Abstract
alternativt spleisede varianter av flere onkogener og tumor suppressorer har vist seg å være viktig for deres tumorgenisitet. I foreliggende studie har vi undersøkt hvorvidt serin-arginin proteinkinase 1 (SRPK1), en viktig regulator av spleising faktorer, er involvert i progresjon av kreft i eggstokkene, og spiller en rolle i kjemoterapi-følsomhet. Ved Western blot-analyser, ble SRPK1 protein funnet å være overuttrykt i 4 av 6 ovarie cancer-cellelinjer som sammenlignet med en immortalisert ovarial overflate epitelisk cellelinje; og i 55% av eggstokkene tumorprøver sammenlignet med ikke-neoplastiske eggstokkene vevsprøver. Reduksjon av SRPK1 uttrykk ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) som koder for liten hårnål RNA i eggstokkreft celler førte til (i) redusert celleproliferasjon rente, lavere cellecyklusprogresjonen og kompromittert forankringsuavhengig vekst og migrasjon evne
in vitro
, (ii) redusert nivå av fosforylering av flere serin-arginin-proteiner, og P44 /42MAPK og AKT-proteiner, og (iii) forbedret sensitivitet for cisplatin. Sammen disse resultatene tyder på at forhøyet SRPK1 uttrykk kan spille en rolle i eggstokkene tumorigenesis og SRPK1 kan være et potensielt mål for eggstokkreft terapi
Citation. Odunsi K, Mhawech-Fauceglia P, Andrews C, Beck A, Amuwo O, Lele S, et al. (2012) Forhøyet Uttrykk for den Serine-Arginine Protein Kinase en Gene i Eggstokkreft og dens rolle i Cisplatin Cytotoksisitet
In Vitro
. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10,1371 /journal.pone.0051030
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 04.09.2012; Akseptert: 23. oktober 2012; Publisert: 07.12.2012
Copyright: © 2012 Odunsi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants CA 107 303 (RH), Gynekologisk kreft Foundation (RH), DK60632 (JDB), og CA16056 (RPCI Kjerne Grant); Cancer Research Institute /Ludwig Institute for Cancer Research Cancer Vaccine Collaborative Grant (KO); og Hilton-Ludwig kreft metastase Grant av Ludwig Institute for Cancer Research (KO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er blitt anslått at 35-59% av humane gener er alternativt spleiset, noe som i stor grad bidrar til kompleksiteten av humane cellefunksjoner [1], [2]. Det er derfor ikke overraskende at aktiviteten til noen onkogener og tumorsuppressorgener moduleres ved alternativ spleising [3], [4]. For eksempel, avvikende alternativ spleising av visse tumor-suppressorer, for eksempel brystkreft 1 og 2 (BRCA1 /2) [5], Wilms tumor-1 (WT1) [6], og adenomatøs polypose coli (APC) [3], resulterer i mutasjoner som står for arvelig og sporadisk faren for kreft. I tillegg er enkelte skjøte faktorer blitt funnet å være overuttrykt i tumorer og har vært implisert som onco-proteiner [7], [8].
SRPK1 (serin-arginin proteinkinase 1) hører til SR kinase familie av proteiner og regulerer SR familien av spleise faktorer. De SR spleise faktorer er noen av hjelpeproteiner som er nødvendige for pre-mRNA-spleising i pattedyrceller. SR-proteiner er karakterisert ved en eller to RNA anerkjennelse motiver ved N-terminus og en SR-rik domene i C-terminus [9], [10], [11]. SR domene er antatt å fremme protein-protein interaksjoner under sammenstilling [12]. SR proteiner er regulert av reversibel fosforylering mediert av SRPK1. Mens fosforylerte SR proteiner er nødvendig for å initiere spliceosome montering på et så tidlig stadium, er defosforylering avgjørende for spleising til å finne sted i spliceosome [13], [14]. Bevis har vist at både hypo- og hyper-fosforylering av SR proteiner er skadelig for skjøting [14], [15]. Således er graden av SRPK1 avgjørende for å opprettholde den riktige balanse mellom fosforylerte og defosforylert SR proteiner. Overekspresjon av SRPK1 protein er blitt dokumentert i akutt typen voksen T-celle leukemi [16], kronisk myelogen leukemi [17] bukspyttkjertel, bryst og kolon-kreft [18], [19], [20]. Interessant er SRPK1 uttrykt hos voksne mannlige kjønnsceller, men vanligvis ikke i de fleste andre normalt voksent vev, noe som tyder på en kreft /testikkellignende fordelings [16], [21]. Sammen disse studiene tyder på at SRPK1 er sannsynlig å spille en viktig rolle i kreftutvikling.
