Abstract
Neuropilins, først karakterisert som nevrale reseptorer, fungerer som co-reseptorer for kreftrelaterte vekstfaktorer og ble nylig involvert i flere signalveier som fører til cytoskeletal organisasjon, angiogenese og kreft progresjon. Deretter forsøkte vi å undersøke muligheten for neuropilin-2 for å organisere epitelial-mesenchymale overgang i kolorektal kreftceller. Ved hjelp av spesifikke siRNA å målrette neuropilin-2 uttrykk, eller genoverføring, må vi først observert at neuropilin-2 uttrykk endows HT29 og Colo320 for xenograft formasjon. Videre neuropilin-2 dratt en fibroblastisk lignende form til kreftceller, noe som tyder på en involvering av neuropilin-2 i epitelial-mesenchymale overgang. Faktisk, var nærværet av neuropilin-2 in colorectal carcinoma-cellelinjer korrelert med tap av epitel-markører som cytokeratin-20 og E-cadherin og med anskaffelse av mesenchymale molekyler slik som vimentin. Videre viste vi ved av overflate-plasmonresonans eksperimenter som neuropilin-2 er en reseptor for å transformere-vekstfaktor-β1. Ekspresjonen av neuropilin-2 på tykktarmskreftcellelinjer ble faktisk vist seg å fremme trans-vekstfaktor-β1 signalering, som fører til en konstitutiv fosforylering av Smad2 /3-komplekset. Behandling med spesifikke TGFB-type1 receptor kinase hemmere restaurert E-cadherin nivåer og hemmet delvis neuropilin-2-indusert vimentin uttrykk, noe som tyder på at neuropilin-2 samarbeider med TGFB-type1 receptor å fremme epitelial-mesenchymale overgang i kolorektal kreftceller. Våre resultater tyder på en direkte rolle NRP2 i epitel-mesenchymale overgang og fremheve et krysstale mellom neuropilin-2 og TGF-β1 signalering for å fremme kreft progresjon. Disse resultatene tyder på at neuropilin-2 oppfyller alle kriteriene for et terapeutisk mål å forstyrre flere onkogene funksjoner i solide svulster
Citation. Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, Viel E, Bouard A, Balland J , et al. (2011) Neuropilin-2 Expression Fremmer TGF-β1-mediert Epitelial å Mesenchymale Overgang i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10,1371 /journal.pone.0020444
Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA
mottatt: 17 november 2010; Godkjent: 03.05.2011; Publisert: 01.07.2011
Copyright: © 2011 Grandclement et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Grant API -CHU 2008 av Universitetssykehuset i Besançon; CG mottatt et fellesskap fra det franske «agence nationale pour la recherche TECHNOLOGIQUE»; JRP mottatt et fellesskap fra Regionrådet for Franche Comté; et stipend fra «Ligue contre le cancer du Doubs» støttet dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Neuropilins (NRPS) er transmembrane ikke-tyrosin-kinase-glykoproteiner som opprinnelig ble beskrevet i nervesystemet. Neuropilin (NRP) familie består av to gener, neuropilin-en (NRP1) og neuropilin-2 (NRP2). Under nervesystemet utvikling, NRP1 og NRP2 spille en avgjørende rolle i akson tilbaketrekking og veiledning ved binding klasse III semaphorins [1]. Innledningsvis karakterisert som neuronale reseptorer, ble NRPS også funnet å bli uttrykt i endotelceller og senere ble vist å spille en rolle i utviklingen av det vaskulære system [2].
NRPS vise en kort intracytoplasmatisk hale som ikke gjør inneholde en kinase domene. Innledende undersøkelser av neuropilin avhengig molekylære stier antydet at neuropilins ikke kan direkte overføre intracellulære signaler. Dette førte til forslaget som hetero-dimerisering med andre reseptorer er pålagt å mekle neuropilin-nedstrøms signalering. En av disse ko-reseptor-kompleksene som er beskrevet så langt omfatter vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) [3], [4], [5]. I tillegg til forsterkning av VEGFR-signalering, kan NRPS samhandle med plexins å mediere klasse 3 semaphorin signaltransduksjon via Rho-relaterte G-proteiner, modulering av cytoskjelettet organisasjon [6].
