Abstract
Målet med studien
For å vurdere hyppigheten av MRE11 /RAD50 /NBS1 (MRN) -kompleks tap av protein uttrykk i livmorkreft (EC) og for å fastslå om tap av MRE11 gjør kreftcellene følsomme for Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitorisk behandling.
Metoder
MRN uttrykk ble undersøkt i 521 prøver av endometrial karsinomer og i 10 kreftcelle linjer. En antatt mutasjon hotspot i form av en intronic poly (T) allelet i MRE11 ble sekvensert i utvalgte saker (n = 26). Følsomhet for PARP-hemmere, ble BMN673 testet i kolonidannelse analyser før og etter MRE11 lyddemping ved hjelp av siRNA. Homolog rekombinasjon (HR) DNA-reparasjon ble evaluert av RAD51-foci formasjon analysen ved bestråling og medikamentell behandling.
Resultater
Tap av MRE11 protein ble funnet i 30,7% av EC svulster og signifikant assosiert med tap av RAD50, NBS1 og mismatch reparasjon protein uttrykk. En endometrial cellelinje viste en markert redusert MRE11 uttrykk på grunn av en homozygot poly (T) mutasjon av MRE11, og dermed viser en økt følsomhet for BMN673. MRE11 uttømming sensitizes MRE11 uttrykker EU-cellelinjer til behandling med BMN673. Den økte følsomheten til PARP-hemming korrelerer med redusert RAD51 foci formasjon ved ioniserende stråling i MRE11-utarmet celler.
Konklusjon
Tap av MRE11 protein spår følsomhet for PARP-hemmere følsomhet in vitro, å definere det som et nytt syntetisk gen dødelig med PARP. Den høye forekomsten av MRE11 tap i egenkapitalbevis kan potensielt utnyttes for PARP-hemmere. Videre kan MRE11 protein uttrykk ved hjelp av immunhistokjemi bli etterforsket som en prediktiv biomarkør for PARP-hemmere behandling
Citation. Koppensteiner R, Samartzis EP, Noske A, von Teichman A, Dedes jeg, Gwerder M, et al. (2014) Effekt av MRE11 Tap på PARP-inhibitor følsomhet i livmorkreft
In Vitro
. PLoS ONE 9 (6): e100041. doi: 10,1371 /journal.pone.0100041
Redaktør: Sue Cotterill, St. Georges University of London, Storbritannia
mottatt: 10 november 2013; Godkjent: 21 mai 2014; Publisert: 13 juni 2014
Copyright: © 2014 Koppensteiner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis finansiert av Julius Müller Foundation og Zürich Cancer League. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EF) er den fjerde vanligste kreftformen blant kvinner. Flertallet av ECS diagnostiseres på et tidlig stadium og er forbundet med meget gunstig prognose samlet [1]. Behandlingstilbud, men for lokalavansert, residiverende eller metastatisk egenkapitalbevis, er begrenset, og består i hovedsak av cytostatika, [1]. Potensielle målrettede behandlinger er under klinisk utprøving, men har ennå ikke blitt innlemmet i rutinemessig klinisk bruk [2].
EC er en heterogen sykdom med distinkte histologiske og molekylære egenskaper [2]. Så langt, EC er blitt klassifisert i type I og II. Dette er basert på de forskjellige histologiske egenskaper (endometroid versus ikke-endometrioid) og på den kliniske prognosen (gunstig vs. dårlig) [2], [3]. I tillegg forskjellige molekylære endringer skje gjenom enten type I eller type II EF (anmeldt i [2]). Mens type I svulstene er preget av mikro ustabilitet (MSI) og polymutations i ulike typer gener, nesten alle type II svulster havnen mutasjoner av tumorsuppressorgenet
TP53 product: [4]. Nylig har nye molekylære undergrupper blitt beskrevet på en måte beslektet med brystkreft [5]. Basert på deres mutasjon profil og kopiere-nummer endrer egenkapitalbevis er inndelt i. Det ultramutated, den hypermuted, kopiantallet lavt og kopiantallet høy undergruppe [5]
hypermutated undergruppe omfatter hovedsakelig endometrioid EC, alle mikro ustabilitet husing (MSI). Disse svulstene er kjent for å utvikle mutasjoner i ulike andre gener (hypermutated genom), men også de som er involvert i DNA-dobbel tråd pause (DSB) reparasjon av veier [6]. En av de vanligste tilbakevendende mutasjonen er funnet i
MRE11 genet
, hvis produktet er en del av MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) – kompleks som er involvert i deteksjon og reparasjon av DNA dobbel tråd pauser (DSB sin) [7], [8].