[22] og andre [23] har tidligere funnet at inaktivering av
Sky1
, gjær homolog av skjøte faktor SRPK1, øker motstanden av gjærceller til cisplatin (CDDP). Men om SRPK1 ekspresjon spiller en rolle i å bestemme sensitiviteten eller motstanden av humane tumorer på kjemoterapi er fortsatt uklar av følgende grunner. For det første har lavere SRPK1 ekspresjon er vist å korrelere med motstand av ovarial [23], testiklene [20] og HT29 [24] tumorcellelinjer til platina-inneholdende behandlingsregimer. For det andre har det nylig blitt vist at forstyrrelse av SRPK1 ekspresjon av siRNA øker apoptose forårsaket av CDDP i pankreas, tykktarm og brystcancercellelinjer [18], [19].
I den foreliggende studie forsøkte vi å undersøke enten SRPK1 uttrykket er assosiert med kreft progresjon eggstokkreft, om uttrykk mønster av SRPK1 korrelerer med klinisk respons på behandling som involverer CDDP og om hemming av SRPK1 endrer følsomhets eggstokkreft celler til CDDP. Først fant vi at forhøyet SRPK1 proteinnivået var til stede i omtrent 55% av eggstokkene tumorprøver sammenlignet med ikke-neoplastiske eggstokkene vevsprøver. For det andre, siRNA-mediert hemming av SRPK1 ført til redusert OVCa celleproliferasjon sats,
in vitro
celle migrasjon, karsinogent potensial og tregere cellecyklusprogresjonen. Disse fenotyper var assosiert med SRPK1-mediert endringer av MAPK /AKT signalveier, siden nivået av fosforylert (aktivert) MAPK /AKT protein er redusert i de SRPK1 knockdown celler. Til slutt, i motsetning til gjær system, har vi gjort det overraskende observasjon at hemming av SRPK1 økt følsomhet for CDDP behandling, noe som tyder på at SRPK1 kan være et mål for terapi av eggstokkreft.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
studiet omfatter mennesker ble gjennomført under en protokoll godkjent av RPCI Institutional Review Board (CIC0215). Alle vevsprøver ble samlet fra pasienter som gitt skriftlig informert samtykke.
Pasienter og
Flash prøver Ovarian vevsprøver
frosne vev (n = 47) ble hentet fra pasienter som gjennomgår debulking kirurgi for epitelial eggstokkreft ved Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY mellom 1995 og 2006. Normal eggstokkene prøver (n = 9) ble innhentet fra pasienter som gjennomgår hysterektomier for godartede tilstander som leiomyoma. Clinicopathologic informasjon for hele kullet, inkludert respons på kjemoterapi, opprettholdes i en database ved Institutt for gynekologisk onkologi.
Cell Culture
eggstokkreft cellelinjer SKOV3 og OVCAR3 ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A2780 og A2008 celler og deres CDDP-resistente kolleger A2780 /CP [25] og A2008 /C13 [26] celler ble hentet fra Dr. Steven Howell (University of California, San Diego). Disse cellene ble opprettholdt i RPMI1640 medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS). En ikke-transformerte ovarie overflate epitelcellelinje (IOSE-385, heretter betegnet som IOSE) ble udødeliggjort med SV40 tidlig genene [27] og oppnådd fra Dr. Nelly Salzburg (University of British Columbia, Canada). IOSE celler ble opprettholdt i M199 /MCDB 105 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplert med 5% FBS og gentamycin (Invitrogen, Carlsbad, California).