Ikke desto mindre et sterkt konservert aminosyresekvens fremme NRPS intracellulære hale binding til PDZ domenet GAIP-C ende samspill protein-1 (GIPC-1) ble nylig rapportert antyder muligheten for at NRPS kan regulere alternative biologiske funksjoner [7].
de mange funksjonene NRPS var nylig markert med identifisering av NRP rolle i onkogenese. I tillegg til tilstedeværelse av NRPS på tumorassosierte fartøy, ble NRPS uttrykt av et stort utvalg av tumorer, noe som tyder på en mulig rolle av dette glykoprotein i progresjon av kreft. Faktisk ble NRP2 ekspresjon funnet i osteosarkom [8], melanom [9], lunge-kreft [10], [11], hjernesvulster [12], [13] coloncancere [14], bukspyttkjertel kreft [15], [16 ], [17], brystkreft [18], myeloid leukemi [19], spytt adenoid cystisk karsinom [20], infantil hemangiom [21], eggstokkene svulster [22] og blære kreft [23]. I colon carcinoma, NRP2 direkte fremmer tumorprogresjon i en celle autonom måte (se gjennomgang av NRP2 uttrykk på kreftceller i tabell S1). Det ble foreslått at NRP2 onkogene egenskaper er avhengige av en økt VEGFR1 fosforylering og aktivering av VEGFR1 /PI3K /Akt signalering. [14] Det er imidlertid den presise molekylære reaksjonsveier drevet av NRP2 og er involvert i onkogenesen forblir stort sett ukjent.
Epithelial-mesenchymale overgang (EMT) er en av de viktigste molekylære mekanismene som utføres i løpet av onkogenese for å fremme kreft progresjon. EMT er karakterisert ved en nedbrytning av celle veikryss, tap av epitel-karakteristikker og celle polaritet, som bidrar til karsinom progresjon. Foruten forsterkningen av mesenchymale markører, EMT endows kreftcelle for migrasjon, invasivitet og påfølgende metastasedannelsen [24]. Despites flere studier knyttet til rollen som NRP2 i kreft progresjon, ingen vesentlige bevis etablert en involvering av dette molekylære veien i EMT.
Her brukte vi tykktarmskreft cellelinjer transfektert med NRP2 transgen eller siRNA å undersøke NRP2 engasjement i EMT. Disse eksperimentene gitt bevis for at NRP2 endows tykktarmskreft cellelinjer for koloni og xenograft formasjon. Videre ble en konvertering fra epitelial til fibroblast-lignende form utløst av NRP2 uttrykk, samt oppkjøpet av vimentin og EMT spesifikke transkripsjonsfaktorer. Deretter undersøkte vi påvirkning av NRP2 på transvekstfaktor β1 (TGF-P1) signale som antas å bidra til sent stadium kreft ved å fremkalle EMT. Vi viste at NRP2 fremmer et konstituerende Smad2 /3 fosforylering i tykktarm kreft cellelinjer. Videre spesifikke siRNA rettet mot NRP2 eller behandling med farmakologiske hemmere av TGFB-1 type 1 reseptor (TGFβRI) forhindret Smad2 /3 fosforylering og NRP2-mediert EMT av kolorektal kreft celler. Sammen er disse resultatene tyder på at NRP2 samarbeider med TGFβRI å fremme EMT i kolorektal kreft.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskecellelinjer HT29, Colo320, SW620, MCF7- , Caki, A498, HEK293 ble kjøpt fra American Type Cell Culture Collection og ble dyrket i RPMI 1640 eller DMEM (Lonza, Paris, Frankrike) supplert med 10% varme inaktivert endotoksin føtalt kalveserum (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , Frankrike). Bes-PAC01, Bes-PAC03, Bes-PAC04 og Bes-PAC05 (Pankreas Adeno-karsinom) cellelinjer ble opprinnelig isolert fra ascitisfluider stammer fra fire pasienter med bukspyttkjertel adenokarsinomer, i vår universitetssykehus. R3III cellelinjen ble vennlig levert av Nathalie Labarriere, Inserm (Nantes, Frankrike). Jijoye og Raji cellelinjer (Menneskelig Burkitt lymfom) ble levert av Diaclone (Besançon, Frankrike). Cellelinjene anvendt i denne studien ble authentified ved bruk av DNA-profilering (korte tandemrepetisjoner analyse), i tråd med ATCC anbefalinger (se tabell 1). Kort tandem repeat (STR) analyse er en molekylærbiologi metode anbefales for cellelinje identifikasjon. Cellelinjer brukt i denne studien ble genotypet før frysing og annenhver måned. STR-analyse ble utført med AmpFISTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems). Høyde bestemt loci inkludert tandem repetisjoner på DNA fra kreftcellelinjer ble analysert. STR analyse måler den nøyaktige antallet gjentatte enheter for hvert allel (D7S820 8,20 betyr at 8 og 20 gjentar identifiseres på hvert allel av D7S820 locus for den cellelinje Jijoye). Hvis en variant vises som inneholder en delvis gjentakelse, som delvis gjentar enheten er utpekt av en desimal, etterfulgt av antall baser i delvis gjentakelse.