MRE11
kimlinje-mutasjoner som forårsaker en dødelig fenotype hos mus [9] er sjelden hos mennesker og føre til en ataxia telangiectasia liknende lidelse (ATLD) [10]. Somatiske mutasjoner i
MRE11
, derimot, er ofte påvist i kolorektal kreft med MSI, og har også blitt foreslått for MSI-positiv egenkapitalbevis [11]. Mutasjoner av intronic poly (T) sekvens av
MRE11
mellom eksonene 4 og 5 er hyppige hendelser i MSI positiv kolorektal und ECS [11], [12]. I EC, MSI til stede i mer enn 20% av svulster og er hovedsakelig forårsaket av epigenetisk stanse av MMR-genet
MLH1 product: [13]. Dette fører til endringer i antall nukleotid-repetisjoner som finnes i kodende og ikke-kodende elementer av mange gener som for eksempel
MRE11 product: [14].
Synthetic letalitet oppstår når to individuelt forekommende mutasjoner har ingen virkning på cellelevedyktigheten, men forårsaker celledød i kombinasjon [15], [16]. Inhibering av et syntetisk dødelig partner-genet i cancerceller som presenterer et syntetisk dødelig mutasjon kan vise seg å være et attraktivt strategi for å utvikle spesifikke anti-kreft medikamenter med minimale bivirkninger i friskt vev. Nyere studier har vist at kreft med tap av funksjon av
BRCA1
eller
BRCA2
vise utsøkt følsomhet for Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -inhibitors [17], [18]. Gitt at MRE11 er involvert i DNA DSB reparasjon gjennom MRN-kompleks, tap av funksjon av dette komplekset gjennom inaktive mutasjoner kan føre til følsomhet for PARP-hemmere [19]. PARP1, en DNA-reparasjon enzym, har vært innblandet i reparasjon av DSB sin. PARP hemming fører til apoptose eller alderdom i celler hvor DNA-reparasjon ved homolog rekombinasjon (HR) er svekket (syntetisk dødelighet). For denne studien brukte vi en potent selektiv PARP1-hemmer BMN673, som har vist svært oppmuntrende resultater i fase I /II studier [20].
Her viser vi at MRN er ofte tapt i EU, noe som fører til økt PARP hemmer følsomhet. Dette kan utnyttes for behandling av pasienter med EC husing tap av MRN-komplekset. Målet med denne studien er å vise frekvensen for tap av MRE11 og MRN-kompleks i EF og om dette fører til økt følsomhet for PARP-hemmere utnytte
MRE11
som en potensiell syntetisk dødelig gen.