shRNA og redning-SRPK1 konstruerer
shSRPK1-1 og shSRPK1-2, kodings shRNA rettet mot nukleotider 288-308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) og 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA), henholdsvis av SRPK1 mRNA, ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). For transfeksjon, SKOV3 og A2780 /CP-celler ble sådd ut i 6-brønns plater til 80% konfluens og transfektert med 3-4 ug av plasmid-DNA ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA og proteiner fra kontroll eller shSRPK1-transfekterte celler ble analysert 3 dager etter transfeksjon. Stabile shSRPK1 kloner ble valgt å bruke 2 mikrogram /ml puromycine i 3 uker. For SRPK1-redning plasmid, en primer som inneholder 3 silenct mutasjoner (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, understreking nukleotider ble endret til G, G, C, henholdsvis) innenfor shSRPK1-1 målsekvenser ble innført i p-CMV-flagg-SRPK1 plasmid (en gave fra Dr. Xiang-Dong Fu, University of California, San Diego) ved hjelp av asymmetrisk PCR [28]. Transfeksjon ble utført som beskrevet ovenfor, og stabile kjegler ble valgt ved hjelp av G418 (Invitrogen, Carlsbad, California).
Kjemi
Cisplatin (CDDP,
cis
-diammine-diklor- platina II) og MTT {3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid} ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Stock CDDP oppløsning ble fremstilt i DMSO (330 mM), lagret som alikvoter ved -20 ° C, og anvendes innen 2 uker. CDDP ble videre fortynnet i medium før tilsetning til cellene.
Western Blot analyse
tjue til tretti milligram av frosne tumorvevet ble homogenisert med en morter og støter i vev prøvebuffer (10% SDS , 5% β-merkaptoetanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10% glycerol) for proteinekstraksjon. Cellelysatene ble ekstrahert ved bruk av RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksykolsyre, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Proteiner ble oppløst ved 10% SDS-PAGE, overført til PVDF-membran (Milipore, Billerica, Massachusetts) og blokkert i TBS inneholdende 0,05% Tween-20 og 5% tørrmelk over natten ved 4 ° C. Blottene ble inkubert med primært antistoff i 1-2 timer, og deretter med peroksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubasjon ble membranene vasket gjentatte ganger og proteiner ble visualisert ved hjelp av ECL (forbedret kjemiluminescens) kit (Pierce, Rockford, IL). Signal var digital fotografert og kvantifisert ved hjelp densitometry med en Alpha imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Antistoffer anvendt for å detektere SRPK1 var fra BD Biosciences (San Jose, CA), fosforylerte SR proteiner var mAB104 [29] isolert fra hybridomceller (ATCC, Manassas, Virginia), total P44 /42 MAPK og AKT (akt1 /2/3 sc-8312) var fra Cell Signaling (Danvers, MA) og Santa Cruz, henholdsvis fosforylert MAPKp42 /44 (Thr
202 /Tyr
204) og AKT (Ser
473 /Thr
308) var fra Cell Signaling (Danvers, MA), antistoff mot Upf1 var en gave fra Dr. Harry Dietz (Johns Hopkins University). Anti-aktin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Data ble uttrykt som relativ fold uttrykk i løpet av aktin.
immunhistokjemisk farging
Avsnitt (4 mikrometer tykke) fra formalinfiksert, parafininnebygd normal eggstokk og svulstvev ble behandlet for IHC som beskrevet tidligere [30]. Endogen peroksidase ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksidase i 30 minutter. Antigen henting ble utført i høy pH buffer i en dampbåt for SRPK1 antistoff (BD Biosciences). For negativ kontroll ble mus-IgG anvendt.
Revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) Analyse
Total RNA ble ekstrahert fra ti millioner celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra 2 mikrogram total RNA i 20 ul reaksjonsbuffer ved hjelp av M-MuLV revers transkriptase, Ribolock ribonukleasehemmer (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) og tilfeldige heksamerprimere etter DNaseI fordøyelsen. CDNA produkter ble brukt for semi-kvantitativ PCR hjelp Taq DNA polymerase (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) De primere for SRPK1 (SRPK1-R, 5′-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, og SRPK1-exon10, 5’CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) ble utformet i henhold til NCBI referansesekvenser. GAPDH (glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase) ble brukt som referanse mål sekvens (primere: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC og 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC).
klonogene Survival analysen
Cells (3 × 10
2) ble sådd i 6-brønns plater over natten og behandlet med CDDP i 24 timer. Etter fjerning av medikamentet, ble cellene vasket med PBS og på nytt tilført medikament-fritt medium og inkubert i 10-14 dager. Koloniene ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet. Prosentvis celleoverlevelse er uttrykt i forhold til ubehandlet kontroll.
