Abstract
Vi rapporterer celle mekaniske endringer i respons til endring av uttrykk for den menneskelige nukleosidlikevektstransportør-en (hENT1), en mest tallrike og utbredte plasmamembran nukleosid transporter i humane celler og /eller vev . Modulering av ekspresjonen hENT1 nivå endret stivheten av pankreatisk kreft CAPAN-1 og Panc 03.27 celler, som ble analysert ved atomkraftmikroskopi (AFM) og korrelert til mikrofluid plattform. Den hENT1 knockdown induserte reduksjon av cellulær stivhet i begge celler opp til 70%. I tillegg ble cellulære fenotypiske endringer som cellemorfologi, migrering og ekspresjonsnivå av epitel-mesenchymale overgangs (EMT) markører observert etter hENT1 knockdown. Celler med undertrykt hENT1 ble langstrakt, migrerte raskere, og hadde redusert E-cadherin og forhøyet N-cadherin i forhold til parentale celler som er i samsvar med epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Disse cellulære fenotypiske endringer korrelert med endringer i celle stivhet. Denne studien tyder på at hENT1 uttrykk nivået påvirker cellulær fenotype og celle elastisk oppførsel kan være en fysisk biomarkør for quantify hENT1 uttrykk og oppdage fenotypiske skift. Videre kan celle mekanikk være et kritisk verktøy i å oppdage sykdomsutvikling og respons på behandling
Citation. Lee Y, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Kirui DK, Hussain F et al. (2014) Menneskelig nukleosidlikevektstransportør-1 knockdown Tunes Cellular Mechanics gjennom Epitelial-Mesenchymale Overgang i bukspyttkjertelen kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10,1371 /journal.pone.0107973
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 03.07.2014; Godkjent: 16 august 2014; Publisert: 14 oktober 2014
Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke for økonomisk støtte fra følgende kilder: Department of Defense gir W81XWH-09-1-0212 og W81XWH-12-1- 0414, National Institute of Health gir U54CA143837 og U54CA151668, den CPRIT tilskuddet RP121071 fra staten Texas, og Ernest Cockrell Jr. Distinguished Velsignet Chair. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bukspyttkjertelen adenokarsinom (PDAC) er en av de mest dødelige kreft hos mennesker med et ekstremt dårlig prognose [1]. PDAC har lav overlevelse, selv etter fullstendig reseksjon av tumoren, som er den eneste mulighet for helbredelse. Dessverre, de fleste av svulster er opererbar og metastatisk. Dermed kjemoterapi og /eller strålebehandling er de eneste alternativene [2], [3]. Gemcitabin (2 «, 2»-difluorodeoxycytidine) er en av effektive cytostatika for kreft i bukspyttkjertelen [1]. Det er en cytotoksisk pyrimidin deoxynucleosid analog som transporteres inn i cellerommet gjennom primærtransportproteinet, human nukleosidlikevektstransportør-1 (hENT1), og til slutt inhiberer DNA-replikasjon. Den hENT1 uttrykket nivå i kreft i bukspyttkjertelen celler har tidligere vært korrelert til terapeutisk effekt der celler med høyere hENT1 uttrykk ble vist å svare bedre på gemcitabin. Videre har celle nivå studier også vist at kreft i bukspyttkjertelen celler med lav hENT1 ekspresjon er svært motstandsdyktig mot gemcitabin [4]. Videre har kliniske studier fastslått at hENT1 uttrykk påvirke hvordan pasienter responderer på behandling der pasienter med svulst uttrykt lav hENT1 biomarkør svarte dårlig på gemcitabin terapi [3], [5].
