Abstract
Her presenterte vi en enkel og effektiv membran mimetiske microfluidic enhet med antistoff konjugert støttet lipidbilag (SLB ) «smart belegg» for å fange opp levedyktige sirkulerende tumorceller (CTCs) og sirkulerende tumor microemboli (CTM) direkte fra fullblod av alle scene kliniske pasienter kreft. Den ikke-kovalent bundet SLB var i stand til å fremme dynamisk gruppering av lipid-bundet antistoffer mot CTC antigener og minimalisert ikke-spesifikk blodceller oppbevaring gjennom sine ikke-begroing natur. En forsiktig strøm lenger spyles bort løst bundet blodceller for å oppnå høy renhet CTCs, og en strøm av luft skum injisert desintegrere SLB sammenstillingene for å frigjøre intakte levedyktige og CTCs fra brikken. Menneskeblod tilsatt kreftcellelinje test viste ~ 95% samlet effektivitet for å gjenopprette både CTCs og CTMer. Levende /død-analysen viste at minst 86% av de gjenvundne celler opprettholde levedyktighet. Ved å bruke 2 ml perifert blod ble CTCs og CTMer tellinger av 63 friske og kolorektal kreft givere positivt korrelert med kreft progresjon. I sammendraget, ble en enkel og effektiv strategi utnytte biomimetic prinsipp utviklet for å hente levedyktige CTCs for telling, molekylær analyse, samt
ex vivo
kultur enn uker. På grunn av høy sensitivitet og spesifisitet, er det første gang for å vise den høye oppdagelsen priser og kvantitet av CTCs i ikke-metastatiske kreftpasienter. Dette arbeidet har verdiene i både tidlig diagnose av kreft og prognose av CTC og gir en nøyaktig non-invasiv strategi for rutinemessig klinisk undersøkelse på CTCs
Citation. Chen JY, Tsai WS, Shao HJ, Wu JC, Lai JM, Lu SH, et al. (2016) Følsom og spesifikk Biomimetic Lipid Coated Microfluidics å isolere Levedyktige Sirkulasjonstumorceller og microemboli for Cancer Detection. PLoS ONE 11 (3): e0149633. doi: 10,1371 /journal.pone.0149633
Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA
mottatt: 29 september 2015; Godkjent: 02.02.2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council (nå Ministry of Science and Technology, Taiwan) kontrakt: NSC101-2113-M-001-021 -MY2, NSC102-2321-B-001-060, MOST-103-2321-B-001-042, og Summit Program fra Academia Sinica, Taiwan henhold 104-0210-01-09-02. Dette arbeidet ble også støttet av Taiwan departementet for helse og velferd (Velferd avgift på tobakksvarer), No.CMRPG3C1141. J.M. Lai ble støttet av Academia Sinica postdoktorstipend 2013-14. J.Y. Chen ble støttet av MEST-103-2811-B-001-132. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolking, avgjørelse for offentliggjøring, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært noen konkurrerende interesser
Innledning
metastaser er den viktigste årsaken til tilbakefall og dødelighet hos pasienter med solide-svulster over hele verden. Det antas at når den primære tumoren er etablert, vil ytterligere mutasjoner og mikromiljøet interaksjoner av kreftceller fremme spredning av kreftmetastaser. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) har vært innblandet som ansvarlig for Shedding av tumorceller fra heft epitelceller i prekliniske modeller [1]. Intravasation av epitelial opprinnelse primære kreftceller vil tillate kreftcellene sirkulerer i blodet som sirkulerer tumorceller (CTCs) gjennom migrasjon /invasjon progresjon. Den spres CTCs kan dermed reise et stykke og kolon på sekundære områder for metastatisk tumor etablering. Men mekanismen for kreft metastase er fortsatt uklar og oppfatning av kreft formidling som CTCs fortsatt en utfordring. CTCs er unnvikende til påvisning på grunn av den ekstremt sjeldne befolkningen i sirkulasjon av kreftpasienter. Det kan være så få som bare en ~ 1000s CTCs av milliarder av blodlegemer i symptomakreftpasienter. Til tross for sin sjeldne befolkning, har mengden av CTCs i blodet vist seg å korrelere med dårlig prognose av metastatiske kreftpasienter [2], og resultatene av kjemoterapi i bryst, prostata, og melanom kreftpasienter [1,3,4]. Disse studiene indikerte at overvåking av CTC teller kan være nyttig for tidlig oppdagelse og effekt overvåking under behandlingen.