pcDNA Ekspresjonsplasmider
Påvirkningen av NRP2 på tykktarmskreftcelle progresjon ble bestemt ved å overføre NRP2 genet i HT29-cellelinjen. Vi generert HT29
NRP2 cellelinjer ved hjelp av to uttrykk plasmider som koder hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, vennlig levert av M. Klagsbrun) og pCMV6-XL5-NRP2 (kjøpt fra Origene (Rockville, MD, USA). Kontroll HT29 celler ble samlet ved hjelp av pcDNA3.1 eller pCMV6-XL5 vektorer. 1,5 x 10
6 HT29-celler ble sådd i en 60 mm
3 kolbe i 4 ml medium og inkubert i 24 t. Deretter ble celler stabilt transfektert med ett ug pcDNA3.1-NRP2 eller pCMV6-XL5-NRP2 ekspresjonsvektorer eller kontroll vektorer ved hjelp av Effectene kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) i henhold til produsentens anvisninger. Celler transfektert med pcDNA3.1 vektorer ble valgt med 0,8 mg /ml geneticin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike), 48 t etter transfeksjon.
Små interfering RNA
Bruke Ambion siRNA webdesign verktøy, identifiserte vi en potensiell NRP2-bestemt mål sekvens. spesifikk NRP2 siRNA (forstand 5′-AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA ATT T-3 «og anti-sense-5′-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA GCT T-3′) og krafse siRNA (forstand 5»-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- 3 «og anti-sense 5′-AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3») sekvenser ble glødet og klonet inn i BbsI stedet av 3 «LTR av pFIV-H1 /U6 vektor i henhold til produsentens instruksjoner (System biovitenskap, Mountain View, California). -Sekvenser ble bekreftet ved NIH BLAST analyser for å ha noen vesentlig homologi til sekvenser i andre virveldyr gener. Lentiviral supernatant produksjon og påfølgende infeksjon av celler ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (System biovitenskap, Mountain View, California). Colo320 stabilt transfektert ble valgt med 3 mg /ml puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike), 48 t etter transfeksjon.
Flowcytometri
Anti-NRP2, anti-NRP1, anti-pSmad2 /3, anti-TGFβ1, anti-TGFβR1 var fra Santa Cruz Biotechnology-(Heidelberg, Tyskland). Anti-smad2 /3 og anti-TGFRII, var fra RD system (Lille, Frankrike). Alexafluor488 merkede sekundære antistoffer ble kjøpt fra Fluoprobes (Interchim, Montluçon, Frankrike). Ti tusen celler fra hver prøve ble evaluert for fluorescens deteksjon ved hjelp av BD FACSCanto cytometer. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Frankrike) For intracellulær farging ble cellene fiksert i 20 minutter ved 4 ° C i 2% paraformaldehyd. Farging ble deretter realisert ved romtemperatur i 30 minutter i en buffer inneholdende 0,4% saponin og 5% FCS. Vaskebuffer inneholdt 0,1% saponin, 5% FCS. For strømningscytometri-analyse, ble Relativ fluorescensintensitet (RFI) beregnet.
