Abstract
I kreft i bukspyttkjertelen, er det et klart udekket behov for å identifisere nye blodprøver for enten tidlig diagnose, behandling lagdeling eller pasientovervåking. Proteomikk analyse av tumorcelle secretomes er en lovende metode for å indikere proteiner frigjøres fra kreftceller
in vitro
. Ectodomain utgytelsen av trans proteiner har tidligere vist seg å bidra med betydelige fraksjoner tumorcelle secretomes og å generere verdifulle serum biomarkører. Her introduserer vi en løselig form av det gigantiske cadherin Fat1 som en roman biomarkør kandidat. Fat1 uttrykk og proteolytisk behandling ble analysert ved massespektrometri og Western blotting ved hjelp av bukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til menneskelige bukspyttkjertelen duktale epitelceller. RNA uttrykk i kreftvev ble vurdert av
i silico
analyse av offentlig tilgjengelige microarray data. Involvering av ADAM10 (A disintegrin og metalloproteinase domene som inneholder protein 10) i Fat1 ectodomain Shedding ble analysert ved kjemisk hemming og knockdown eksperimenter. En sandwich-ELISA ble utviklet for å bestemme nivåene av oppløselig Fat1 i serumprøver. I den foreliggende rapporten beskriver vi utgivelsen av høye nivåer av ectodomain av Fat1 cadherin i de secretomes menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
, en prosess som er mediert av ADAM10. Vi bekrefter den full-lengde og behandlet heterodimere form av Fat1 uttrykt på plasmamembranen, og viser også den p60 C-terminale transmembrane rest fragment som tilsvarer den skur ectodomain. Fat1 og dens sheddase ADAM10 er overexpressed i bukspyttkjertelen adenokarsinomer og ectodomain Shedding er også rekapitulert
in vivo
fører til økt Fat1 serumnivåer i enkelte bukspyttkjertelen kreftpasienter. Vi foreslår at løselig Fat1 kan finne et program som en markør for pasientovervåking utfyller karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9). I tillegg detaljert analyse av de ulike bearbeidede protein isoformer av kandidaten tumor suppressor Fat1 kan også bidra til vår forståelse av cellebiologi og tumor atferd
Citation. Wojtalewicz N, Sadeqzadeh E, Weiß JV, Tehrani MM, Klein-Scory S, S Hahn, et al. (2014) En løselig form av Giant cadherin Fat1 frigjøres fra kreft i bukspyttkjertelen celler ved ADAM10 mediert Ectodomain Shedding. PLoS ONE 9 (3): e90461. doi: 10,1371 /journal.pone.0090461
Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, West German Cancer Center, Tyskland
mottatt: 11 oktober 2013; Godkjent: 28 januar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Wojtalewicz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Bundesministerium für Bildung und Forschung, NGFN Plus program, 01GS08117 (til MS) og 01GS08118 (IS-W) og av en bevilgning fra Hunter translasjonell kreftforskning Unit (til RFT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pancreatic duktalt adenokarsinom er den mest vanlige ondartede tumor i bukspyttkjertelen, og er den fjerde rangert årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Ansett som den mest aggressive solid svulst, er dødeligheten fra bukspyttkjertelkreft høy med 5-års overlevelse mindre enn 5% [1], [2]. For tiden eneste operasjon gir potensial for kur men reseksjon er mulig i bare 15-20% av pasientene. Derfor er tidligere påvisning av kreft i bukspyttkjertelen avgjørende for å forbedre pasientens utfall.
Serum biomarkører er svært ønskelig for tidlig diagnose, behandling lagdeling og pasientovervåking. I sammenheng med kreft i bukspyttkjertelen karbohydratantigenet 19-9 (CA19-9) også kjent som sialyl Lewis blodgruppeantigenet, er hoved serum biomarkør anvendt klinisk [3]. Serum-analyser for CA19-9 har begrenset diagnostisk verdi, og kan ikke brukes som en screeningsanalyse alene ([4] og referanser deri), men gir viktig informasjon med hensyn til prognose, respons til kjemoterapi og som en tidlig indikator av postoperative tilbakefall . Serie fastsettelse av CA19-9 nivåer kan oppdage sykdommen tilbakefall måneder før kliniske eller radiologiske tegn. Videre kan en nedgang på CA19-9 respons på kjemoterapi tjene som surrogatmarkør for klinisk respons [4] (for oversikt se [5] – [7]). Men flere ledsagende variabler begrenser den kliniske nytten av CA19-9.