Nylig, nye bevis viste at forekomsten av sirkulerende tumor microemboli (CTM) er sterkt forbinder med fjernmetastaser. I sammenligning med nærvær av enkelt CTCs alene, er tilstedeværelsen av CTMer korrelerte godt med dårlig prognose i metastatisk bryst, prostata, og småcellet lungekreft [5,6]. Det har blitt foreslått at celleaggregater, for eksempel CTMer, gi en celle-celle adhesjon fordel mot skjærspenning i blodet og aktiver signalering for anti-apoptose og beskyttelse fra anoikis [5]. Bevis på kollektiv bevegelse i primærtumorceller gjennom en β1-inteavhengig måte gir en mulighet for Shedding CTMer i blodet [7]. Oppgivelse av plakoglobin-mediert celle-celle interaksjon resulterer i en reduksjon av CTMer i blodet og korrelerer med bedre prognose [6]. Til tross for den betydelige rolle CTCs, rollen CTMer og samspillet mellom CTCs og mikromiljøet i løpet av kreft progresjon er fortsatt uklart. Opplisting og karakterisering av de identifiserte /renset CTCs fra kreftpasienter vil avdekke karakter av CTCs /CTMer i kreft progresjon. Etablering av CTCs fangst system som tillater høy sensitivitet, spesifisitet, og levedyktighet for både CTCs og CTMer vil gi stor nytte for diagnostisering og behandling av pasienter kliniske kreft.
Forskjellige teknologier har avslørt CTCs berikelse og identifikasjon basert på ulike prinsipper, inkludert immun-magnetisk isolering [8-14], cellestørrelse basert filtrering [15,16], antistoff-funksjon microfluidic enheter [17-21], fiberoptisk rekke skanneteknologi [22], dielectrophoresis, passiv celle sortering [23], negativ seleksjon [24,25], ensemble-avgjørelse alikvot rangeringen [26], nano-oppruede overflate adhesjon [27], termofølsomme polymerbelegg [28], eller kombinasjoner av de ovennevnte [29,30] . Noen av disse teknologiene viste bedre følsomhet enn andre, inkludert anekdotiske studier i ikke-metastatisk sykdom [31]. Men knapt noen har vist klinisk nytte i rutine påvisning av CTCs for alle-stadier av kreft som dette krever en svært følsom og spesifikk plattform for å isolere og bevare pasient avledet CTCs for videre etterforskning.
Av alle affinitet -baserte metoder, microfluidic enheter er fremstår som lovende verktøy for å effektivt isolere sjeldne celler, inkludert CTCs og stamceller [18,32-34]. Hovedutfordringen for dette lovende plattform er å frigjøre og gjenopprette de isolerte målceller med biologisk aktivitet [35]. Ved hjelp av enzymatisk oppslutning, kan frigjøring av innfangede celler forstyrre cellemembranen, degradere overflatemarkører, og endre både fenotypiske og funksjonelle informasjon om CTCs, og dermed begrense nedstrøms analysene av celler [34,36]. I tillegg, selv om strømningsinduserte celle løsgjøring viser god virkningsgrad fra 60% til 90% [37-39], er 50 til 200 dyn /cm
to store skjærkrefter er nødvendig for å løsne cellene ved å bryte den antistoff- celleoverflate-antigen-bindinger [40]. En slik sterk kraft som er kjent for å endre genekspresjon og muligens føre til fenotypiske endringer og celledød [32,41,42]. Boble-indusert løsgjøring av affinitets-adsorbert blodlegemer, som utnytter den luft-væske-grenseflatespenning som utøves på klebe cellen for å rive det fra overflaten med 90 til 100% frigivelse effektivitet i mikrostruktur-frie rette kanaler. Imidlertid har lav celle levedyktighet og inkonsistente utvinningsgraden ikke vært ordentlig måte [43-45].