Cell Proliferation Assay
celle proliferasjon in vitro ble analysert med tetrazoliumsaltet 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5 difenyltetrazoliumbromid (MTT). I korthet ble 4000-celler per brønn sådd ut i 96-brønners mikro-plater inneholdende 100 ul medium per brønn. For analyse ble 10 ul av MTT substrat (av en 5 mg /ml stamløsning i fosfat-bufret saltvann) tilsatt til hver brønn, og platene ble la til standard vev inkubatorbetingelser i ytterligere 2 timer. Celler ble oppløst i 200 ul dimetylsulfoksid, og kolorimetriske analyser ble utført (bølgelengde 570 nm). Platene ble analysert hver 24. time i de neste 3 dager.
ELISA-analysen
Cellene ble inkubert i RPMI eller i DMEM-1% FCS i 24 timer. Deretter ble cellene tellet og 10000 celler per brønn ble sådd ut i 96-mikroplate i 200 ul DMEM-0,1% FCS i 24 timer. VEGF produksjonen ble vurdert på supernatanter med humane VEGF Elisa kit (Strathmann Biotec, Hamburg, Tyskland).
flowcytometrisystemer Analyse av DNA innhold
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket med iskald PBS , fiksert i 70% etanol. Før DNA-analyse, ble cellene farget med 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrike) og 2 pg /ml DNase-fri RNase (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrike) i 15 min ved 37 ° C i mørket. DNA-innhold ble målt ved bruk av et FACSCalibur strømningscytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Frankrike) og analysert med Cellquest program.
xenograft eksperimenter
Nakne mus ble oppnådd fra Janvier (Le Genest St Isle, Frankrike), og vedlikeholdes i vår dyre anlegget i henhold til animal Eksperimentelle etikkomité retningslinjer. 1 × 10
6 celler av HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
si-RNA-NRP2 og Colo320
siRNA-ctrl cellelinjer resuspendert i 100 mL PBS ble inokulert subkutant i nakne mus og tumorvekst ble målt to ganger i uken i hver gruppe. Tumor volum ble beregnet ved formelen
V
= 1/2
en
×
b
2, der
en
er den lengste svulst aksen, er og
b
kortest svulst aksen. Når tumorer nådde 1 cm i diameter, ble musene avlivet og tumorene ble fiksert i formol for påfølgende immunhistokjemisk analyse.
kolonidannelse assay
Effekt av NRP2 uttrykk på kolonidannelse in vitro ble evaluert ved myk agar-kolonidannelse analysen. 5000 celler per brønn ble sådd ut i 500 ul av 2% agarose medium i en 24-brønns plate. Cellene ble inkubert ved 37 ° C, ble 5% CO2 og bilder tatt etter 10 dager med kultur.
Invasion analysen
Invasion ble evaluert med 96W QCM Invasion analysen (Millipore, USA). I korte trekk likt antall (100000) fra kontrollceller (HT29
ctrl) eller NRP2 uttrykkende celler (HT29
NRP2) resuspendert i serumfritt medium ble plassert i den øverste avdeling av en standard 8 um pore Boyden kammer. Materskuffen brønner inneholdt serumfritt medium eller medium 10% FCS. Etter 16 timer invasjon (37 ° C, 5% CO2), ble invaderende celler inkubert med celle løsgjøring buffer, lysert og merket med CyQuant GR fargestoff. (QCM 96W analysen, Millipore, International). Fluorescens ble så evaluert med en fluorescens plateleser (Cell Lab Quanta, Beckman-Coulter) med en 480-520 nm filter sett.
Cell behandlinger
TGF-β1 signale ble hemmet ved hjelp av SD- 208 eller SB-431 542 (TGFRI kinase inhibitor) fortynnet i DMSO (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrike). DMSO tjente som kontrollmedium i alle forsøk. I noen eksperimenter Avastin (Pharmacy av CHU Jean Minjoz, Besançon, Frankrike) ble brukt til å hemme VEGF-A. TGF-β1 ble kjøpt fra RD System (Lille, Frankrike).