De høyeste CA19-9 nivåer blir detektert i pasienter med galleobstruksjon, uavhengig av om hindringen er på grunn av kreft eller for å godartede årsaker [8], [9]. Økte CA19-9 nivåer er også assosiert med pankreatitt, levercirrhose, cholangitis og flere adenokarsinomer av annen type, f.eks tykktarmskreft. Viktigere, uttrykk for CA19-9 avhenger av en Lewis positiv fenotype, med falske negative resultater vanlige hovedsakelig på grunn av ca 7-10% av kaukasiere og opp til 20% av afrikanere å være
Lewis
antigen negativ hvor CA19- 9 er målbart uavhengig av tumorbyrden [10], [11]. Derfor er det et klart udekket behov for å identifisere nye blodprøver for enten tidlig diagnose, behandling lagdeling eller pasientovervåking som har økt nytte eller kan utfylle med CA19-9 eller andre blodprøver [8].
En tilnærming for biomarkører som vi og andre har brukt, er avhøret av hele repertoaret av proteiner frigjøres fra kreftceller
in vitro Anmeldelser – kreftcellen secretome [12] – [15]. Proteomikk analyser av secretomes har funnet tusenvis av proteiner og noe overraskende, blant dem betydelige fraksjoner av trans (TM) proteiner. Dette skyldes først, til utgivelsen av mikrovesikler som bærer intakte TM proteiner. For det andre kan proteiner TM behandles til en løselig form ved proteolytisk prosessering [16] – [18]. Vi har tidligere funnet at både microvesicular meldingen [19] og proteolytisk spalting av TM proteiner forekommer ikke bare
in vitro
, men også
in vivo
. Spesielt vi bestemt en økning i serumnivåer av løselige cadherins, nemlig løselig E-cadherin [20] og av løselig LI-cadherin (upubliserte data) hos pasienter med kolorektal kreft.
I denne rapporten har vi analysert secretome av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og beskrive identifikasjon av en løselig form av Fat1 cadherin som en svært rik bestanddel av denne fraksjonen. Fat1 tilhører en liten familien av fire virveldyr gener (Fat1, Fat2, Fat3 og Fat4). Fat cadherin genene koder ekstremt store proteiner av ~500-600 kDa med bevaring av struktur fra virvelløse dyr til pattedyr. Hvert medlem består av opptil 34 cadherin gjentas, en eller to lamininG-lignende motiver og flere epidermal vekstfaktor (EGF) -lignende motiv i deres ekstracellulære region, en enkelt-pass-TM-området, og et stort cytoplasmatisk domene [21] – [ ,,,0],23]. Proteolytisk prosessering av fett proteiner som forekommer i begynnelsen av sekretoriske vei og som produserer et ikke-kovalent bundet heterodimer i cellemembranen har tidligere blitt beskrevet. Det er referert til som «klassiske» behandling og ser ut til å være konservert mellom Drosophila [24] og man [22], [25].
Fat1 er ikke tidligere blitt undersøkt i bukspyttkjertelkreft. Her presenterer vi den første beskrivelsen av en løselig isoform av Fat1 løslatt fra kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
. Vi fant at A disintegrin og metalloproteinase domene som inneholder protein 10 (ADAM10) er i stor grad ansvarlig for utgivelsen av denne ectodomain fragment.
I silico
analyse av offentlig tilgjengelige uttrykk array-data indikerte overekspresjon av Fat1 samt ADAM10 i bukspyttkjertelen adenokarsinomer. Til slutt har vi utviklet et ELISA-basert assay i stand til å måle ectodomain av Fat1 og viser at økte nivåer av oppløselig Fat1 kan påvises i serum fra en andel av pasienter med pankreatisk adenokarsinom sammenlignet med upåvirket kontrollene.
materialer og metoder
Etikk uttalelse
Vevsprøver ble innhentet fra pasienter ved Institutt for indremedisin, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum, Tyskland, etter at informert samtykke ble innhentet. Studien ble godkjent av den lokale etikk gjennomgang styret i Ruhr-Universität Bochum, og ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen. Se tabell S5 for pasientopplysninger.