kreft i bukspyttkjertelen celler som kjøper gemcitabin-motstand er preget av epitel-mesenchymale overgang (EMT) fenotype og viser forskjellige morfologiske endringer fra epitel til spindel-formet og økende cellular motilitet [6], [7]. EMT er en biologisk prosess som polariserte epitelceller skifte til en mesenchymale-lignende fenotype gjennom flere biokjemiske forandringer. Dette fenotypisk overgang er karakterisert ved tap av celle-celle adhesjon og dynamiske forandringer i strukturen av cytoskjelettet som forårsaker cellene til å løsne fra epitel og for å få muligheten til å migrere til fjerne områder [8], [9]. Således, i denne studien, hypotese vi at modulering av hENT1 ekspresjonsnivåer i kreft i bukspyttkjertelen celler kan endre sine fysiologiske egenskaper som det kan indusere fenotypiske skift ved inhibering av gemcitabin-opptak. I tillegg til biokjemiske metoder for å identifisere cellulære fysiologiske endringer, kan forståelse celle mekanikere gi nye biologiske innsikt. Nyere studier viser at mekaniske egenskapene til cellene gi viktig informasjon for å forstå ulike biofysiske oppførsel som inkluderer celleform, motilitet, og celleadhesjon som genererer en kaskade av biokjemiske signaler som er kritiske for biologiske responser [10]. De mekaniske signaturer av celler kan være et viktig verktøy i ulike aspekter: (1) Identifisering av kreftceller fra normale celler basert på deres relativt lavere stivhet [11]; (2) påvente av en metastatisk potensial på kreftceller som cellulære stivhet inverst korrelert med migrering og invasjon [12] – [14]; (3) Anerkjennelse av fenotypiske endringer knyttet til endring i intracellulær struktur og bevegelighet i kreftceller ved måling av øker eller synker i elastisk modulus [11], [15] – [18]. Selv om det er ingen direkte bevis for at hENT1 er relatert til fenotypiske hendelser i bukspyttkjertelen kreftceller, kan vi spekulere i at hENT1 uttrykk kan modulere cellulære biofysiske atferd basert på den nære sammenhengen mellom hENT1 uttrykk og gemcitabin følsomhet. Den cellulære fenotypiske skifte fra gemcitabin resistente celler etablert ved å dyrke celler i serie økende konsentrasjon av gemcitabin støtter også vår hypotese.
I denne studien ble to forskjellige metoder, AFM og en mikrofluid plattform, ble brukt for å evaluere hvor modulering av hENT1 uttrykk nivå påvirkninger på stivhet av kreft i bukspyttkjertelen celler. Da de medfølgende morfologiske endringer, cytoskjelettet rearrangements, cellular motilitet, og endringer i uttrykk nivåer av EMT markører for å undersøke cellulære fenotypiske skifte var preget (figur 1). Sammen våre resultater på hENT1 uttrykk nivå og celle stivhet korrelerer meget godt med mekanistiske endringer av intracellulær cytoskeletal struktur, cellular motilitet, og tyder på at mobilnettet elastiske egenskaper kan anslå hENT1 uttrykk nivå samt fenotypiske skift.
hENT1 knockdown induserer endringer i cellulære mekanikk via EMT ledsaget av endringer i E-cadherin og N-cadherin uttrykk nivåer, cellulær morfologi og motilitet av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre induserer hENT1 knockdown nedgang i celle stivhet som demonstrert på representative kraft separasjonskurver innhentet fra Panc 03.27 celler (øvre graf fra en forelder celle, den andre grafen fra en hENT1 knockdown celle). Ved hjelp av AFM
materialer og metoder
Cell kultur
Alle cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den ASPC-1, BxPC-3, MIA Paca 2, og Panc-1 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, ATLAS Biologicals, Fort Collins , CO), CAPAN-1 i DMEM med 20% FBS, og Panc 03,27 i RPMI 1640 (Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA) med 15% FBS og rekombinant humant insulin (10 enheter /ml, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i nærvær av 5% CO
2 ved 37 ° C.
hENT1 knockdown med siRNA transfeksjon
cellene ble dyrket i 6 cm cellekultur tallerken med en tetthet på 5 × 10
5 celler /fatet. Etter vask med PBS ble cellene behandlet med INTERFERin (Polyplus transfeksjon ™) som inneholder siRNA mot hENT1 (SMARTpool: ON-TARGET pluss SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) eller negativ siRNA (Silencer negativ kontroll No. 1 siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, NY) ved en konsentrasjon på 50 nM i Opti-MEM (Invitrogen, Grand Island, NY). Etter 24 timers transfeksjon, ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert i 3 dager.