MTT-analysen
Celler (5 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater i triplikat over natten og behandlet med CDDP i 72 hr, MTT ble lagt inn i 4 timer, og formazanforbindelsen fargestoff ble oppløst med DMSO og lese ved 540 nm i en FL6000 mikroplateleser (Bio-TEK Instruments, Winooski, VT). Prosentvis celle overlevelse er uttrykt i forhold til ubehandlet kontroll.
Anchorage uavhengig Vekst analysen
Cells (5 × 10
3) ble sådd i tre eksemplarer i 6-brønners plater som inneholder et topplag 0,3% myk agar og 0,5% agar basen. Tjuefire timer senere, ble det gjennomsnittlige antall celler sådd i hvert felt bestemmes ved å telle celler i 5 forskjellige områder under lysmikroskop. Kolonier dannet ( 0,1 mm i diameter) etter 3 uker med vekst i myk agar ble talt; 10 forskjellige felt ble kvantifisert per brønn og gjennomsnittlig antall kolonier pr feltet beregnes. Den AIG (forankringsuavhengig vekst) indeks ble uttrykt i forhold til antall celler sådd.
sårtilheling (Skrape) Analyse
Celler ble sådd i 60-mm plater til samløpet og cellen mono ble skrapt i tre rette linjer med en 200-mL pipette for å lage «riper». Avfallet ble fjernet med PBS og deretter kultur ble på nytt tilført friskt medium. Photohgraphs av sårområdet ble tatt ved 0 og 28 timer etter at riper for å beregne cellemigrering hastighet. Tjue tilfeldige målinger ble tatt for hvert tidspunkt. De relative trekkende avstander på såret områdene ble målt på bildene.
Cell Cycle Analysis
Celler ble synkronisert på G2 /M fase ved behandling med nocodazol (600 ng /ml) i 12 timer , vasket to ganger med PBS og deretter sluppet ut i medium uten medikament. Celler ble også synkronisert ved G0 /G1 ved å plassere i serumfritt medium i 48 timer. De hvilende celler ble stimulert på nytt gå inn i cellesyklus ved tilsetning av 10% FBS. Ved hver indikert tidspunkt ble cellene oppsamlet og vasket med kald PBS (fosfat-bufret saltvann og fiksert i 70% etanol i mer enn 15 min). Cellene ble deretter behandlet med RNase (50 ug /ml) i 1,0% natriumcitrat ved 37 ° C i 30 minutter og deretter farget med propidium iod (50 ug /ml) i 15 min. DNA-innhold ble målt med en fluorescens-aktivert celle analysator (FACScan-strømningscytometer, Becton Dickson, San Jose, CA). Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved hjelp av WinList og ModFit programmer (Verity Software House, Topsham, ME).
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism V4.03 programvare og R V2.7.0 Statistiske Computing Environment. En
p
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Elevens
t
-test ble brukt for de fleste sammenligninger av SRPK1 RNA og protein uttrykk vs clinicopathological parametere. Metodene for Kaplan og Meier og Cox ble brukt til å beregne median overlevelse og hazard ratio.