Blant disse studiene har imidlertid overflateeffekter har blitt oversett. Konseptuelt, en «ikke-fouling» overflate, dvs. en overflate med minimal fysisk interaksjon med cellene, kan redusere skjærspenning som kreves for å spyle vekk uspesifikt adherert celler, og gir en mulighet til å redusere den kraft som er nødvendig for celle desorpsjon. Videre er et belegg utformet med svak binding til overflaten, for eksempel fysisorpsjon kunne gi ikke-forstyrrende spaltningsseter punkter (den svakeste lenker) når utøver grenseflatespenning (slik som luftbobler). Evnen til å avbryte overflatebelegget hindrer direkte spaltning av cellemembran-reseptor bindinger, som oftest resulterer i celleskade. I denne kommunikasjonen, beskriver vi en smart belegg i en microfluidic plattform som gir «non-begroing» eiendom for å øke avvisning av uønskede stoffer i blodet og «svakeste leddene» for celle utgivelse. Her rapporterer vi støttet lipid bilaget (SLB) belagt mikrofluidsystem, CMX plattform ( «Cells fanget i Maximum»), og viser seg å være svært sensitiv og spesifikk for å ta både enkelt CTCs og CTMer og har med lett-å-release plattform for anskaffe levedyktige CTCs; alle krever bare 2 ml helt blod. En klinisk studie med telling av både CTCs og CTMer basert på 9 friske donorer bekreftet av koloskopi og 54 pasienter med stadium I til IV av tykktarmskreft (CRC) ytterligere bekreftet overlegen følsomhet og kliniske nytten av fluidic lipid belagt plattform. Samtidig pasient-avledet CTC kultur og mutasjonsanalyse, ytterligere forbedret gjennomførbarhet og nytte for både grunnforskning og klinisk behandling av CMX-plattformen.
Materialer og metoder
mikrofluid Chip Forberedelse og Surface Coating
fabrikasjon av tilpassede antistoff-konjugert SLB (Ab-SLB) belagt microfluidic chips, CMX-plattformen, er beskrevet som følger: En kommersiell CO
2 laser riss (Epilog Helix 24, Golden, CO) er brukes til å lage micropatterns på poly (metylmetakrylat) (PMMA) sleiden (size = 76 mm x 25,4 mm, tykkelse = 1,5 mm). Laseren brukes også til å gravere en 63 mikrometer tykk dobbel-side tape (8018PT; 3M Corp, Maplewood, MN) å skjære ut grensene som omgir microfluidic mønstre på PMMA. De microtrenched mønstre og mikrostrukturer på PMMA lysbildet ble tegnet med Coreldraw (Corel, Ottawa, Canada) og deretter overført til laser telegraf for direkte maskinering på underlaget. I denne studien, seks typer chips var forberedt. Den graverte chips ble limt med plasma behandlet glass lysbilde ved å plassere skåret ut 3M teip (klemt) mellom toppen (PMMA lysbilde) og en glassplate på bunnen for å danne lukkede kanaler. Fremstillingen av lipidvesikler, biotinylering av antistoff fra EpCAM, EpAb4-1, og den sekvensielle fremstilling av anti-EpCAM-støttet lipidbilaget belegg i mikrofluid brikken ble tidligere beskrevet [46]. I korte trekk ble de indre vegger av kanalene microfluidic behandlet med lipidvesikler bestående av 1-palmitoyl-2-oleoyl-
sn
-glycero-3-fosfokolin (POPC) og 1,2-dipalmitoyl-
sn
-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap-biotinyl (b-PE) i molare forhold 95/5 for å danne SLB. For fluorescens-konjugert SLB (Texas Red-SLB), ble microfluidic kanalene belegges ved lipidvesikler bestående av POPC, b-PE, og Texas Rød 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine (Texas Red-DHPE; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) i molart forhold på 94,5 /5 /0,5 følge de samme prosedyrene i lipidvesikler fremstilling. Etter fjerning av overskudd av lipider, ble Neutravidin ™ (NA) konjugert til B-PE i SLB via NA-biotin gjenkjennelse, og påfølgende konjugering av biotinylert EpAb4-1 (b-EpAb4-1) til NA for å fullføre overflaten formasjonen .