Western blot-analyse
Celler ble lysert med RIPA-buffer Pierce (Thermo Scientific, Waltham, MA) med proteasehemmer cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Cellelysatene (10 ug) med ladningsbuffer (LDS prøvebuffer for ikke-reduserende, Thermo Scientific, Waltham, MA) ble oppvarmet i 5 minutter ved 95 ° C. Cellelysater og protein stige (Xpert 2 Prestained Protein Marker, GenDEPOT) lastet på polyakrylamidgeler (Alle kD Mini- protean TGX Precast Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA) . Blottene ble blokkert med blokkeringsbuffer, TBST (20 mM Tris pH 7,6 /150 mM NaCl /0,05% Tween 20) som inneholdt 5% melk i en time. Blottene ble inkubert over natten med TBST og 5% melk som inneholder primære antistoffer ved spesielle forhold: anti-hENT1 antistoff (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-E-cadherin antistoff (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-N-cadherin antistoff (1:500, Abcam, Cambridge, MA); cytokeratin 18 (1:1000, Cellesignalering teknologi, Danvers, MA); Lamin A /C (1:1000, Cellesignalering teknologi, Danvers, MA); anti-GAPDH-antistoff (1:2000, Cell signale teknologi, Danvers, MA). Etter vasking tre ganger med TBST, ble blottene inkubert med TBST og 5% melk som inneholder sekundære antistoffer, anti-mus IgG HRP-bundet antistoff (1:5000, cellesignalisering teknologi, Danvers, MA) eller anti-kanin-IgG, HRP -koblet antistoff (1:5000, Cell signale teknologi, Danvers, MA), i en time ved romtemperatur. Deretter ble blottene er lagt over i en blanding av Pierce ECL western blotting substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA) og Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, MI), og proteiner ble påvist.
Immunofluorescence
kreft i bukspyttkjertelen celler ble sådd i 6-brønns plater inneholdende sterilisert, kollagen i (Invitrogen, Grand Island, NY)-belagte dekkglass (22 x 22 mm, Corning) med en tetthet på 2 x 10
5-celler /brønn. Cellene ble fremstilt med tre grupper: 1) kontroll (uten behandling); 2) scramble (transfektert med negativ kontroll siRNA); og 3) hENT1 knockdown. Cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd (Affymetrix, Santa Clara, CA) i 30 minutter ved romtemperatur og deretter permeabilisert med 2% Triton X-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i 10 minutter. Etter blokkering med 2% bovint serumalbumin (Calbiochem) i 1 time, ble cellene inkubert over natten med anti-Vinculin antistoff (1:200, Abcam, Cambridge, MA), anti-E-cadherin (1:200), anti- N-cadhrein (1:100), anti-cytoketarin 18 (1:200), eller anti-Lamin A /C (1:200) ved 4 ° C med forsiktig risting. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS i 10 minutter og inkubert med Alexa 488 eller 594-konjugerte sekundære antistoffer i en time ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, for F-aktin-farging, ble celler inkubert med Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:250, Invitrogen, Grand Island, NY) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de kjerner farget ved hjelp av Hoechst 33342 (Molecular sonder, Life Technologies, Grand Island, New York) i 10 min. Cellene ble overvåket ved konfokal laser scanning mikroskop (CLSM, Olympus FluoView FV1000).
AFM-målinger
Cellular stivhet ble målt ved hjelp av kraften-kurve teknikk på en Bioscope (Bruker Corporation, Billerica, MA). Cellene ble dyrket i 6 cm cellekulturskål, og alle målinger ble utført i kulturmedium ved 37 ° C. AFM var utstyrt med en invertert lys mikroskop (Olympus IX81), slik at cellene ble konstant overvåket. For å minimere celleskader, silika mikropartikkel (diameter: 5 mikrometer) modifiserte silisiumnitrid bommene (Novascan Technologies, Inc., Ames, Iowa) med omtrentlig våren konstante verdier av ~0.06 N /m ble ansatt i alle AFM eksperimenter. Den nøyaktige fjærkonstant-verdien ble målt ved hjelp av den termiske metode for tuning. Prober ble plassert på cellenes kjerner proximities henhold optisk kontroll, og tvinge kurver ble kjøpt til en samplingsfrekvens på 1 Hz. Den Youngs modul, E, ble beregnet ut fra oppnådde kraftkurver basert på Hertz modell (Eq. 1) ved hjelp Nanoscope analyseprogram fra Bruker aksjeselskap. (1) der F = kraft, E = Youngs modul, ν = Poissons tall (ν = 0.5, i denne studien), R = radius av indenter (R = 2500 nm, i denne studien), og δ = innrykk dybde.
for å få Youngs modul ble to uavhengige eksperimenter utført og tvinge kurver fra minst 50 celler ble samlet i hvert forsøk.