Resultater
SRPK1 Expression er forhøyet i visse ovarialcancer cellelinjer og ovarietumorer
Vi har tidligere funnet at inaktivering av gjær SR proteinkinasen Sky1p gir resistens mot cisplatin [22]. Imidlertid har nivået for det humane genet SRPK1 vært både positivt og negativt korrelert med motstand av tumorceller til behandlingsregimer som inneholdt platina [18], [19], [20], [23]. Vi setter ut for ytterligere å undersøke forholdet mellom ekspresjonsnivået av genet SRPK1 og CDDP motstand i human ovarian cancer (OVCa). Vi først brukt en semi-kvantitativ RT-PCR (revers-transkriptase polymerase chain reaction) analyse for SRPK1 RNA uttrykk i 6 OVCa cellelinjer med differensial CDDP følsomhet (Figur 1A, nedre panel). Noen av dem var minst 6 ganger mer motstand mot CDDP enn en ikke-transformert ovarie overflate epitelcellelinje (IOSE) som var blitt udødeliggjort med SV40 tidlig genene [27]. Dataene viser at det var ingen klar sammenheng mellom CDDP motstand fenotype og RNA-nivåer av disse genene hos disse cellelinjene. Imidlertid SRPK1 mRNA-nivået ble forhøyet i fire av seks cellelinjer, sammenlignet med den for IOSE celler (figur 1A). Vi neste vurdert SRPK1 proteinekspresjon i de ovennevnte cellelinjer ved hjelp av Western blot-analyse. Det relative nivå av SRPK1 protein ble bestemt ved normalisering med den for husholdningsgenet aktin. Figur 1B viser at SRPK1 protein er også forhøyet i fire av seks ovarie carcinom cellelinjer (definert som 2-fold over gjennomsnittet for IOSE prøven), men med litt forskjellig mønster fra den til RNA. Vi la merke til at udødeliggjort IOSE celler uttrykker også viss SRPK1. Dette er ikke overraskende siden andre har også vist at immortalisering av ovarian epitelceller, sammenlignet med de ikke-immortaliserte normale humane OSE celler, øker ekspresjon av et spleise faktor, polypyrimidine kanal-bindende protein [8]. Ligner på mRNA uttrykk, fant vi ingen klar sammenheng mellom CDDP motstand fenotype og SRPK1 proteinnivå blant disse cellelinjene. Siden genet nivåer i lang sikt dyrkede cellelinjer kan bli endret, vi neste undersøkt SRPK1 uttrykk i arkiv OVCa tumorprøver fra OVCa pasienter som ble behandlet med platina-regimer etter operasjonen. For å bedømme den spesifikke ekspresjon av SRPK1 proteinet i tumor epitel på cellenivå, utførte vi immunhistokjemisk farging (IHC) på parafininnstøpte vevssnitt. Figur 2A viser at SRPK1 flekker var nesten ikke-eksisterende i normal eggstokk epitel. I motsetning til dette ble SRPK1 farging lett påvises i ovarietumorer, med fargeintensitet som strekker seg fra svak til sterk, og presentere hovedsakelig i cytoplasma av epitelceller. Den cytoplasmatiske lokalisering av SRPK1 i OVC tumorprøver er lik funn i vev kultur celler [15]. Siden ovarietumorer er sammensatt for det meste av epitelceller, ble nivået av SRPK1 i protein homogenater fra 47 frosset tumor og samples ikke-neoplastisk vev 9 undersøkt ved hjelp av Western blot-analyse. Figur 2B viser immunobloting resultater fra 21 svulsten og prøver ikke-neoplastiske vev 9. Densitometrisk analyse av SRPK1 og actin-nivåer ble utført, og den relative ekspresjonsnivået av SRPK1 ble normalisert med nivået av aktin. Vi fant at 26 av 47 (55%) tilfeller overuttrykt SRPK1 (definert som mer enn to ganger over gjennomsnittet av de ni normale prøver).
(A) Kvantitativ sanntid revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse av SRPK1 RNA-nivå i 6 OVCa celler og IOSE celler. GAPDH ble brukt til lasting kontroller og normalisering. Femti prosent veksthemming konsentrasjon (IC
50, um) av CDDP for OVCa cellene ble indikert nedre panel). (B) Western blot-analyse av SRPK1 protein i 6 OVCa celler og IOSE celler. Den nedre bandet i blot undersøkt med anti-SRPK1 antistoff er trolig proteolytisk fragment av SRPK1. Blottene ble probet på nytt med aktin som ble anvendt som en kontroll lasting og for normalisering. Diagrammet representerer relative ekspresjon bestemt ved densitometrisk måling av bandene og er uttrykt i forhold til aktin. Bar-graf som vises er gjennomsnittet av 4 eksperimenter. Overekspresjon av SRPK1 i OVCa ble definert som mer enn to ganger over den gjennomsnittet av de IOSE prøvene og er merket med stjerner.