cellelinje som brukes og Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT116 og bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom cellelinje AsPC1 ble opprinnelig kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC, Taiwan) og brukes som EpCAM positiv cellelinje. Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM for HCT116, Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) eller RPMI-1640 (for AsPC1; Gibco) med 1% antibiotisk-antimykotisk (ThermoFisher Scientific) og 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco) under 5% CO
2 fuktig atmosfære. De HCT116 kreftceller ble pre-farget med CellTracker Grønn CMFDA fargestoff (Life Technologies, Carlsbad, California) eller ektopisk uttrykk for rød fluorescens protein (RFP) før spiking eksperimenter. Sfæren kulturmedium (SPH medium) ble formulert som 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, Gibco), 10 ng /ml fibroblast vekstfaktor (FGF, BD Biosciences, San Jose, CA), 10 ng /ml insulin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og B27 (Gibco) i serumfritt DMEM medium. De eluerte levedyktige celler ble deretter dyrket enten under komplett DMEM-medium eller SPH medium med normal festekulturskål (Corning, Corning, New York) eller suspensjonskultur ved hjelp av en ultra-lav festeplate (Corning). Levende /Døde analyse (Life Technologies) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Den HS68 hud-avledede ikke-tumorigen human-fibroblast-cellelinjen ble opprettholdt i lav glukose DMEM-medium (Gibco) med 1% antibiotika og 10% FBS. For cellelinjene som brukes i dette manuskriptet, ble det HCT116 og AsPC1 opprinnelig kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC, Taiwan).
Capture Effektivitet Test av CMX Platform
fangsteffektivitet av CMX-plattformen ble karakterisert ved hjelp av menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT116. De HCT116 enkeltceller pre-farget med CellTracker Grønn CMFDA (Life Technologies) ble tilsatt i glassbunn brønner (Diameter: 6 mm, Høyde: 5 mm) og 10 min fikk for cellene å slå seg ned. Brønn bunner ble fotografert før og etter at cellene ble overført til fullblod oppsamlet fra friske individer ved fluorescens mikroskopi (Leica AF 6000 Advanced Fluorescens Imaging system) for å sikre nøyaktige tellinger. Det faktiske antallet piggete celler ble definert som (celle nummer i god tid før overføringen) minus (celle nummer igjen i brønnen etter overføring). Etter riktig, forsiktig blanding, ble celle-blod blanding strømmet gjennom de funksjonmicrochannel under strømningshastighet på 1,5 ml /time. Etterpå ble den microchannel vasket med 0,5 ml fosfat-bufret oppløsning (PBS) under 4 ml /time i gjennomstrømningshastighet og farget med 0,3 ml av Hoechst-løsning (1 mg /ml i PBS) for kjerner flekk. Kanalen ble fotografert under fluorescerende mikroskop (Leica DM16000B) å nummerere det totale antall celler fanget i kanalen. Kreftceller fange ytelse defineres som forholdet mellom antall HCT116-celler som er bundet på brikken til antall celler blir sendt til brikken. For testen av fangst og slipp effektiviteten av klase celler, ble ufullstendig fordøyd HCT116 cellene valgt av micromanipulator i henhold mikroskop som tidligere beskrevet [6] og ble direkte tilsatt i CMX-plattformen. For både cellelinje og klinisk prøver validering, ble CTCs og CTMer fanget under de samme eksperimentelle forhold med samme injeksjonsstrømningshastighet (1,5 ml /t) og PBS rensegrad (4 ml /h).
immunfluorescens Farging
de overførte celler, frigjort fra brikken på filtermembranen, ble fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,1% triton X-100 i 1 x PBS og blokkert med bovint serumalbumin (Millipore, Bedford, MA). Deretter ble cellene farget med kanin anti-humant cytokeratin 20 (CK20, Abcam, Cambridge, UK) og rotte-anti-human CD45 (Abcam) over natten ved 4 ° C og etterfulgt av vask PBS. Etter PBS-vasking ble cellene inkubert med FITC-konjugert geit-anti-rotte-IgG-antistoff (Abcam) og Alexa Fluor
® 568 anti-kanin-IgG-antistoff (Life Technologies) i 1 time ved romtemperatur, ble det overskytende antistoffene deretter fjernet av PBS vasking og fotografert av fluorescens mikroskop (Leica DM16000B). For farging av fibroblast celler, α-glatt muskel aktin (α-SMA, DAKO, Danmark) og fibroblast vekstfaktor reseptor (FGFR, Abcam) ble brukt som fibroblast markører.