MS-chip design og fabrikasjon
silisiumskiver (4 tommer) fra Corning Inc. SU-8 2015 fotoresist, og SU-8 utvikler fra Microchem Corp og polydimetylsiloksan (PDMS RTV615) fra Momentive Performance Materials Inc. ble brukt. Microchip mønsteret ble designet med AutoCAD (Autodesk Inc.) og deretter skrevet ut som 10-mikrometer oppløsning krom masker av Photo Science Inc. Fotomasken mønsteret ble først oversatt til en mikrostruktur på en 4-i silisium wafer ved hjelp av SU-8 2015 fotoresist, som er en form for støping av PDMS materialer. I korthet, ble støpeformen fremstilt ved spinnbelegging SU-8 2015 fotoresist på en silisiumskive og kryssbinding ved hjelp av UV i 180 sekunder. Deretter ble det utviklet mønster utviklet ved hjelp av SU-8 utvikler (Microchem Corp.) og renset med isopropylalkohol og nitrogengass. Hullene for innløp og utløp ble stanset ved hjelp av nåler. PDMS lag ble rengjort ved skylling med isopropylalkohol og avionisert vann, og tørket med nitrogengass. Etter behandling med oksygenplasma, ble det PDMS sjiktet umiddelbart er bundet til en 75 x 50 mm glass-slide. Til slutt ble limt anordningen bakt i 2 timer ved 80 ° C.
On-chip celleseparasjons
Kanalene i MS-chip og Tygon-rør er koblet til brikken innløp ble fuktet med PBS og deretter holdt med 0,5% BSA i PBS i en time. BSA blokker overflaten og videre hindrer ikke-spesifikk adhesjon av celler til PDMS. Membraner av kontroll og hENT1 knockdown celler ble farget med Alexa Fluor 594 eller 488-konjugert hvetespirer agglutinin (Invitrogen, Grand Island, NY), henholdsvis. Celleblandingen i like mengder ved en endelig tetthet på 1 x 10
5 celler /ml ble fremstilt. Suspenderte celler ble deretter brukt til MS-brikken via et Tygon rør. Under eksperimentet ble komprimert nitrogengass tilføres til cellesuspensjonen ved et trykk på ~ 10 psi (69 x 10
3 Pa). En typisk separasjon varte ~15 min, og gjennomsnittlig strømningshastigheten ble kontrollert ved 1-2 ml /time. Celler brukes på MS-brikken ble fotografert av fluorescens mikroskopi (IX81, Olympus). Antall celler beholdt på chip etter separasjon ble talt av Image J.
In vitro
scratch analysen
scratch Analysen ble utført på enten innfødte celler (kontroll) eller transfektert celler (krafse og siRNA mot hENT1) for å studere effekten av hENT1 knockdown på celle migrasjon. CAPAN-1 eller PANC 03,27-celler ble utsådd i 24-brønns plate. Når cellene er omtrent 50-60% sammenflytende, ble cellene vasket med PBS og deretter transfektert med INTERFERin innehold siRNA mot hENT1 eller negativ siRNA i en konsentrasjon på 50 nM i Opti-MEM. Etter 6 timers transfeksjon, ble cellene vasket to ganger med PBS og inkubert i 2 dager. En ripe i cellen monolaget ble opprettet ved hjelp av en pipette tips. Deretter ble platene vasket og erstattet med det ønskede medium. Time-lapse mikroskop (EVOS FL Auto Imaging System, Life Technologies) med kammer (95% luft og 5% CO
2) og temperaturkontroll (37 ° C) ble brukt for å skaffe bilder fra samme felt automatisk for 18 timer. Bildene ervervet ble analysert kvantitativt ved hjelp av Image J.