Materialer og Metoder
microarray
microarray (TMA) med formalinfiksert og parafininnebygd endometrial karsinom ble bygget tidligere [21]. To kohorter fra Institutes of Surgical patologi, Universitetet Sykehus Basel og Zürich (Sveits) som inneholder 339 (Basel-TMA) og 182 (Zurich-TMA) kreftprøver ble inkludert i denne studien. Kliniske og patologiske egenskaper ble tatt fra de kliniske databaser og patologi poster. Rutine hematoxylin og eosin seksjoner ble utført for histopatologisk evaluering. Scenen av svulster ble vurdert i henhold til International Federation of gynekologi og obstetrikk (FIGO) og TNM staging system. Histologisk subtype og tumor grad ble definert i henhold til WHO klassifisering 2003. Oppfølgings data er kjent fra 480 pasienter. Median oppfølgingstid var 31,5 måneder (range, 1-184) for Basel kohort, og 45 måneder (variasjon, 1-124) for Zürich kohort. Pasienter med lokalisert sykdom ble behandlet av hysterektomi og bilateral salpingectomy (med eller uten bekken og paraaortic lymphadenectomy). Vaginal strålebehandling ble postoperativt gis når invasjonen i livmoren eller tumor grad 3 var tydelig. Studien ble godkjent for begge kohorter av lokale vitenskapelig etisk komité (KEK-ZH-NR: 2010-0358). Baseline karakteristikker av pasienter med EC er oppsummert i tabell 1.
Immunohistochemistry
Etter antigen henting, ble platene inkubert med følgende antistoffer: MRE11 (klon 31H4, cellesignalisering, ingen . 4847, 1:500), RAD50 (13B3 /2C6, Abcam begrenset, nei. ab89, 1:500), NBS1 (cellesignalering, nei. 3002, 01:50), MLH1 (G168-15, PharMingen, Becton Dickinson , 1:100), MSH2 (25D12, Novocastra Lab. Ltd, 1:100), PMS2 (A16-4, PharMingen, Becton Dickinson, 1:300), og MSH6 (44, BD Biosciences, 1:500). Etter inkubasjon i 1 time ved værelsestemperatur ble det farging av MRE11, RAD50, og NBS1 videre utført med Ventana Referanse automatisert system (Ventana Medical Systems, USA) ved bruk av Ventana reagenser samt UltraMap DAB deteksjon kit. Antistoffene mot de mismatch repair proteiner ble inkubert i 30 minutter, og fargeprosedyre ble utført med den automatiserte Leica BOND system ved hjelp av Bond Polymer Spesifisert Detection Kit (Leica Biosystems). Uttrykket Analysen ble utført av to patologer (AN, KI). Atom immunoreaktivitets av MRE11, RAD50, og NBS1 ble scoret som: negativ (0), svak (1), moderat (2) og sterk (3). Proteinet ekspresjon av mismatch-reparasjonsgener ble betraktet som positive når nukleær farging var tydelig. Stromale celler som viser nukleær farging ble brukt som en positiv kontroll.
Kreft cellelinjer og vekstvilkår
EEC cellelinjer Hec-108 [22] og Hec-116 [22] ble dyrket i MEM, HEC 1A (ATCC) i McCoys, EFE-184 (DSMZ) i RPMI, AN3CA (ATCC) i DMEM, ARK-II [23] i DMEM, SNG-II [24] i DMEM, ECC-1 [25] i RPMI 1640, og var en gave fra Uwe Schirmer, DKFZ. HEC6-ST3 [22], dyrket i MEM, og KLE (ATCC), dyrket i DMEM /F-12, var en gave fra Jaqueline Galeas, UCSF. Mediene ble supplert med 10% (medium for ECC-1 med 5%) (v /v) føtalt bovint serum og enten med penicillin (100 U /ml) /streptomycin (60 mg /ml) eller antibiotika-antimykotisk, og opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære ved 5% CO2. All cellekultur materiale ble kjøpt fra Gibco av Life.
Immunoblotting
Hele celleproteinekstrakter ble preparert fra cellene lysert med en SDS lysebuffer. Western blotting ble utført med primære antistoffer mot MRE11 (D151, gave fra Steve Jackson, Cambridge), RAD51 (kanin polyklonale antistoff, Santa Cruz Biotechnology), NBS1 (mus monoklonalt antistoff, GeneTex), beta-tubulin (mus monoklonalt antistoff, Sigma) . Inkubering med det primære antistoff ble fulgt av inkubering med et HRP-konjugert sekundært antistoff (anti-mus og anti-kanin HRP fra Sigma, anti-sau HRP fra Santacruz) og kjemiluminescens deteksjon av proteiner (Amersham).