Western Blot analyse
Kort, etter to vasketrinn ble cellene høstet og oppløst i lysis buffer containing1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM vanadat og en komplett Mini proteasehemmer Cocktail tablet (komplett Mini EDTA Free, per 10 ml lysis buffer, Roche, Frankrike). 30 ug av hel-cellelysater ble separert ved hjelp av natrium duodecyl sulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membraner ved elektroblotting. Blottene ble deretter blokkert i 1 time i 5% melk før inkubering med spesifikke antistoffer som følger: anti-NRP2 og anti-twist1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), anti-Smad2 /3 (R tilstedeværelse eller fravær av subcellulære spesifikke proteiner (slik som β-aktin eller histon H1) bekreftet subcellulære separasjon.
Co-immunoutfellingsanalyse
Cellene ble lysert i PBS inneholdende 200 mM tris HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% volum /volum tritonX100, 1 mM DTT, 15 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM vanadat og en fullstendig mini-protease inhibitor cocktail tablet (Complete mini EDTA-fri, per 10 ml lyseringsbuffer , Roche, Frankrike). Kanin anti-TGFRI polyklonale antistoffer (i Santa Cruz Bioteknologi-) og kanin-IgG polyklonale antistoffer ble tilsatt til lysatene ved en endelig fortynning på 1/100 og inkubert over natten ved 4 ° C. Protein-G magnetiske kuler (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike) ble tilsatt til blandingen og inkubert i ytterligere to timer ved 4 ° C. Proteiner ble deretter eluert ved magnetisk separasjon og denaturert. Western-Blot ble deretter utført ved hjelp av anti-NRP2 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland).
Histopatologisk Analyse og immunhistokjemisk farging av vev
Vevsprøver, hentet fra xenografter ble fiksert i 4 % formalin og parafin innebygd. Deretter blokker ble skåret serielt ved 4-um tykkelse. HMS (Hematoxyline Eosine Safran) farging ble brukt for å vurdere morfologi. En standard immunhistokjemisk teknikk ble utført ved hjelp av en Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) immunostainer med følgende primære antistoffer: anti E-cadherin (Zymed, San-Francisco, USA), anti-cytokeratin-20 ( Zymed, San-Francisco, USA).
Surface plasmonresonansen analyse
design og fabrikasjon av hjemmelagde chips kompatible med SPR (overflate-plasmonresonans) er utført som tidligere publisert ved hjelp av MIMENTO teknologisk plattform, Besançon, Frankrike [25]. De NRP2 chips fremstilt i denne studien bestå i kovalent poding av Fc-NRP2 enheter på kjemisk aktivert selv montert monolaget ved å følge prosedyren til protein chip bygning nylig publisert [26]. Fc-NRP2 var fra RD System (Lille, Frankrike). Denne fremgangsmåten fører til en dekning på 7,4 +/- 0,1 femtomole /mm
2 av NRP2. Injeksjoner av BSA (kontroll -), VEGF (Kontroll +) og TGFβ1 utføres ved 250 nM i PBS-Tween 0,05%, pH 7,4. BIAcore eksperimenter ble utført med den Biacore 2000 Anordning ved 25 ° C med en strømningshastighet utgjør mellom 2 og 30 ul /min.
Real Time-kvantitativ PCR (RT-qPCR)
Total RNA Det ble tatt ut ved hjelp av Kit RNeasy mini (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) og revers transkribert ved hjelp av tilfeldige heksamer og Moloney murine leukemia virus revers transkriptase (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Duplikatprøver ble underkastet RT-qPCR. mRNA ble kvantifisert ved hjelp av primere listet nedenfor. NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), TGF-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), Twist1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems)
ABL mRNA fra hver prøve ble kvantifisert som en endogen kontroll av den interne RNA. Relativ mRNA uttrykk ble beregnet ved hjelp av Delta-Delta-Ct metode og ubehandlede celler ble brukt som kalibrator.