Statistisk analyse
Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk signifikans ble identifisert av to-veis ANOVA analyse ved hjelp GraphPad Prism 5.0. AP verdi. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater og Diskusjon
For å undersøke sammenhengen mellom hENT1 uttrykk nivå og celle mekanikere, to typer bukspyttkjertelkreft cellelinjer, CAPAN-en og Panc 03,27 med relativt høyere hENT1 uttrykk (Figur S1 i File S1), ble valgt. Ved siRNA transfeksjon ble hENT1 downregulated celler etablert (figur 2). Vi målte endringer i celle mekanikk ved to forskjellige metoder, AFM og microfluidic separasjon. AFM tiltak elastiske egenskapene til levende celler via en direkte mekanisk vekselvirkning mellom en sonde og celleoverflate. Celle stivhet påvirker graden av cantilever nedbøyning ved interaksjon med overflaten av adherente celler [19]. En levende celle innrykk induserer deformasjon av cellekamre som inkluderer membran, cytoskeletons, kjernen, og ulike organeller. Således, de elastiske egenskapene til cellene resultat av de aggregerte virkningene av deformering av tallrike cellulære komponenter. Vi brukte en silica mikropartikkel (diameter: 5 mikrometer) modifisert cantilever (Figur S2 i File S1) for å redusere cellemembranen skade under kontakt og skew datasettet annerledes enn en skarp spiss. For å optimalisere innrykk kraft, vi påført kraft opp til 10 Nn som vist i Figur S2 i File S1. En konstant Youngs modulus av Panc 03.27 celler ble oppnådd i løpet av innrykks krefter opp til 200 pN, noe som indikerer måling av celle stivhet ved hjelp av AFM er kun gyldig ved små deformasjoner av levende celler. Begge cellelinjer viste en lignende trend under samme innrykk kraft, dvs. 100 PN. De kontrollceller og celler transfektert med negative siRNA var betydelig stivere enn hENT1 knockdown-celler (figur 2 og figur S3 i File S1). Den midlere celle stivhet av begge kontrollceller er 2,95 ± 1,55 kPa (CAPAN-1) og 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03,27); imidlertid, at av hENT1 knockdown-celler viste signifikant redusert Youngs moduler med verdier på 1,50 ± 0,63 kPa (CAPAN-1) og 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03,27).
(A) Western-blots av hENT1 (55 kDa ) og GAPDH (37 kDa) i CAPAN-1 (venstre) og Panc 03.27 celler (høyre) uten behandling (Ctrl) eller etter behandling av negativ siRNA (scrl) eller hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (B) Bar histogrammet viser Youngs modulus av kontroll, negative siRNA transfektert, og hENT1 knockdown celler. (N.S: statistisk ikke signifikant)
Siden AFM er begrenset til lokale måling av celle mekanikk, vi også vurdert cellular formbarhet ved hjelp av mikrofluidseparasjonsmetode [20] for å bekrefte AFM funn.. En mekanisk separasjon chip (MS-chip, figur 3A) er designet med kunstige microbarriers i kombinasjon med hydrodynamisk kraft til eget deformerbar fra stive celler [21]. For å demonstrere evnen av MS-chip for å separere celler basert på deformerbarhet, testet vi separering av en blanding inneholdende to forskjellige celler: kontroll og hENT1 knockdown. Membran av kontroll og hENT1 knockdown celler ble farget ved hjelp av Alexa Fluor 594 og 488 konjugert hvetespirer agglutinin (WGA), henholdsvis. Som vist i fig S4 i File S1, effekten av WGA på celle stivhet er ubetydelig. Andelen av de to cellelinjene varieres langs lengden av brikken. Som vist i figur 3D og 3G, diametrene av begge celler, kontroll og hENT1 knockdown, var lik. Celleblandingen i like mengder med en tetthet på 1 x 10
5 celler /ml ble injisert til MS-chip og strømmet i 15 minutter. Den gap mellom innleggene array i dette designet MS-chip varierer fra 22 mikrometer til 2 mikrometer. Kanalene unngå hindringer som oppstår i gjentatte matriser av innleggene som regulerer og utjevne hydrodynamisk trykk hele brikken. Det antas at det ikke er noen fysisk kontakt mellom PDMS søyler og celler fordi den PDMS er belagt med BSA. Skjærspenningen er en viktig faktor for å samhandle med celler. Når gapet størrelse av post matriser er større enn cellediameteren, trykkraft (F
