarbonat i mørke i 45 min ved romtemperatur. Gelstykkene ble vasket med 100 mM ammoniumbikarbonat i 10 minutter og deretter med acetonitril (ACN) i 5 minutter to ganger. Gelstykkene ble behandlet med 15 ng /mL av trypsin i fordøyelsen-buffer [50 mM ammoniumbikarbonat, 5 mM CaCl
2] og inkubert ved 37 ° C over natten. Supernatanten fra den tryptiske spaltningen ble oppsamlet, og de gjenværende peptider ble ekstrahert 3 ganger i 5% (v /v) maursyre i 30:70 av ddH2O: ACN. Supernatantene ble slått sammen og blåse tørket ved hjelp av nitrogengass.
Reverse Phase Kapillær kromatografi og massespektrometri
Revers fase kapillar-kromatografi (Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography [UPLC]) koblet med kvadrupol tids of-flight tandem massespektrometri (Waters, Milford, MA, USA) koblet til en LockSpary Exact Mass kalibrator. Ionisering kilde brukte var ESI (elektro myk ionisering). Prøven ble injisert inn i systemet gjennom en autosampler. Prøvene ble injisert i en Trizaic UPLC nanoTile (Waters, Milford, MA, USA) bestod av en felle kolonne og en kapillær kolonne. Proteinet spaltningen var forhånds konsentrert og avsaltet på fangst kolonne patron pakket med 1,8 um High Strength Silica (HSS) partikkel ved en strømningshastighet på 8
μ
l /min 99% A i 3 minutter. Peptidene ble så eluert på en reversfase-kapillærkolonne (1,8 um HSS partikkel, 85 um x 100 mm) ved en gradient på fra 3% B til 40% B i 30 minutter ved en strømningshastighet på 0,45 mL /min. Løsningsmiddel A besto av vann med 0,1% maursyre, og oppløsningsmiddel B besto av acetonitril med 0,1% (v /v) maursyre. Eluatet ble underkastet MS system. Alle massespektra ble anskaffet ved hjelp av Q-TOF massespektrometer. Q-TOF parametere ble satt som følger: positiv modus; kapillær, 3,2 kV; sampling kjegle, 28,0; utvinning kjegle, 2.0; kilde temperatur, 70 ° C; desolvation temperatur, 200 ° C; kjegle gasstrøm, 40,0 l /time; desolvation gasstrøm, 600,0 l /time; skanning, 0,2 s. Spectra ble registrert fra
m /z
2 til 1200. Ekstern kalibrering ble brukt på alle data ved hjelp av [Glu1] -Fibrinopeptide B standard (Waters). Survey scan Kjøpet ble gjort på linje med kapillær kromatografisk separasjon; en første TOF-MS scan ble tatt over massen området 2-1200 m /z hver andre, med koblings kriterier for MS til MS /MS som inkluderte ion intensitet (100 tellinger /s) og ladetilstand (2). MS /MS av forløperion valgt ble ervervet over massen området 50-1600 m /z. Kollisjonsenergien var 6 eV.
Protein Identifikasjon
Database søket ble utført på MS /MS-data generert ved hjelp av hele taksonomi for
Viridiplantae
henhold SwissProt database. Peptid toleranse og fragment masse toleranse ble satt til 0,1 BDA og 2. Da, henholdsvis, og bare en savnet spalting er tillatt. Carbamidomethylated cystein ble satt som løst modifikasjon, mens oksydert metionin ble satt som variabel modifikasjon.
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE) av tre indepent eksperimenter og statistisk analyse var gjøres ved hjelp av Student t-test. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Mild fosfatbuffer ble brukt til å hente ut proteiner fra bladet av
G.. procumbens
for å hindre denaturering av proteinene.