Etikk Erklæring og kliniske prøver Collection
perifere blodprøver ble oppnådd fra 54 CRC pasienter med trinn I (n = 11), II (n = 13), III (n = 12) og IV (n = 18) uten forutgående behandling av kreft og tykktarm sykdomsfrie givere (n = 9) som negative kontroller ble inkludert i en dobbel blindet, prospektiv studie (31 kvinnelige og 32 mannlige). Totalt 2 ml av fullstendig blodprøve ble samlet ved etylen-diamin-tetra-eddiksyre (EDTA) vakuumrør (BD Biosciences) fra hver enkelt pasient, og ble brukt for både CTC og CTM fangst på en plattform for videre analyse. CRC-pasienter ble akseptert i denne studien har ingen tidligere kreftbehandlinger, som mottar blod trekke før operasjonen på den samme dag eller om dagen før operasjonen. De friske donorer ble bekreftet ved kolonoskopi undersøkelse uten kolonsykdommer og mottatt blodprøvetaking før prosedyren. Gjennomsnittlig alder av pasienter og friske donorer er 62 og 47 år, henholdsvis. Pasientene ble rekruttert fra juni til oktober 2012 i Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Alle prøver ble behandlet i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Den kliniske status og CTC resultater ble dobbeltblind. Studieprotokollen inkludert eksperimentell design og ytelse med denne studien var tydelig beskrevet og ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review styrene i Academia Sinica (AS · IRBOI-12040) og Chang Gung Memorial Hospital (100-1023B). Den skriftlige samtykke ble innhentet fra alle pasienter, inkludert friske frivillige og CRC pasienter før studien.
Molekylær analyse
Totalt 7 mutasjon hotspots av KRAS (G12V, G12D), p53 (R248W, R175H , R248Q), og APC (E1309fs * 4, 1556fs * 3) mutasjonsstatus ble oppdaget av kommersielt tilgjengelig TaqMan® mutasjonsdeteksjon analyse (Life Technologies) etter produsentens anvisninger. I korte trekk anvender analysen konkurrerende allel-spesifikk TaqMan PCR (castPCR teknologi). Hver villtype eller mutant allel assay var sammensatt av en modifisert eller umodifisert allel-spesifikk forover primer, locus-spesifikke TaqMan®-probe, locus spesifikk revers primer, og allel-spesifikk MGB blokker. Hver testprøve ble kjørt med et mutant allel assay (e) og det tilsvarende genet referanseanalyse. Resultatene ble analysert med sekv Detection System versjon 2.3 til å generere verdier for CT
mål og CT
referanse. Den detekterte ΔCT cutoff-verdi ble benyttet for å bestemme grensen for prosent mutasjon i en prøve som det mutante allelet analysen kan oppdage. Konverteringen formelen mellom% og ΔCT er 2
– (ΔCT) × 100%. Det mutante allelet analysesensitiviteten var 0,1%. Derfor er verdien av ΔCT ≤ 9,96 anses som positive og verdien av ΔCT 9,96 som negative.
Statistical Analysis
Ta effektivitet ble rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik. Gruppe midler ble sammenlignet med en uavhengig t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved 95% konfidensintervall (
p
0,05).