p, 10 psi i denne studien) er den eneste kraft som virker på celler. Hvis cellediameter er lik eller større enn gapet størrelse, friksjonskraft (F
f) motvirker trykk-kraften (figur 3B). Hvis cellene er stivere, skyver de hardere på innlegget arrays, og deretter F
f er betydelig økt. Figur 3C viser Panc 03.27 celler fanget på MS-chip avbildes ved fluorescens mikroskopi; rød fluorescens viser kontrollceller og grønn fluorescens viser hENT1 knockdown celler. Ved innløpet, tilsvarende antall røde regulerings Panc 03,27 (eller CAPAN-1) celler og grønn hENT1 knockdown Panc 03,27 (eller CAPAN-1) ble observert celler (figur 3C og 3E-I). I denne regionen, kanaler var mye større at diameteren av celler, noe som resulterer i ingen signifikant separasjon av fleksible og stive celler. På grunn av mindre diameter av CAPAN-1-celler (gjennomsnittlig diameter: 15 um), ble separasjonen som oppnås med 8 um gap størrelse av post matriser. Men i tilfelle av Panc 03.27-celler (gjennomsnittlig diameter: 19 um), oppstår det store separering ved 12 um. I disse cellelinjene, ble celler i kontrollgruppen gående fanget mens hENT1 knockdown cellene passerte gjennom hullene oftere. Disse eksperimentene demonstrerer den totale effektiviteten av separasjon av de to forskjellige fenotyper med tilsvarende diameter i MS-chip. Dermed konkluderer vi begge kontrollcellene er relativt stivere enn hENT1 knockdown celler, og disse resultatene er i samsvar med AFM funn.
(A) Fotografi (til venstre) fra microfluidic separasjon chip (MS-chip) visualisert ved rødt farge på innsiden og en representant scanning elektronmikroskopi (til høyre) bilde av innlegget array (diameter på søyle: 35 mikrometer, høyden på søyle: 30 mikrometer). (B) Lys felt bilde og ordningen av celler som strømmer i MS-brikke når den cellediameteren er mindre enn søyle gapstørrelsen (rød pil indikerer celler). Det forutsettes her at friksjonen skyldes bare for skjærspenning (F
p: trykkraft mot det påførte trykk (10 psi i denne studien), F
F: friksjonskraft). (C) Fluorescens bilde av en av kanalene på åtte viser tilbakeholdt Panc 03.27 celler i MS-brikken etter separasjon av Panc 03,27-ctrl (rød fluorescens) og Panc 03,27-hENT1 knockdown (grønn fluorescens). Representative høyere forstørrelse konfokale mikroskopiske bilder av brikken MS (gap størrelse fra 12 um til 6 um) viser effektiviteten av separasjonen gjennom hullene. Størrelsesfordelingen av celler (D: CAPAN-1, G: 03.27 PANC-celler). Statistisk analyse av celler (E: CAPAN-1, H: Panc 03,27) og fraksjon forholdet mellom celler (F: CAPAN-1, I: PANC 03,27) holdt tilbake på brikken. Verdier representerer gjennomsnitt ± standardavvik.
For å forstå hvordan hENT1 påvirker celle mekanikere, fysiologiske endringer i celler etter hENT1 knockdown ble studert ved konfokalmikroskopi. Vi observerte at celle morfologiske endringer knyttet hENT1 knockdown. Som vist i figur 4, ble celler visualisert ved bruk av konfokal laser scanning mikroskop og celle rundhet ble kvantitativt analysert ved beregning av formfaktorer (FF). FF blir oppnådd ved hjelp av ligningen, 4π (område) /(omkrets)
2, noe som gir en verdi på 1 for en perfekt sirkulær omkrets og avtagende mindre positive verdier for mindre sirkulære omkrets [22]. CAPAN-1 og PANC 03,27 celler er epitelial typen, og de er tett forbundet med hverandre via intercellulære adhesjons komplekser. De har squarish former med FF-verdier på 0,74 ± 0,08 og 0,77 ± 0,06, respektivt (figur 4B). I kontrast, ble både celler etter hENT1 knockdown forlenget med mye lavere FF med verdier på 0,44 ± 0,14 og 0,52 ± 0,16, henholdsvis
(A) Representative confocal mikrografer av bukspyttkjertelen celler (Topplate:. CAPAN-1, bunn~~POS=TRUNC: Panc 03,27) viser F-aktin distribusjon, (B) formfaktor (f = 4πa /p
2; a: område; p: perimeter) analyseres ved bilde~~POS=TRUNC J (CAPAN-1 celler, ctrl: n = 37, scrl: n = 59, hENT1 ↓: n = 29; Panc 03,27, ctrl: n = 36, scrl: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: statistisk ikke signifikant)
.