MRE11 mutasjon analyse
Thirteen MRE11 immunhistokjemi (IHC) positive og 13 IHC negative prøver ble valgt fra Zurich-kohorten for
MRE11
mutasjon analyse. Tre vev sylindere (diameter 0,6 mm) ble stanset fra hver parafin blokk for DNA-ekstraksjon. Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av DNeasy Blood 0,0001 for alle parametre). Men protein uttrykk for MRE11 (log rank p = 0,867), Rad50 (log rank p = 0,986) og NBS1 (log rank p = 0,991) var ikke assosiert med total overlevelse. Videre sekvensering av poly (T) 11 allel av
MRE11
i genomisk DNA fra EF-tumorer (n = 26; tabell 2) viste at mutasjoner var hyppigere i svulster med tap av MRE11 enn i de uttrykker MRE11 , men mutasjonsstatus var ikke svært forutsigbare for proteinet statusen MRE11
En negativ (fullstendig tap av MRE11 protein uttrykk.); B + (svak kjernekraft uttrykk); C ++ (middels atomkraft uttrykk); D, +++ (sterk kjernekraft uttrykk).
Tap av MRE11 er forbundet med høy følsomhet til PARP Hemming
Blant et panel av EF-cellelinjer, AN3CA utstilt nesten fullstendig MRE11 proteintap samt markert reduserte nivåer av RAD50 og NBS1 (fig. 2A). Sekvensering av den intronic regionen MRE11 i denne cellelinje bekreftet den tidligere beskrevne homozygot poly (T) 9 mutasjon i AN3CA (Fig. 2B) [11]. Ved PARP-hemmere behandling med BMN673 viser AN3CA høyeste følsomhet mellom panel av livmorkreft cellelinjer testet (Fig. 3C).
A, Western blot viser uttrykket status for MRE11, NBS1 og RAD50 i 10 endometrial carcinoma-cellelinjer. Bare cellelinje AN3CA havner en mutasjon av MRE11, noe som fører til en dramatisk redusert ekspresjon av MRE11. Tubulin ble brukt som lasting kontroll. B, kolonidannelse analyser som viser følsomheten til PARP-inhibitor (BMN673) i 10 endometrial carcinoma cellelinjer: Alle cellelinjer ble behandlet i tre paralleller i 14 dager. Overlevelse er representert i prosent av kontrollen (DMSO behandlet). Celle kolonier ble kvantifisert ved hjelp av en kolorimetrisk metode (SRB).
A, Effektivitet av siRNAs på ulike tidspunkter etter transfeksjon vist ved Western blotting. B, Sensitivity assay (kolorimetrisk med SRB): Alle cellelinjer ble behandlet med PARP-inhibitor (BMN673) i tre paralleller i 14 dager. Overlevelse er representert i prosent av kontrollen (DMSO behandlet). Slå ned på MRE11 med tre ulike sett med sirnas føre til økt følsomhet overfor PARP hemming i livmorkreft cellelinjer HEC1A (8-dobling, p 0,0001) og HEC-116 (6-dobling, p = 0,0006). C, Cellelinjer ble behandlet med den MRE11-inhibitor mirin ved en sluttkonsentrasjon på 30 uM i tre paralleller i 10 dager. Overlevelse ble målt ved en kolorimetrisk assay følsomhet (SRB) og er vist i prosent av kontrollen (DMSO behandlet). Behandling med MRE11-inhibitor mirin føre til økt følsomhet for PARP hemming i begge, HEC1A (2,6 ganger økning, p = 0,001) og HEC-116 (17-dobling, p 0,0001)
Knock-down og hemming av MRE11 sensitizes Cells til BMN673 på grunn av nedsatt HR