(A) Immunohistokjemisk farging for SRPK1 protein ekspresjon i normale og tumor eggstokk vevsdelene . Cellene farging positivt for SRPK1 antistoff er brune. For negativ kontroll ble vert-IgG brukt (ikke vist). E, epitel; S, stroma. (B) Western blot-analyse av SRPK1 protein i 21 eggstokktumorprøvene (T), og ikke-neoplastiske prøver (N) 9 ovarievev. De normale og tumorprøver i den nederste panelet ble avkuttet fra to forskjellige blots for formålet med presentasjonen. De lavere band i blot undersøkt med anti-SRPK1 antistoff er trolig proteolytiske fragmenter av SRPK1. (C) Box-Whisker tomt med SRPK1 /aktin fold uttrykk hentet fra densitometrisk analyse av bandene i Western blot analyse. Whiskers omfatte alle tumorer (n = 47) eller de vanlige prøver (n = 9), bokser inneholder 50% av data, og midtlinjene i boksene viser medianverdier. Mener uttrykket ble sammenlignet med Student
t
-test (p = 0,03).
De fleste av de 47 pasientene testet presenteres med karakteren 3 svulster (91%), på scenen IIIC (76%), og med serøs histologi (85%). Median overlevelse for alle pasienter var 39,7 måneder {konfidensintervall (CI), 26,5-∞ måneder}, mens median sykdomsfri overlevelse, unntatt pasienter med vedvarende /progressiv sykdom etter første behandling, var 17,5 måneder (CI, 14,4 til 35,9 måneder). Ved hjelp av en Cox regresjonsmodell vi ikke observere en klar sammenheng mellom SRPK1 nivå og samlet (p = 0,26) eller sykdom gratis (p = 0,62) overlevelse i ovarian kreftpasienter. SRPK1 nivåer ble ikke korrelert til histologi, klasse, eller klinisk respons på CDDP holdig kjemoterapi. Men den gjennomsnittlige relative fold uttrykk for SRPK1 protein var signifikant forskjellig mellom tumorprøver og vanlige prøver (Figur 2C, uavhengige utvalg t-test, p-verdi = 0,03). Dermed våre data tyder på at forhøyet nivå av SRPK1 protein uttrykk er en hyppig hendelse i eggstokkene epiteliale kreftformer.
redusere nivået av SRPK1 av Short hårnål RNA Forbedrer CDDP Cytotoksisitet
Det er vist at forstyrrelse av SRPK1 uttrykk av små interfererende RNA øker apoptose forårsaket av CDDP i bukspyttkjertelen, tykktarm og brystkreft cellelinjer [18], [19]. For å teste om knockdown av SRPK1 genet i OVCa celler påvirker deres følsomhet for CDDP, målrettet vi dette genet på to stillinger i kinase domene med to forskjellige konstruksjoner av kort hårnål RNA (sh-SRPK1-1 og sh-SRPK1-2) i SKOV3 og A2780 /CP-celler, som begge er forholdsvis mer motstandsdyktig mot CDDP enn IOSE celler og enkelte andre OVCa cellelinjer (figur 1A). Som kontroller, ble vektoren pSM2-EV også transfektert i begge cellelinjer. Transient transfeksjon (48 timer) av enten konstruere spesifikt redusert SRPK1 mRNA (data ikke vist), og proteinnivå som bekreftet av reprobing de Western blot med antistoff mot et ikke-beslektet protein, Upf1, og aktin ble benyttet som en laste kontroll (figur 3A). Den inhiberende effekt av den shSRPK1-2 konstruksjonen er mer betydningsfull enn den shSRPK1-1. Ved hjelp av formazan farge (MTT) analyse, viser figur 3B at å redusere SRPK1 protein i SKOV3-celler resulterte i forbedret sensitivitet for behandling CDDP (paret t-test og * angir P 0,05). For ytterligere å studere chemo-allergifremkallende effekten av å hemme SRPK1, genererte vi stabile kloner med forskjellige shRNA potenser i SKOV3 celler. Vi har oppnådd flere kloner med redusert SRPK1 mRNA og protein som bestemt ved RT-PCR og Western blot-analyse, respektivt. To av dem er vist i figur 3C hvor SRPK1 proteinnivået ble redusert til ca 60% (pshSRPK1-c4, målrettet av sh-SRPK1-2) eller 20% (pshSRPK1-c5, målrettet av sh-SRPK1-1) til styrings pSM2-EV celler. SRPK1 nivåer i disse klonene korrelerer inverst med sin CDDP følsomhet som bestemt ved kolonidannelse analysen (figur 3D). Disse dataene indikerer at SRPK1 spiller en rolle i moduler CDDP cytotoksisitet
in vitro Hotell og at målretting nukleotider 288-308 av SRPK1 mRNA resultert i en sterkere lyddemping effekt.