videre, er effekten av hENT1 knockdown på organiseringen av cytoskeletons ble evaluert. Vi farget for vinculin, som styrer dannelsen av fokale sammenvoksninger (fettsyrer) ved direkte samspill med aktin og andre proteiner som er involvert i FA formasjon [23]. Fettsyrer, områder av sammenvoksninger mellom cellen og den ekstracellulære matriks (ECM), og spennings fibre på marginen har klare roller i å bevege cellen fremover [23], [24]. Studier har rapportert at FA størrelse er korrelert med celle hastighet; større fettsyrer som finnes i mer langstrakte og raskere bevegelse celler [25], [26]. I denne studien, analyserte vi omfordeling av F-aktin og forandringer i fokal adhesjon område av hENT1 knockdown-celler (figur 5). Actin fiber i begge kontrollgruppene ble stort sett konsentrert rundt cellen periferien, og små, begynnende fotballforbund ble observert. Men etter hENT1 knockdown, var det en økning i antall av stress fibre samt målbare fokale vedheft områder. Disse resultatene foreslår at økt cellulær motilitet i begge cellelinjer.
Confocal mikrobilder (z-stabler av basalplanet, 0-1,5 um) som viser vinculin (rød) og F-aktin (grønn) i (A) Capan- 1 og (B) Panc 03.27 celler. Areal av fokal adhesjon (pixel
2) analyseres av Image J.
I tillegg, for å forstå effekten av hENT1 knockdown på cellemotilitet, undersøkte vi effekten av nedregulering av hENT1 på celle migrasjon. Et sår ripe ble innført i sammenflytende cellemonolag, og deretter såret forsegling ble observert i 18 timer (figur 6). Området for sårheling ble beregnet ved bruk av Image J og migreringshastigheten (område for sårheling (um
2) /time) ble beregnet som vist i figur 6. såret tettende området og migrasjonshastighet på begge kontrollceller og celler transfektert med krafse siRNA er like. Men hENT1 trykt CAPAN-1 eller Panc 03.27 celler migrerer 1,8 (1,7) eller 1,5 (1,5) fold raskere enn kontroll (rykke siRNA transfekterte celler), henholdsvis. Dermed bekrefter vi at nedregulering av hENT1 induserer dannelsen av større fokale sammenvoksninger og fremmer raskere celle migrasjon. Basert på celle morfologiske endringer og øket celle motilitet, er det mulig at begge celler gjennomgår fenotypiske forandringer, som er forbundet med løsnede adhesjon mellom celler og cytoarchitectural rearrangement. Ved EMT, er omorganisering av cytoskeletons sammen med økning i FA dynamikk avgjørende for celler å forlate epitel og begynne å overføre via ECM [22], [27], [28]. For eksempel viste en fersk undersøkelse økt migrasjon av post-EMT Skov-3 celler som ble transformere vekstfaktor-β (TFG-β) som genererte større FA mekaniske krefter enn for pre-EMT celler [16]. TGF-β er rapportert som EMT inducer i forskjellige epitel-cellelinjer inkludert proksimale nyretubuli og alveolære epitelceller [16], [29], [30]. Økt samhandling av aktin cytoskjelettet og intracellulære molekyler til FAS initiert av foreningen av inte α5β1 og fibronectin forbedret cellular motilitet [16].