Siden tap av MRE11 uttrykk i AN3CA ble assosiert med betydelig følsomhet for PARP hemming, spurte vi om uttømming av MRE11 av siRNA generelt vil føre til en økt følsomhet for PARP-hemmere BMN673. For å teste dette brukte vi et panel av EF-cellelinjer som uttrykte normale nivåer av MRE11 (Fig. 2A) og var også motstandsdyktig mot PARP hemming (Fig. 2C). Effektiviteten av siRNA behandlingen ble evaluert ved Western blotting. I begge cellelinjer, transfeksjon med MRE11 siRNA effektivt utarmet endogene MRE11 (fig. 3A). Vi neste vurdert PARP hemmer følsomhet i MRE11-utarmet celler ved kolonidannelse. Ved uttømming av MRE11, vi konsekvent observert en signifikant reduksjon i celleviabilitet i nærvær av BMN673 (Fig. 3B). For å teste om MRE11 nuklease-aktivitet er nødvendig for PARP inhibitor motstand, dyrket vi to cellelinjene i nærvær av det MRE11 inhibitor mirin og behandlet dem med BMN673 (Fig. 3C). I begge tilfeller mirin hadde en negativ innvirkning på cellenes levedyktighet i respons på PARP-inhibering, sterkt tyder på at MRE11 nuklease-aktivitet er nødvendig for PARP inhibitor motstand. For å bekrefte at slå ned på MRE11 fører til nedsatt HR, bestemt vi cellenes evne til å danne RAD51 foci som respons på ioniserende stråling (IR) (se fig. 4A). Faktisk, ved å stanse all
MRE11,
færre RAD51 foci per celle kunne observeres (fig. 4B). Den CAPAN-1-pankreas cellelinje kjent for å være HR-mangelfull på grunn av en mutasjon i
BRCA2
tjente som en kontroll (data ikke vist).
A, immunfluorescens bilder som viser DAPI-fargede kjerner (blå) og RAD51 foki (grønn) i representative felt av HEC-1A og HEC-116 endometrial carcinoma celler. Både villtype MRE11 uttrykkende cellelinjer ble enten behandlet med tre forskjellige sett av sirnas for MRE11 eller med siRNA for luciferase (siLuc) som en kontroll. De transfekterte cellene ble deretter utsatt for 10 Gy av bestråling eller ikke eksponert, som angitt. B, RAD51 foci formasjon vist som en prosentandel av RAD51 foci-positive celler (mer enn 5 brennpunkter per celle ble vurdert som positive) uten behandling og 6 timer etter 10 Gy av bestråling. Et minimum av 100 celler ble tellet for å bestemme RAD51 foci formasjon frekvens i tre uavhengige forsøk. ** P≤0.01, *** P≤0.001.
Diskusjoner
Dette er den første rapporten som viser at ikke bare protein uttrykk for MRE11 men også uttrykk for andre medlemmer av MRN-kompleks, RAD50 og NBS1, er tapt i en betydelig andel av egenkapitalbevis. Videre observerte vi en signifikant sammenheng mellom protein tap av alle MRN medlemmer samt mismatch reparasjon protein status i denne store datasett. Protein uttrykk for MRN-komplekset har ennå ikke undersøkt hos EC svulster. I blærekreft, har MRE11 vist seg å utvise prediktive egenskaper for strålebehandling [30]. Videre er fullstendig tap av MRN-kompleks i MSI positive kolorektal kreft en hyppig aktivitet [31], mens tap av MRE11 i brystsvulster er funnet bare i 9% av tilfellene [32].
Selv om en klar sammenheng mellom mutasjonsstatus og tap av protein uttrykk ble ikke funnet i denne studien, er det bemerkelsesverdig at en høy korrelasjon av protein tap av alle MRN medlemmer samt MSI status ble funnet i dette store datasett. Forstyrrende resultatene på mutasjons status for MRE11 polyT (11) allel kan være relatert til kjente vanskeligheter ved sekvensering av MRE11 polyT (11) allel på grunn mispairing av polymeraseenzym [33].