Skriftlig informert samtykke fra alle pasienter og vev givere ble dokumentert i henhold til de lokale etiske retningslinjer. De tre kreftPrøver ble tatt fra pasienter med PancCa trinn UICC IIB. Normalt vev kontrollene var fra samme pasientenes tilstøtende friskt vev.
Serumprøver ble tatt fra pasienter ved Institutt for indremedisin, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität Bochum, Tyskland, etter at informert samtykke ble innhentet. Studien ble godkjent av den lokale etikk gjennomgang styret i Ruhr-Universität Bochum, og ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen. Se tabell S4 for pasientopplysninger.
Skriftlig informert samtykke fra alle pasienter og blodgivere ble dokumentert i henhold til de lokale etiske retningslinjer. De 30 cancerprøver ble tatt fra pasienter med PancCa trinn UICC I (1), UICC II (9), UICC III (2) og UICC IV (18). En gruppe på 26 pasienter med negative diagnostiske resultater for kreft ble brukt som (kliniske) kontroller.
Cell kultur
Den menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje Paca44 [26] ble vennlig levert av M. Löhr (Heidelberg, Tyskland), ble BxPc3, MiaPaca2 og Panc1 oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og A818-4 celler var fra vårt laboratorium (WS). Celler ble opprettholdt i supplert Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som tidligere beskrevet [19]. Menneskelig bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE) celler ble vennlig levert av M.S. Tsao (Toronto) og dyrket i definert keratinocytt-SFM (KFSM, Livs teknologi) som tidligere beskrevet [19].
Fremstilling av proteinprøver
Secretome Fremstillingen ble utført som tidligere beskrevet [20] . I korte trekk ble cellene dyrket i standard medium inntil de nådde en sammenfletting av 60-70%. Etterpå ble de vasket tre ganger med DMEM og inkubert i serumfritt medium med tillegg for hver 16 timer for MS-analyse eller annen to dager for western blot-analyse. Supernatanter ble høstet og fjernet fra flytende celler og rester av sterilfiltrering. For å hindre proteolytisk fordøyelse, ble proteinaseinhibitorer lagt. Secretome proteiner ble konsentrert ved ultrafiltrering
For cellekultur Lysatfremstilling celler ble lysert med NP-40 buffer (25 mMTrisHCl, pH 7,4, 0,5% NP-40, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,. 45 min 4 ° C), med CHAPS-lyseringsbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM MgCl
2, 10% glyserol, 1% CHAPS 90 min, 4 ° C) eller med NDE-lyseringsbuffer (10 mMTris /HCl, pH 7,2, 66 mM EDTA, 0,4% SDS, 1% NP-40, 1 time, 4 ° C) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Sveits) og 1 mM PMSF. Supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering (14,000 rpm, 10 minutter 4 ° C). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt i et standard Bradford proteinanalyse (BioRad, Hercules, CA, USA).
Frozen vev utvinning
Et lite stykke frossen tumor eller normalt vev var brukket av og pulverisert mens avkjølt med flytende nitrogen. Pulveret ble dekket med NDE buffer og proteinet ekstraksjon ble utført som beskrevet ovenfor.
ADAM og MMP-hemning
ADAM10 spesifikk hemmer GI254023X [27], [28] og det brede spektrum-metalloproteinase-inhibitor Batimastat (Tocris Bioscience, Bristol, UK) ble begge oppløst i DMSO som lagerløsninger før fortynning og bruk. Celler ble dyrket inntil de nådde en sammenfletting av omtrent 60-70%. De ble vasket og etterpå inkubert med 10 mm Batimastat eller fem mikrometer GI254023X i serumfritt medium i to dager.
siRNA-knockdown studier
For siRNA eksperimenter celler ble dyrket til en confluency på ca. 30% og inkubert på antibiotika-fritt medium for en dag. Deretter ble de inkubert med 30 pM enten ON-TARGETplus siRNA eller Dharmacon ON-TARGETplus nontargeting siRNA som en kontroll ved hjelp av Dharmafect (Fermentas, ST. Leon Rot, Tyskland) i to dager, etterfulgt av inkubasjon i serumfritt medium i ytterligere to dager og en andre inkubasjon i serumfritt medium i ytterligere to dager.