In vitro
bioaktivitet studien indikerte at den frysetørrede råolje blad ekstrakt av
G. procumbens
besatt anti-spredning aktivitet mot brystkreft cellelinjen MDA-MB-231. Derfor, fraksjonering av proteinekstrakt ble utført for å isolere proteinet (r) av interesse. Ammoniumsulfatutfelling ble anvendt som det første trinn i rensingen av proteinene som metoden er ikke-denaturerende for proteiner, er dette saltet utfellingsmetoden forsøkte å fjerne små høymolekylære forbindelser fra ekstrakten [17]. De utfelte proteiner ble så underkastet gelfiltrering, hvor ytterligere separasjon av proteiner i henhold til størrelse ble utført. Eluatet av gelfiltreringskromatografi ble oppsamlet i fraksjoner på 5 ml volum hver. Alle fraksjonene ble testet for anti-proliferasjon aktivitet mot brystkreft-cellelinje MDA-MB-231
in vitro
. Sterk anti-spredning aktivitet ble registrert i fraksjoner 11 og 12, hvor fraksjon 11 ble besto av 51
st til 55
th ml eluat mens fraksjon 12 ble samlet inn fra 56
th til 60
th ml eluat (figur 1) av totalt 180 ml elusjonsbuffer brukt. Figur 2 viser SDS-PAGE-analyse av fraksjonene 9 til 14.
gelfiltrering separasjon ble utført ved anvendelse av HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR-kolonne. Proteinfraksjonene ble eluert med 50 mM natriumfosfat, pH 7,2, og strømningshastighet på 0,5 ml /min. De aktive proteinfraksjoner 11 og 12 ble eluert ut innen 50 ml til 60 ml elueringsbuffer.
Vår foreløpige analyse fant at fraksjoner 11 og 12 besatt anti-spredning aktivitet på MDA-MB-231. Begge fraksjonene 11 og 12 viste identiske proteinprofiler.
Brøk 11 og 12 ble slått sammen og kalt SN-F11 /12. LDH cytotoksisitet analysen ble utført på MDA-MB-231-cellelinjen, hvor cellen ble behandlet med SN-F11 /12. Figur 3a viser prosentandelen av LDH slippes ut i dyrkningsmedia som ble behandlet med ulike konsentrasjoner (5-25 ug /ml) av SN-F11 /12, ble behandlingene utført i 24, 30, 36, 42 og 48 timer og etter hver behandlingsperiode LDH prosent frigitt til mediene ble målt. Effektiv konsentrasjon (EC
50) verdi er definert som den konsentrasjon uttrykt i mikrogram /ml av proteiner i ekstraktet som inhiberte 50% av celleveksten. EC
50-verdier for forskjellige behandlingsperioder ble bestemt og er vist i Figur 3b, hvorfra det konstante EC
50 verdi for SN-F11 /12 ble funnet å være ved 3,8 ug /ml proteiner.
Hver kurve over% LDH-frigivelse ble plottet mot respektive behandlings tidspunkt. B. EC50-verdi ble plottet mot respektive behandlings tidspunkt for bestemmelse av konstant EC50-verdi. Den konstante EC50 verdi av SN-F11 /12 på MDA-MB-231 var 3,8 mg /ml.
Videre evaluering av anti-spredningsmekanisme utstilt ved SN-F11 /12 på MDA-MB -231 ble utført ved å bruke PCR-teknikken, hvor det fastslått konstant EC50-verdi ble brukt til å behandle MDA-MB-231-celler og etterfølgende ekspresjon av to proliferative markører, Ki67 og PCNA, ble undersøkt. Beta-aktin ble benyttet som kontroll lasting. Ekspresjonen av Ki-67 og PCNA ble funnet nedregulert i forhold til cellene dyrket uten behandling (figur 4a). Ki-67 uttrykk ble betydelig redusert i MDA-MB-23 celle etter 36 og 48 timer behandling med SN-F11 /12 sammenlignet med de un-behandlede celler. Ekspresjonen av PCNA mellom behandlet og ubehandlet celle var ikke signifikant forskjellig, selv om SN-F11 /12 behandlede celler uttrykte lavere nivåer av PCNA (figur 4b).