Resultater
Strategy av CTCs og CTMer Capture, Rensing, og Slipp
fangst, rensing og utslipp strategi utnytter SLBs å innlemme innfødte statlige proteiner [46-53] og fungere som et grensesnitt mellom den indre veggen av microfluidic chip og antistoff. De biomimetic SLBs iboende skape et smørende lag avvise blodkomponenter ( «non-fouling») og hjelpe til antistoffets mobilitet til å danne en utmerket celle fange plattform. I dette arbeidet ble et lag av antistoff for epitel-celleadhesjonsmolekyler (anti-EpCAM), klone EpAb4-1, er konjugert til SLBs for selektive CTCs fange [46]. Tidligere studier har vist at protein-konjugerte SLBs kan skape en utmerket cellesortering og kultur plattform; Videre, den laterale flytende av SLBs muliggjør gruppering av proteiner forsterker dermed bindingsaffiniteten og spesifisiteten til målcellene [47,49]. I tillegg er det zwitterioniske arten av lipidmolekyler i SLB reduserer ytterligere ikke-spesifikt protein og /eller celle adsorpsjon [48,49,54-56], for derved å redusere begroing av overflaten av perifert blod. Vi innlemmet anti-EpCAM-SLB overflaten i en microfluidic chip med etset mønster utformet for å forbedre kaotisk blanding [57]. Ved å styre fluidstrømningsparametre, vi først fange CTCs på overflaten og deretter øke strømningshastigheten av buffer for å redusere ikke-spesifikke adsorbert blodceller uten å forskyve noen av de bundne CTCs (figur 1A). Til slutt blir renset CTCs eluert fra brikken via forstyrre SLB sammenstillingen, ikke cellemembranen eller proteinbindingsseter, ved en svak kurve på luftskum. Denne kombinerte strategien er i stand til å utføre fangst og rensing av CTCs, senere som tillater dem å bli utgitt forsiktig for videre nedstrøms molekylær analyse eller dyrking. Oversikten og innstillingen av CMX plarform ble vist i figur 1B.
(A) Strategier for å fange, rense og slipp CTCs av CMX-plattformen. I den øverste raden, strømmer blodet gjennom en mikrofluidkanal belagt med anti-EpCAM konjugert til NeutrAvidin som er festet til en SLB lag på underlaget. Selektiv binding av CTCs til anti-EpCAM er forsterke ved de antistoff clustering effekter gjennom mobilitet av fluid SLB sjiktet, mens andre blodceller er lett i flukt bort fra fluidoverflaten. Den nederste raden viser utgivelsen prosess, der innførte luftbobler forstyrre de svakeste koblinger mellom underlaget og SLB laget, slik at eluere intakte CTCs for innsamling utenfor microfluidic chip. (B) Oversikt over CMX plattform og oppsummering av CMX plattformen arbeidsflyt. Ca 2 ml av fullblodprøver erholdt ferskt fra CRC-pasienter ble fylt jevnt i hver CTC fange enheter. Alle chips gikk gjennom celle fangst, rensing, og utgitt av ulike nedstrømsapplikasjoner, inkludert immunfluorescens farging, celletelling, molekylær analyse,
ex vivo
cellekultur og /eller cryobanking.
effektivitet av Target Cell innbinding og Capture
de indre veggene i microfluidic kanaler ble endret av lipid vesikler som består av POPC og b-PE og konjugert av b-EpAb4-1 via NA-biotin anerkjennelse [46]. En rekke microfluidic chips med ulike strømningsbaner, dimensjoner og mikrostrukturer ble fulgt med det samme overflatemodifikasjon (figur 2A). Menneskelig tykktarmskreft cellelinje HCT116 pre-farget med CellTracker Grønn CMFDA ble deretter tilsatt i 1 ml fullblod samlet fra friske individer i EDTA-rør for målcellen fangst i en funksjonmicrochannel og fulgte med PBS rensing og Hoechst atom farging. Den totale mengde av kreftceller som fanges opp av brikken ble deretter fotografert og telles under et fluorescens mikroskop. Den doble-positive celler med både CellTracker Grønn og kjernefysiske flekken ble identifisert som kreftceller. Singelen positiv atomflekk bare celler ble identifisert som uspesifikt bundet hvite blodceller (WBC). Fangst resultatene ble definert som forholdet mellom antall HCT116-celler som er bundet på brikken til det totale antall celler tilsatt i brikken [21].