eggstokkreft celler var forbigående ( A) eller stabilt (C) transfektert med enten siRNA-kodende shSRPK1 plasmid eller tom vektor (pSM2-EV). Protein nivåer av SRPK1, UPF1 og aktin ble bestemt ved Western blot analyse. Representative blotter fra tre uavhengige eksperimenter er vist. (B) og (D) SRPK1 knockdown forbedrer cisplatin cytotoksisitet. (B) Celler (5 x 10
4) ble sådd på nytt 24 timer etter transfeksjon, ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i 48 timer og antall overlevende celler ble analysert ved MTT-analyse. Overlevelse (%) ble uttrykt i forhold til ikke-behandlede pSM2-EV-celler. (D) Stabile transfektanter (3 x 10
2) ble sådd i tre eksemplarer, ble behandlet med cisplatin i 24 timer og kolonidannelse ble vurdert etter 10-14 dager. Data ble analysert med enveis ANOVA og * indikerer P 0,05; barer, SD.
knockdown av SRPK1 Expression Redusert celleproliferasjon og
in vitro
Svulst Potensiale SKOV3 Cells
Data vist i figur 3D viser også at celler med redusert SRPK1 uttrykk ved shRNA vokste saktere enn kontroll pSM2-EV celler. De dannet færre kolonier enn den ikke-behandlede kontrollgruppen i fravær av CDDP behandling. For ytterligere å teste om å redusere SRPK1 uttrykk hemmer eggstokkreft celleproliferasjon, doblingstiden pSM2-EV og pshSRPK1-C5 celler ble sammenlignet. Celleproliferasjon hastigheten ble bestemt i eksponentielt voksende celler ved trypsinering og trypan blått fargestoff utelukkelse ved 24, 48, 72 og 96 timer etter plettering. Figur 4A viser at doblingstiden pshSRPK1-c5 er omtrent 1,4 ganger av kontroll pSM2-EV-celler (31 hr vs. 22 timer). Dette ble bekreftet ved MTT-analyse (data ikke vist). Vi neste undersøkte tumorigent potensialet SRPK1 hjelp av forankringsuavhengig-vekst (AIG) analyse. SRPK1 knockdown og kontroll-celler ble sådd i bløt agar og tillatt å vokse i 3 uker. Figur 4B viser at både shSRPK1 kloner produsert færre og mindre kolonier i soft agar, tyder på en reduksjon i
in vitro
tumorigenicity. Cellemotilitet er en av faktorene som bidrar til tumorcelle invasjon. For å teste om cellemigrasjon evne er kompromittert i SRPK1 knockdown celler, ble en
in vitro
celle migrasjon (sårheling) analyse utført. Figur 4C viser at den gjennomsnittlige migrasjonsrate for shSRPK1-C5-celler (5,8 ± 0,81 enhet) var omtrent 60% av det for kontroll pSM2-EV-celler (9,9 ± 1,5 enhet). Sammen våre data tyder på at SRPK1 bidrar til celleproliferasjon,
in vitro
celle migrasjon og tumorigent potensialet Skov celler.