Tallene viser normaliserte mRNA-ekspresjon av (A) Ki67 og (B) PCNA på de behandlede MDA-MB-231-celler. Målgenet mRNA-ekspresjon ble normalisert til mRNA-ekspresjon av beta-aktin. Hver data representerer gjennomsnitt ± SE fra tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble bestemt ved hjelp av Student
t
test med *
p
. 0,05 som statistisk signifikans, sammenlignet med ikke-behandlede celler på hvert tidspunkt
Bortsett fra de proliferative markører, ekspresjonen av to invasjons markører, CCL-2 og IL-6 ble også undersøkt ved hjelp av PCR-teknikken. Ekspresjonen av CCL2 i MDA-MB-231 celle ble nedregulert etter SN-F11 /12 behandling sammenlignet med den ikke-behandlede celle (figur 5a). Tvert imot, ekspresjonen av IL-6, som vanligvis er involvert i å fremme celle invasjon, ble funnet oppregulert etter SN-F11 /12 behandling (figur 5b).
Tallene viser normaliserte mRNA-ekspresjon av (A) CCL2 og (B) IL6 på de behandlede MDA-MB-231-celler. Målgenet mRNA-ekspresjon ble normalisert til mRNA-ekspresjon av beta-aktin. Hver data representerer gjennomsnitt ± SE fra tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse ble bestemt ved hjelp av Student
t
test med *
p
. 0,05 som statistisk signifikans, sammenlignet med ikke-behandlede celler på hvert tidspunkt
SDS-PAGE-proteinet profilering på SN-F11 /12 viste tilstedeværelse av 15 proteinbånd ble hvert bånd skåret ut for in-gel fordøyelse og de tryptiske-spaltet peptider ble analysert ved hjelp av LC /Q-TOF. Figur 6 viser SDS-PAGE-profil av den aktive fraksjonen SN-F11 /12 og proteinet identifisert ble oppført i tabell 1 ble 13 proteinbåndene hell identifisert mens 2 proteinbåndene viste ingen protein treff.
Det identifiserte protein band ble nummerert som vist til høyre. Analysen identifiserte 15 proteinbånd på gelen.
Diskusjoner
Tidligere små molekylære forbindelser fra bladet etanol ekstrakt og blad vandig ekstrakt av
G. procumbens
ble vist å hemme veksten av brystkreftcellelinjen T47D [9] og human mesangial celleproliferasjon [18] hhv. Til dags dato er det ingen informasjon på den biologiske proteinekstrakt fra blad av
G. procumbens
. Dette er den første rapport som viser den cytotoksiske egenskap av bladet proteiner av
G. procumbens
. I denne studien, blad proteinekstrakter av
G. procumbens
ble utsatt for noen rensetrinn før den anvendes for testing. Ekstraktene første gjennomgikk saltutfelling for å fjerne små molekylære forbindelser som samtidig proteinene ble saltet ut som pellet. Pelleten ble vist å vise cytotoksisk aktivitet på MDA-MB-231 brystkreftcellelinje som observeres under en invertert mikroskop. Deretter ble pelleten underkastet rensing ved gelfiltreringskromatografi for fjerning av salt og også for ytterligere separering av proteiner i henhold til størrelsen [17]. Deretter ble aktive proteinfraksjoner 11 og 12 vist seg å ha identiske proteinprofiler, og de ble slått sammen som SN-F11 /12 fraksjon. SN-F11 /12 ble funnet å utvise sterk cytotoksisk aktivitet på MDA-MB-23 brystkreftcellelinje som vurdert av LDH cytotoksisitet assay.