(A) den geometri og mønstre av 6 forskjellige microfluidic kanal utførelser (til venstre) og fangsteffektiviteten av disse microfluidic plattformer (til høyre) som er definert ved å dele fanget celler i løpet av total piggete celler. (B) De avkuttede fluorescerende bilder (5,5 mm x 5,5 mm) inne i strømningskanalen og opptellingen av HCT116 (grønn) og WBC (blå) på Ab-SLB eller Ab-silane belagt Type E chips. (C) Celle løsgjøring effektivitet (%, Y-akse) mot strømningshastigheter (ml /h, nedre X-akse) og den tilsvarende skjærspenningen (øvre X-akse). Strømningshastigheter er vanligvis holdes under 4 ml /t for å unngå potensielle tap av fangede CTCs. (D) Sterkt CTM fangst og utvinning effektiviteten av Ab-SLB belagt chip. Den fangst effektivitet og utvinningsgrad på HCT116-RFP generert tumor microemboli var viste i panelet til høyre. De frigitte HCT116-RFP CTC klynger med DAPI farging var viste i venstre panel. *:
p
0,05; **:
p
0.01.
Figur 2A illustrerer geometrien og mønstre av 6 ulike microfluidic kanal design (type A til F). Type A er lineær form mikro-kanal uten mikro-mønstre, representerer Type B lineær form mikro-kanal med lineært ordnet mikro mønstre, representerer Type C lineær form mikro-kanal med dobbel rad lineært ordnet mikro mønstre, representerer Type D lineær forme mikro-kanal med alternative permutasjon lineære mikro mønstre, representerer Type E U-form mikro-kanal med alternative permutasjon lineære mikro mønstre, og Type F representerer firekanals microfluidic med alternative permutasjon lineære mikromønstre. Relative arbeider ble offisielt tildelt i september 2014 av US Patent and Trademark Office (US 20140255976 A1). De rette kanaler med enkle mønstre i henhold til samme lineære hastighet representere meget lav fange ytelse på grunn av den begrensede oppholdstid og mangel på blandingsstrømningsmønster: Rense utførelsen av type A brikke = 1,2 ± 0,6% og type B-brikken = 4,5 ± 2,2%. Når antall mikromønster øker for å skape effektiv blanding, fangingseffektiviteter øke vesentlig: Type C chip = 17,9 ± 3,0% og Type D chip = 33,5 ± 6,6%. Ytterligere dobling av kanalen lengden bare litt økt effektiviteten til 37,0 ± 10,5% (type E), mens 4 parallelle kanaler ytterligere forbedret fangsteffektiviteten til 93,7 ± 8,9% (type F). De skyter celle tall ble ytterligere senket til området ~ 5 til ~ 100 per 2 ml blod for å bekrefte linearitet av fangst ytelse i Type F chip (S1A figur).
Ikke-begroing Eiendom til SLB Coated Surface og Target Cell Rensing
For å ytterligere evaluere overflaten effekt, ble en type E chip belagt med konvensjonelle anti EpCAM tethered silan (Ab-silan) eller anti-EpCAM konjugert SLB (Ab-SLB). Figur 2B viser at fangst utførelsen av HCT116 er ca 15% av Ab-Silane belagt brikke, med over 2000 WBC er ikke-spesifikt bundet på brikken. Til sammenligning, det Ab-SLB belagt chip betydelig forbedret fangsteffektivitet og redusert ikke-spesifikk WBC på brikken.
Renheten av de fangede cellene kan forbedres ytterligere ved simpelthen å øke strømningshastigheten av PBS-buffer i flukt i en antistoff-belagt SLB chip. Etter hvert som strømningshastigheten for PBS økte prosentandelen av tilbakeholdt WBC sunket betraktelig. I vår undersøkelse av den høye skjærspenning fjerne 55 ~ 80% av WBC og samtidig beholde mer enn 90% HCT116 krever ~ 4-8 dyn /cm
2 (tilsvarende strømningshastigheter på ~ 5 til 10 ml /t, Fig 2C). Den skjærspenning som kreves for å rense målceller er vesentlig lavere enn det som ble rapportert i tidligere celle adskillelses studier basert på konvensjonelle antistoff-silanisert overflater og anses som lav nok til å ha minimal eller ingen virkning på cellelevedyktighet eller protein-ekspresjon [40,58]. Tvert imot, forble HCT116 bundet selv ved 50 ml /time på grunn av den sterke antistoff-antigen interaksjon (S1 film). For de kliniske prøver, valgte vi en mindre strømningshastighet på 4 ml /t for å unngå potensielle tap av CTCs.