Slide forberedelse og konfokalmikroskopi
Celler ble spredt på Labteck kammer lysbilder (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrike) og deretter behandlet med de passende reagenser. Cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyde og permeabilized med 0,1% Triton X100. Etter 20 minutter av blokkering i 20% føtalt bovint serum og vasking ble cellene farget med egnede antistoffer Stabler av konfokale bilder ble oppsamlet med en Olympus FV1000 laser scanning konfokalt mikroskop. Cellekjerner ble motfarget med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol). For fluorescens kvantifisering, ble forholdet mellom fluorescens intensitet beregnet i hver tilstand. Forhold av fluorescens intensitet ble beregnet i dividere atom fluorescens av cytoplasma-membranen fluorescens. Fluorescensintensiteten av 50 celler er blitt analysert i hver tilstand.
Smad rapportøranalyse
Vi har benyttet den TGF-β reporter analysen fra SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) for kvantifisering av TGF -β-indusert SMAD2 /3 signalering. Kvantifisering av ildflueluciferase ble realisert ved bruk av en dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega Co., Madison, USA) i henhold til produsentens protokoll. Alle transfeksjoner ble utført in triplo ved bruk av Lipofectamine kit. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrike). Etter 24 timer med transfeksjon, ble mediet forandret, og cellene ble behandlet med 50 ng /ml TGF-β1 i ytterligere 24 timer. Resultatene er presentert som forholdet mellom
ildflue luciferase
aktivitet og
Renilla luciferase
aktivitet (Ren /Luc) for hver forhold. Deretter verdiene ble rapportert til verdiene for den negative kontroll.
Statistisk analyse
Resultater er uttrykt som gjennomsnitt pluss eller minus standardfeil av middelverdien (SEM). Gruppe sammenligninger ble utført ved hjelp av Student
t
test. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
p
. 0,05
Resultater
NRP2 uttrykk i menneskelig kreftcellelinjer
Vi først forsøkt å undersøke uttrykket av NRP2 glykoprotein i ulike kreftcellelinjer. Immunofluorescens-analyse bekreftet at NRP2 uttrykkes på membranen av flere humane cancer-cellelinjer (figur 1A). Humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC), isolert fra normal human navlevene, ble anvendt som en positiv kontroll for NRP2 ekspresjon. Vi observerte NRP2 uttrykk ved membran av to av tre kolon kreft cellelinjer (SW620, Colo320 men ikke HT29). NRP2 ble også uttrykt i alle nyrekreft cellelinjer som ble testet (HEK 293, Caki, R3III og A498), i to av fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer (BES-PAC03 og Bes-PAC04, avledet fra pasientens ascitesvæske i vårt institutt), i NCIH441 lungekreft cellelinjen og i 5637 blærecancercellelinje (figur 1A). MDAMB231 brystkreft-cellelinje uttrykt NRP2 mens ingen NRP2 flekker ble funnet på Burkitt lymfom cellelinjer (Raji, Jijoye) (figur 1A).
A, etter Flowcytometri analyse av NRP2 uttrykk i humane kreftcellelinjer.
B, etter Immunhistokjemisk farging av NRP2 i menneskelige kolon vev og brystvev (brun). Formalinfikserte parafin-innleiret vev ble inkubert over natten ved romtemperatur med anti-humant NRP2 antistoff. Representative mikrobilder ble tatt på en opprinnelig forstørrelse x1000; NRP2 er uttrykt i membranen av menneskelige kolon og brystcarsinomer mens det ikke er uttrykt i friskt vev.