oppsamlet fra LDH cytotoksisitets-analysen indikerte at SN-F11 /12 viste potent hemmende egenskap på veksten av MDA-MB-231-celler med en konstant EC50-verdi på 3,8 ug /ml. Den anti-proliferative effekt av SN-F11 /12 ble avslørt ved undertrykkelse av de mRNAer av to sprednings markører, nemlig Ki67 og PCNA, som er avgjørende for DNA-replikasjon [20]. Begge markørene er cellesyklusrelaterte gener som vanligvis brukes i evalueringen av
in vitro
anti-proliferative medikamenter [19]. Ki67 er en kjernefysisk antigen uttrykt i G1, G2 og M fasene [20], mens PCNA er uttrykt i G1, G2 og S fasene [21] av cellesyklus. Våre resultater viste den differensielle ekspresjonen av disse to markører i SN-F11 /12-behandlet og ubehandlet MDA-MB-231-celler, hvor ekspresjonen av Ki67-mRNA var signifikant (p 0,05) nedregulert i den sistnevnte, mens reduksjon av PCNA mRNA uttrykk ikke synes å variere betydelig. Ki67 og PCNA har forskjellige egenskaper og halveringstid [22]. Generelt er ekspresjon av Ki67 utelukkende indikere celleproliferasjon, mens PCNA uttrykk, foruten celleproliferasjon, indikerer også DNA-reparasjon eller celledød. Observasjonen av forskjellige nivåer av mRNA og Ki67 PCNA mRNA kunne tilskrives halveringstiden av PCNA, som er 20 ganger lenger enn den for Ki67. Videre er PCNA protein funnet stolpe cellesyklus og celledød. Påvisning av PCNA etter celledød kan være årsaken til ubetydelig differensial PCNA uttrykk mellom SN-F11 /12-behandlet og ubehandlet MDA-MB-231 celler. Derfor er anti-proliferativ effekt av SN-F11 /12 på MDA-MB-231 celler sannsynlig korrelert med Ki67 og PCNA, de mest brukte proliferative indekser for
in vitro
studien.
CCL2 og IL6 er involvert i kreftcelle invasjon. I prosessen med kreftutvikling, CCL2 sammen med makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) spiller en aktiv rolle for å rekruttere sirkulerende blodmonocytter til tumorstedet, hvor rekruttert monocyttene blir differensiert i tumor-assosiert makrofager (TAM) og etablere et symbiotisk forhold med tumorceller. Deretter vil TAM utskiller vekstfaktorer så som EGF, TGFp, FGF, VEGF, IL1, TNF og IL6 som fremmer tumorcelle-proliferasjon, invasjon og metastase [23]. MRNA uttrykk for de to invasjons markører, CCL2 og IL6, var inverst til hverandre. Den CCL2 mRNA uttrykket ble nedregulert mens IL6 mRNA uttrykk var oppregulert i SN-F11 /12-behandlede MDA-MB-231 celler. CCL2 er en av de essensielle kjemokiner for brystkreft utvikling og progresjon [24]. Overekspresjon av CCL2 fremmer brystkreft metastase [25]. Tvert imot, inhibering av CCL2 og dens reseptor signalveien reduserer metastase
in vivo
og forlenger overlevelse av tumorbærende mus [26]. IL6 er en interleukin som spiller en nøkkelrolle i patofysiologien av flere kreftformer og ulike inflammatoriske sykdommer i immunsystemet [27]. IL6 over-uttrykk har vært innblandet i tumorgenesen av myelomatose, eggstokkreft, nyrecelle, prostata, cervical og brystcarsinomer [28], [29], [30], [31]. I en tidligere studie, ble CCL2 rapportert å bidra til utvikling av lungefibrose ved å redusere nivåene IL6 [32]. I denne studien behandling av MDA-MB-231-celler med SN-F11 /12 redusert ekspresjon av CCL2 mRNA i cellene. Tvert imot, ekspresjonen av IL6 mRNA i SN-F11 /12-behandlede MDA-MB-231-celler var oppregulert i forhold til de un-behandlede celler. Som IL6 hadde blitt vist å være en pleiotropisk cytokin med både tumor-fremmende og hemmende aktivitet [33], den oppregulering av ekspresjonen av IL6 mRNA i SN-F11 /12-behandlede MDA-MB-231-celler kan forårsake en inhiberende virkning på veksten av brystkreftcellelinjen.