En tidligere studie viste høy frekvens av forandringer av DSB-reparasjonsgener i MSI positiv ECS, hvor MRE11 og RAD50 oppviste heterozygote og homozygote mutasjoner i 51% og 17%, henholdsvis, uten å undersøke effekten av tapet av proteiner [6]. Mutasjoner av MRE11 polyT (11) allelet er overveiende heterozygote mutasjoner, og det har blitt foreslått at bare de med mutasjoner av to og flere nukleotider, samt homozygote mutasjoner har en funksjonell effekt når det gjelder tap av funksjon [11], [12] , [34], [35]. I denne rapporten kan vi ikke bekrefte den høye frekvensen av intronic mutasjoner men gir bevis for at MRE11 protein er tapt i en betydelig andel av egenkapitalbevis. Nylig har det blitt vist at hele ekson-sekvensering av MRE11 åpenbart mutasjoner i 1,9% (2 av 107) av EF tumorer i løpet av eksonene [36]. Imidlertid har intronic mutasjoner ikke blitt vurdert, forklarer hvorfor hyppigheten av
MRE11
mutasjoner rapporteres å være lav, ikke bare i studien av Price et al. [36], men også i en fersk en av Kreft Genome Atlas Research Network [5].
PARP-hemmere har vist bemerkelsesverdig følsomhet i BRCA1 /2-manglende tumormodeller
in vitro
samt som i kliniske studier med bærere av
BRCA1 /2
bakterie linje mutasjoner. Videre utvikling bevis antyder imidlertid muligheten for et større omfang av PARP-inhibitor-aktivitet [16]. Faktisk, for EC vi har tidligere foreslått tap av PTEN uttrykk som en potensiell biomarkør for behandling med PARP-hemmere basert på prekliniske data [26] samt på en klinisk kasuistikk [37]. Andre studier har imidlertid vært stille spørsmål ved rollen som
PTEN
i HR, noe som tyder på at dette kan være en cellelinje bestemt fenomen [38], [39]. Likevel PTEN
i HR DNA reparasjon forblir den eksakte mekanismen for involvering av
ikke klarlagt.
Tap av MRE11 uttrykk har blitt foreslått for å bevisstgjøre kolorektal [35], [38], [ ,,,0],40], bryst [41] og hematologiske [42] kreftcellelinjer til PARP-hemmere på grunn av nedsatt HR DNA reparasjon. Vår rapport antyder, for første gang, mulig bruk av PARP-inhibitorer i behandlingen av endometrial kreft basert på prekliniske resultater. Det er økende bevis for at pasienter som lider av livmorkreft og ikke uttrykker MRE11 kan behandles med BMN673. Dette støtter bruk av MRE11 som en prediktiv biomarkør for PARP behandling.
I konklusjonen, viser denne studien at i) fullstendig tap av MRN komplekset er en hyppig hendelse i EF, ii) tap av MRE11 uttrykk så vel som genet Slå og farmakologisk hemming av nukleaseaktiviteten fører til følsomhet for PARP-hemming
in vitro
, og iii) tap av MRE11 er knyttet til mangelfull HR DNA-reparasjon demonstrert ved bestråling. Basert på disse funnene, foreslår vi at MRE11 uttrykket kan brukes som en potensiell prediktiv biomarkør for effektiviteten av PARP hemmer behandling i livmorkreft med MSI.
Takk
Vi takker Martina Storz, André Fitsche og Sonja Brun-Schmid for utmerket teknisk assistanse, og Markus Rechsteiner for nyttige diskusjoner. Vi takker Steve Jackson for å gi publiserte reagenser og Biomarin Pharmaceuticals for gaven av deres PARP-hemmere BMN673.