immunhistokjemi studier ble deretter gjennomført for å avgjøre om NRP2 uttrykkes på membranen av ulike parafin innebygd-menneske kreft prøven. NRP2 ble uttrykt på tre av ti tykktarmskreft, 5 av 15 brystkreft og 4 av 12 bukspyttkjertelkreft. Av notatet, ble NRP2 ikke oppdaget på prostatakreft (n = 10) og B-celle lymfom (n = 10) (data ikke vist). Videre immunhistokjemisk farging viste at NRP2 uttrykkes på membranen av humane kolonkarsinom og brystcancer, mens det ikke blir uttrykt i ikke-ondartet vev (figur 1B). Våre resultater er konkordant med tidligere publiserte rapporter. Faktisk, i en fersk studie, observerte Gray et al at NRP2 var ikke påvises i nonmalignant colonic slimhinnene, men var tydelig i 10 (83%) av 12 tilstøtende kolon adenokarsinom og i fem (71%) av sju levermetastaser ved IHC farging. Videre, i en annen studie ble NRP2 uttrykk funnet i 5 av 6 (83%) som vanligvis brukes i bukspyttkjertelen cellelinjer [15] og i 7 av 11 (64%) kirurgiske prøver av bukspyttkjertelen adenokarsinom av IHC farging [14]. Til slutt, i brystkreft, Yasuoka et al rapporterte Nrp2-ekspresjon i 60 ut av 113 invasiv brystkreft (53,1%) [18]. Fra disse forskjellige undersøkelser synes det som NRP2 synes å være bestemt av flere tumorvev, mens ingen ekspresjon av dette glykoprotein er ofte observert i sunt vev, noe som bekrefter at NRP2 er et attraktivt mål for innovative antitumorterapi (se tabell S1 for gjennomgang av NRP2 uttrykk i kreft).
for å studere den nøyaktige rollen NRP2 i kreft progresjon, bestemte vi oss for å generere tykktarmskreft cellelinjer som uttrykker eller ikke NRP2, bruker NRP2 genoverføring eller NRP2 bestemt siRNA. Derfor NRP2 ble transfektert inn i HT29 og en spesifikk siRNA ble anvendt for å knockdown NRP2 ekspresjon i Colo320. Flowcytometri eksperimenter ble utført for å bekrefte den modulering av NRP2 ekspresjon i HT29 og Colo320 (figur 2A). Ingen modulering av NRP1 ekspresjon ble observert i HT29 eller Colo320 transfekterte celler. Caki-en nyrekreftceller ble brukt som positiv kontroll for NRP1 farging. NRP2 tilstedeværelse i HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
siRNA-ctrl, Colo320
siRNA-NRP2 ble kontrollert av vestlige blotting (figur 2B).
transfekterte celler ble analysert for NRP1 og NRP2 uttrykk ved flowcytometri analyse (
A
) eller ved western blotting (
B
). For strømningscytometri-analyse, ble Relativ fluorescensintensitet (RFI) beregnet. Caki1 og HUVEC celler ble brukt som positiv kontroll for NRP1 og NRP2 farging hhv.
C, etter spredning av HT29 og Colo320 celler, ifølge NRP2 uttrykk ble vurdert ved hjelp av MTT-analyser. 4000 celler var la kultur under 24, 48 eller 72 timer før analyse. NRP2 ekspresjon er assosiert med en forbedret spredning i tykktarmskreftceller. Data representerer middel av tre paralleller pluss eller minus standardfeil (SE) fra et representativt eksperiment av tre utført. (
**, P 0,01). D,
samme MTT-forsøk ble gjengitt i nærvær av bevacizumab (0,25 og 1 mg /ml, 72 timer). HMEC-1 mikrovaskulære endotelceller ble anvendt som en positiv kontroll for bioaktiviteten av bevacizumab. Faktisk bevacizumab reduseres betydelig HMEC-en spredning mens ingen reduksjon av celleproliferasjon er observert med HT29
NRP2 og Colo320 kreftceller. Erfaringen ble gjort 3 ganger, og for hver gang i tre paralleller.