(A) Celleproliferering analysen. -Celler (1 x 10
4) ble sådd ut i triplikat i en 24-brønns plate, trypsinert og telt i nærvær av trypan blå ved de angitte tider. (B) krings-uavhengig vekst analysen. Celler (5 × 10
3) ble sådd i myk agar og koloni antall ble bestemt 21 dager senere. Representative felt av kolonier i myk-agar-plater er også vist. Dataene som vises er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter og ble analysert med paret t-test; * Viser P 0,05, barer, SD. SKOV3-celler ble sådd ut som en positiv kontroll. (C)
In vitro
sårheling analysen. Konfluente celler ble skrapet med en 200 mL-tip til å generere rette linje-hull. Bilder fra hullene ble tatt ved 0 og 28 timer, og bredden av spaltene (hvitt stiplede linjer) ble målt under et lysmikroskop for å beregne hastigheten av cellemigrering. Representative bilder vises på venstre og relative utvandrende avstander (lukking av sår) vises til høyre ble beregnet ut fra 20 områder fra hver plate. Data som vises er fra tre uavhengige forsøk.
Stjernene
viser signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05).
knockdown av SRPK1 Expression Redusert fosforylering av visse SR Proteiner og MAPK /AKT Proteiner
SR proteiner er de direkte målene for SRPK1 [15]. Fosforyleringen mønster av disse SR skjøte faktorer forventes å bli påvirket i SRPK1 knockdown-celler. For å teste denne spådommen, Western blot analyse ved hjelp av en pan antistoff som gjenkjenner en fosfor-spesifikk epitop felles for flere SR proteiner [29] ble utført. Som forventet, redusert SRPK1 uttrykk resulterte i redusert nivå av fosforylering av visse SR proteiner i SKOV3 celler (Figur 5, midtre panel). Det er interessant å merke seg at ulike SR proteiner påvirkes mellom shSRPK1-C4 og shSRPK1-C5 kloner. For eksempel, ble nivået av SRp55 redusert mye mer i shSRPK1c5 enn i shSRPK1-C4-celler. Det motsatte er tilfelle for SRp40 og SRp20. Differensialknockdown av SRPK1 observert i disse to kloner (figur 5, topp panel) kan forklare forskjellene i substratet fosforylering. Nivået av den SRPK1 enzymet kan bestemme dets substrat gjenkjennelse og katalytisk aktivitet. Forskjellene i SRPK1 nivå mellom shSRPK1-C4 og shSRPK1-C5 kloner er også reflektert i celleproliferasjon og følsomhet for cisplatin (se nedenfor) påvirkes av SRPK1 downregulation.
Western blot analyse ble utført på lysatene fremstilt av SKOV3 avledede pSM2-EV celler og to stabile SRPK1-knockdown kloner. Antistoffer ble brukt til å oppdage de fosforylerte SR proteiner (mAB104), MAPK42 /44 (Thr
202 /Tyr
204), og AKT (Ser
473 /Thr
308) samt total protein nivåer MAPK42 /44, og AKT.
Det er velkjent at aktivering, dvs. forhøyet nivå av fosforylering av MAPK (mitogen-aktivert protein kinase) og AKT signalveier er involvert i mange ondartede sykdommer ( 29, 30), og at disse banene regulere pre-mRNA-prosessering [31], [32]. Fosforyleringen mønster av de to sentrale transdusere av spredningssignaler, P44 /42-MAPK (ERK1 og ERK2) og AKT ble analysert i SRPK1 knockdown cellene. Figur 5 viser at pshSRPK1-C4 og C5-pshSRPK1 celler hadde reduserte nivåer av fosforylert P44 /42-MAPK (p-MAPK) og AKT (p-AKT) proteiner. I motsetning til dette ble den totale mengden av MAPK og AKT proteinene ikke påvirkes av inhibering av SRPK1 uttrykk. De reduserte nivåer av fosforylert P44 /42-MAPK og AKT korrelert med langsommere vekst av SRPK1 knockdown-celler (figur 4). Disse dataene antyder at SRPK1 spiller en rolle i å regulere nivået av aktiverte former av MAPK og /eller AKT proteiner.
SRPK1-knockdown Cells Exhibit Tregere cellecyklusprogresjonen
Data beskrevet ovenfor indikerer at hemming av SRPK1 fører til langsommere cellevekst og redusert fosforylering av visse MAP kinaser, som er viktige regulatorer av cellesyklusprogresjon.