Offentliggjøring av Captured Levedyktige Target Cells
Releasing levedyktige CTCs fra microfluidic chips er et kritisk trinn muliggjør enkel celle bevaring, cellekultur, og nedstrøms molekylær analyse. Tidligere forsøk ved hjelp av enzymatisk spalting [34,36] eller mekaniske krefter [40,58] for å løsne cellene har vist enten delvis frigjøring eller uunngåelig celledød, tilskrevet av brudd av antistoff-antigen bindinger eller membran ruptur. Den SLB er et lipid molekyl montering ved vann-faststoffgrenseflaten stabilisert ved innover hydrofobe-hydrofobe interaksjoner av lange hydrokarbonkjeder av lipidmolekyler og ytre hydrofile endegrupper som samvirker med vann eller hydrofile silisium oksid overflater (dvs. glass). Den SLB forsamlingen kunne lett oppløst ved å innføre en hydrofob komponent så enkelt som luftbobler. Vi tilbød en strategi for å forsiktig løsne limet CTCs uten å forstyrre de antistoff-antigen obligasjoner ved å injisere kontinuerlig luftskum til MicroFluidics (S2 Movie). Skum Løsningen ble skapt av en blanding av luft med cellekulturmedium og forsiktig blandet for skum skapelse. Den gjennomsnittlige utslipp effektivitet ved bruk av 250 mikroliter skummende løsning var 99,7% i 3 rapporter (S1B Fig). For å validere celle integritet frigjort fra microfluidic chips som bruker luft skum, HCT116 cellene ble pre-farget med CellTracker Grønn CMFDA og Texas Red-SLB ble brukt til overflatebehandling indikasjon. Etter utgitt av luftskum, ble cellene farget med DAPI nukleær flekk og fotografert i henhold til fluorescens mikroskop. Figur 3A viser at det eluerte cellen var innpakket av lipider, som indikerer celle frigivelse gjennom peeling av SLB av luft. Levende /Døde Analysen ble utført umiddelbart etter celle eluering; Resultatene viste 86% av det eluerte cellene forblir levedyktige i forhold til 0% levedyktighet fra den konvensjonelt belagte anti-EpCAM silanisert brikke (S2 Fig). Ved å innføre luft hydrofobe skum, kan skånsom frigjøring av den fangede CTCs gjøres uten å skade cellene. Som et resultat av den ikke-begroing SLB overflate bevares intakt celle morfologi og bundet levedyktige celler for videre etterforskning.
(A) fluorescerende bilder av HCT116 kreftcelle frigjøres fra Texas Red-SLB belagt chip. Cellen ble pakket med Texas Red-SLB lipidmolekyler rundt membranen (blå: DAPI, grønn: pre-farget CellTracker Grønn CMFDA, red: Texas Red konjugert lipid molekyl). (B og C) kledde fluorescerende bilder av den frigitte enkelt CTC og CTM for celle karakterisering. Eluted celler fra kliniske prøver ble kategorisert som CTC etter størrelse, morfologi og immunostainning (DAPI + /CK20 + /CD45-). WBCs ble identifisert ved DAPI + /CK20- /CD45 + farging (blå: DAPI, grønn: CD45, red: CK20).
Capture and Release av CTMer
For å validere evnen til Ab-SLB belagt microfluidic chip for CTMer fangst og slipp, RFP ectopically uttrykt HCT116 ble brukt.
ex vivo
kreft emboli ble simulert ved hjelp av ufullstendig fordøyelse av trypsin og valgt av micromanipulator i henhold mikroskop som tidligere rapportert [6]. Diverse antall valgte HCT116-RFP emboli ble tilsatt i de microfluidic sjetonger for ytterligere fangst og slipp effektivitet testing. De frigitte emboli ble så fotografert under fluorescerende mikroskop etter DAPI atom flekken (Fig 2D, venstre panel).