E, etter flowcytometrisk analyse av DNA innhold av transfekterte tykktarmskreftceller. NRP2 ekspresjon er assosiert med et økt antall celler i fase S. Data representerer resultater fra et representativt eksperiment ut fra 3 uttrykt som gjennomsnittet av duplikate bestemmelser (*,
P 0,05, ** P 0,01, ** * P. 0,001)
NRP2 fremmer tumor spredning
Vi tok fordel av de tidligere cellelinjer for å studere rollen NRP2 på kreft spredning in vitro og tumorvekst in vivo. Spredning ble overvåket ved hjelp av MTT-analyser. HT29
NRP2 celler viste en overlegen hastighet spredning på 24, 48 og 72 timer i forhold til HT29
ctrl (figur 2C). Motsatt NRP2 knockdown med bestemte siRNA, negativt modulert spredning av Colo320 tumor cellelinje (figur 2C). Disse forsøk viste at NRP2 ekspresjon forbedrer koloncancercellelinje proliferasjon in vitro (det significativity ved hvert tidspunkt av disse MTT-analyser er angitt i Tabell S2). For å bekrefte påvirkning av NRP2 på celleproliferasjon, har vi vurdert i ytterligere to eksperimenter doblingstider av HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
siRNA-ctrl og Colo320
siRNA-NRP2 kreft celler. NRP2 uttrykker celler HT29
NRP2 og Colo320
siRNA-ctrl hadde en dobling på 8 og 11 timer henholdsvis, mens dobling tider NRP2 mangler celler HT29
ctrl og Colo320
siRNA-NRP2 var 13 og 14 timer. Siden NRPS er VEGF co-reseptorer, overvåket vi VEGF-A produksjon i HT29 og Colo320 kulturer av Elisa test. Disse cellene produserte lave nivåer av VEGF-A. NRP2 uttrykk påvirket ikke VEGF produksjon (Figur S1). Videre er den nøytraliserende mAb bevacizumab, kjent for å hemme formeringen av mikrovaskulær endotelial cellelinje HMEC-1 [27], ble brukt til å adressere den potensielle rolle VEGFA i NRP2-mediert tumorcellevekst. Disse eksperimentene viste at VEGFA nøytralisering ikke påvirket NRP2-mediert HT29 eller Colo320 spredning. (Figur 2D)
Videre er NRP2 en funksjonell reseptor for semaphorin 3F, som ble beskrevet som en inhibitor av angiogenese, tumorprogresjon og metastase [28]. Western blotting eksperimenter viste at HT29
ctrl og HT29
NRP2 uttrykker det samme nivå av semaphorin 3F, mens ingen semaphorin 3F ble funnet i Colo320-celler, noe som tyder på at NRP2-mediert tumor proliferasjon ikke medfører semaphorin 3F (figur S2) . Deretter fordelingen av atom DNA-innhold ble studert ved flowcytometri i HT29
ctrl, HT29
NRP2, Colo320
siRNA-ctrl og Colo320
siRNA-NRP2 kreftceller. NRP2 ekspresjon var forbundet med en forbedret antall celler i fase S (figur 2E). Serum deprivasjon i kulturmedium induserte en økning i den subG1 fraksjonen bare i NRP2 negative forhold (data ikke vist). Sammen er disse resultatene viste at NRP2 uttrykk i kolorektal cellekreft fremmer kreftcelle spredning og overlevelse.
NRP2 ablasjon bruker siRNA hemmer xenograft dannelsen
Den nøyaktige rollen NRP2 på kreft progresjon ble først karakterisert
in vivo
. For å undersøke effekten av NRP2 uttrykk på
in vivo
tumorvekst, vi vaksinert like tall (1,10
6 celler per mus) av HT29
NRP2 eller HT29
ctrl subkutant i nakne mus. Tumor forekomst og volum ble vurdert annenhver uke. Svulster dukket opp i alle mus inokulert med HT29
ctrl og HT29
NRP2. NRP2 betydelig forbedret tumorvekst in vivo (figur 3A). For å bekrefte disse resultatene, bestemte vi oss for å undersøke om NRP2 målgruppe ved hjelp av spesifikke siRNA kan hemme svulstdannelse. Mens 1.10
6 Colo320
siRNA-ctrl celler injisert subkutant i nakne mus indusert tumor engraftment i alle mus, NRP2 hemming med bestemte siRNA forhindret Colo320 engraftment i alle dyr tyder på en kritisk rolle NRP2 i de tidlige hendelser bidrar til svulst dannelse (Figur 3B) sikret innflytelse NRP2 hemming med bestemte siRNA på Colo320 tumorigenicity ble bekreftet
in vitro
. For dette formål ble Colo320-celler behandlet med NRP2 siRNA eller ctrl siRNA og dyrket i et myk-agar assay. NRP2 knockdown i Colo320 redusert antall kolonier observert i myke agar eksperimenter (Figur 3C). Siden HT29 ikke danne kolonier i myk agar kulturer, bestemte vi oss for å undersøke påvirkning av NRP2 på HT29 invasjon og migrasjon.