SN-F11 /12 har vist lovende resultater av anti-spredning og anti-invasjons på MDA-MB-231-celler, proteinfraksjonen ble ytterligere evaluert ved SDS-PAGE og massespektrometri-analyse. Ut av de tolv proteiner identifisert i SN-F11 /12, to proteinene, nemlig superoksid dismutase cooper sink (Cu, Zn-SOD) og Toll Interleukin 1 reseptor-nukleotid Binding Site-Leu-Rich Repeat (TIR-NBS-LRR) klasse sykdomsresistens protein tilhørte anlegget forsvars proteiner kategori. Disse plante forsvars proteiner har også blitt påvist i
Corydalis cava
knoller pakke der de ble funnet å hemme veksten av HeLa cellelinje [34]. Superoxide dismutase (SOD) er en antioksidant som katalyserer dismutering av superoxide anioniske radikaler til hydrogen peroxide og oksygen [35]. Proteinet tilhører metalloenzyme gruppe der aktiviteten er avhengig av metallioner i form av Cu, Zn-SOD, Mn-SOD og Fe-SOD [36]. Zhang
et al
. (2002) [37] rapporterte at overekspresjon av Cu, Zn-SOD undertrykker veksten av humane tumorceller. Imidlertid, Cu, Zn-SOD vist ekstrahert fra hvitløk antagonist virkning til doxorubicin, en av de mest brukte anti-kreft medikamenter, lindrer anticancer medikament cytotoksisitet mot tumorcellelinjer [38], [39]. I foreliggende undersøkelse, Cu, Zn-SOD ble påvist i fire forskjellige proteinbånd av SN-F11 /12. Men om Cu er Zn-SOD-protein som bidrar til anti-kreft egenskap av den aktive proteinfraksjonen SN-F11 /12 krever videre evaluering.
TIR-NBS-LRR klasse av sykdomsresistens ( R) proteiner har blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i programmert celledød som en del av anlegget immunsystemet [40]. NBS-domener oppviser ATPase-aktivitet mens den LRR domene er kjent for å formidle protein-protein og protein-ligand interaksjoner. TIR-NBS-LRR klasse av sykdom motstand (R) proteiner er også involvert i den spesifikke anerkjennelse av patogen-avledet elicitor [41]. I planteriket, TIR-domene som er til stede ved N-terminus av R-proteiner bærer NBS og LRR, mens den er nødvendig for celledød signalering [42].
Askorbat peroksydase (APX) er en plante forsvar protein som også ble påvist i SN-F11 /12. APX, sammen med glutation peroksidase og katalase, utgjør antioksidant enzymer som er involvert i avgiftning av hydrogenperoksid (H
2o
2). Etter dannelsen av hydrogenperoksyd ved enzymatisk reaksjon av SOD, er avgiftning av hydrogenperoksyd utføres av disse antioksidantene enzymer, som katalyserer omdannelsen av hydrogenperoksyd til vann [43]. En balanse forholdet mellom SOD til antioksidantenzymer er en nødvendig for riktig funksjon av cellen, hvor høye nivåer av SOD i forhold til antioksidantenzymer vil føre til en opphopning av superoksidradikaler som er giftige for makromolekyler, mens lave nivåer av SOD relativ til antioksidantenzymer vil resultere i en økning i konsentrasjonen av hydrogenperoksyd som deretter vil bli omdannet til hydroksyd-radikal (-OH), en svært reaktive arter som er ansvarlig for oksidativ skade på cellen [37].
malatdehydrogenase var den mest tallrike protein påvist i den aktive proteinfraksjonen av SN-F11 /12, siden den ble oppdaget i syv av de SDS-PAGE-proteinbånd. Malat dehydrogenase katalyserer en reversibel NAD
+ – avhengig-dehydrogenase reaksjon i TCA syklus [44]. Kim
et. al
(2008) [45] viste at aktiviteten til malat dehydrogenase antagoniseres av aktiviteten til glukose-6-fosfat-dehydrogenase i Dehydroepiandrosteron (DHEA) som var behandlet leverkreft hos rotter.