De riper ble introdusert til enkeltlag (A) CAPAN-en og (D) Panc 03,27 celler. Bildene ble tatt umiddelbart etter at såret induksjon i 18 timer. Såret tettende områdene (B) CAPAN-1, og (E) PANC 03.27 celler ble beregnet ved hjelp av bilde J og sammenlignet med kontroll, krafse siRNA transfektert, og hENT1 knockdown celler. Migrasjon hastighet (C) CAPAN-en og (F) Panc 03.27 celler ble beregnet.
For å bekrefte de fysiologiske endringer indusert av hENT1 knockdown er knyttet til EMT, vi analysert endringer i EMT markør proteiner, slik som E-cadherin og N-cadherin, etter hENT1 knockdown. E-cadherin er en av celle-celle adhesjon molekyler. Som opprettholder celle-celle kontakter og epitel arkitektur. Veksling av ekspresjon av cadherins fra E-cadherin og N-cadherin, som primært uttrykkes i mesenchymale celler, skjer under EMT. Denne vekslingen fører til en drastisk endring i klebende egenskaper celler, som den mister sin affinitet for epitelceller naboer og gevinster affinitet for mesenchymale celler, som er nonpolarized, mangel inter veikryss, og har en unik spindel-lignende form [27], [ ,,,0],31], [32]. Etter hENT1 nedregulering, begge cellelinjer viste lav ekspresjon av E-cadherin og høy ekspresjon av N-cadherin, som er et vesentlig kjennetegn på EMT (figur 7). Tapet av E-cadherin og gevinst på N-cadherin øker cellemotilitet og metastatisk potensial. Flere studier har vist at redusert celle stivhet direkte korrelerer med økt metastatisk potensial ved hjelp av forskjellige in vitro biomekaniske analysemetoder [11], [17], [33]. Reduksjon i cellulær stivhet modulerer at cellene gjennomgår EMT etter hENT1 knockdown slik det er vist i figur 2. Det er imidlertid ubetydelig forskjell i ekspresjonsnivåene av mellomliggende filamenter, cytokeratin 18, og kjerne cytoskjelettet, lamin A /C i begge cellelinjer (figur S5 i File S1).
Western blot og relative uttrykk nivåer av E-cadherin (110 kDa), N-cadherin (140 kDa) i (A) CAPAN-en og (C) Panc 03.27 celler etter behandling med hENT1 siRNA. Kolonner i histogrammene er gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter (intensitet forholdet mellom GAPDH til E-cadherin eller N-cadherin). Representative confocal bilder av E-cadherin (rød fluorescens) og N-cadherin (grønn fluorescens) uttrykk i (B) CAPAN-en og (D) Panc 03.27 celler.
For å bekrefte våre forutnevnte studier som tyder på at EMT kan karakteriseres ved forandringer i celle stivhet, evaluert vi fenotypiske forandringer av kreft i bukspyttkjertelen celler etter behandling med TGF-β. TGF-β har blitt rapportert i flere studier for å indusere EMT [15], [16], [30]. Derfor vi videre undersøkt disse resultatene i et annet eksperiment ved hjelp EMT-indusert kreft i bukspyttkjertelen celler. Panc 03.27 celler ble eksponert for TGF-β i 2 dager ved en konsentrasjon på 10 ng /ml for å indusere EMT, og deretter målt cellulær stivhet. Litt trykt E-cadherin og forhøyet N-cadherin og vimentin uttrykk indikerer at EMT er indusert i Panc 03.27 celler (figur S6a i File S1). PANC 03.27 celler behandlet med TGF-β ble demonstrert ved redusert Youngs modul (1,42 ± 0,53 kPa) i forhold til ubehandlede celler (1,91 ± 0,78 kPa). Dette resultatet tyder på at celle stivhet avtar når cellene gjennomgår EMT. Nylig er det rapport om cellestivhets endringer i EMT-induserte A549-celler med TGF-β behandling [15]. I deres studie, målte de lokale mekaniske egenskapene til A549-celler ved hjelp av en skarp DNP cantilever (20 nm neseradius) som har et mindre kontaktområde i forhold til en mikropartikkel-modifisert cantilever. Selv om det er avgjørende bevis for celle fenotypisk endring fra epitelial til mesenchymale, dvs. celle formen endringer og økende stress fiber, er fortsatt i tråd med vårt arbeid.