antistoffer og Western blotting
ikke-kommersielle anti-Fat1 musmonoklonale og kanin polyklonale antistoffer rettet mot N-terminal eller C- terminale domener av Fat1 ble tidligere beskrevet [25]. Polyklonale antistoffer mot det ekstracellulære domene av Fat1 (HPA001869 og HPA023882) og monoklonale antistoffer mot β-tubulin (T4026) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). ADAM10 antistoffer ble kjøpt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) (kanin, 735-749) og Millipore (Darmstadt, Tyskland) (kanin AB19026). E-cadherin antistoff ble kjøpt fra Invitrogen (Darmstadt, Tyskland) (mus, 13-1700).
For Western blot analyse, 8 mikrogram total protein fra secretomes, 50-75 mikrogram fra cellelysatene og vev eller 12 mikrogram serumproteiner ble separert ved hjelp av 3-8% Tris-acetat gradient gels (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) som tidligere beskrevet [25] med noen modifikasjoner. I korthet, proteiner ble overført til nitrocellulose eller PVDF-membraner ved hjelp av halvtørr blotting og membranene ble blokkert i 1 time med 5% skummet melkepulver i PBS. Etter inkubasjon med de indikerte primære antistoffer, ble påvisning av immunoreaktive band utført ved hjelp av egnede sekundære antistoffer kombinert med infrarøde fluorophores (Alexa-Fluor 680 (Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) eller DyLight 800 (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland)) eller HRP ( BioRad laboratorier, München, Tyskland). Signaler ble påvist ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE) eller en Fuji LAS-4000 bildesystem (GE Healthcare, Braunschweig, Tyskland).
Elektro ionisering-tandem massespektrometri (ESI -MS /MS) analyse
For en detaljert beskrivelse se materialer og metoder S1. I korthet secretome og serumprøver separert på PAGE-geler ble farget med Krypton (Pierce, Rockford, USA) og hvert protein kjørefelt skåret i 29 skiver og fordøyd med trypsin. Tryptiske peptid-blandingene ble separert ved anvendelse av en nanoAcquity UPLC system (Waters GmbH, Eschborn, Tyskland) som tidligere beskrevet [19]. Nano UPLC systemet ble koblet på nettet til en LTQ Orbitrap XL massespektrometer (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland). Massespektrometer ble operert i det følsomme modus. Themgf-filer generert av Xcalibur programvare (Thermo Scientific, Bremen, Tyskland) ble brukt til søk i databaser med maskoten søkemotor (Matrix Science, London, UK, versjon 2.2) mot MSIPI database. Hver skive ble analysert separat og MS /MS-data ble ikke slått sammen før protein database search for å opprettholde informasjon om molekylvekten til hvert protein, peptid fyrstikker og identifikasjon resultatet. På denne måten protein kataloger fra menneskelige bukspyttkjertel kreft celle secretomes (A818-4, BxPC3, MiaPaca2, Paca44, Panc1 og HPDE (human pancreatic ductal epitel)) ble etablert.
ELISA-analysen mot skilles Fat1
96-brønners plater (Maxisorp hvit flatbunnede 96-brønners plater (Nunc, Roskilde, Danmark) ble først belagt over natten ved 4 ° C med 100 ul anti-Fat mAb NTD-7 (dannet mot cadherin domener 11/12 ;.. [25]) ved 50 ug /ml i karbonatbuffer (pH 9,6) mellom alle inkubasjons-trinn, platene ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween (v /v) (PBS-T) platene ble deretter blokkert med 5% skummet melk i PBS-T (2 timer, RT) før påføring av angitte prøver og ytterligere inkubering (2 timer, RT). opptak Fat1 antigen ble påvist ved 0,05 ug /ml biotinylert anti-Fat1 NTD-14 mAb (16 t, 4 ° C), (frembrakt mot et peptid i cadherin gjentagelse 12 av Fat1 [25] fortynnet i 2% skummet melk i PBST. Komplekser ble detektert ved anvendelse av 5 mikrogram /ml Neutravidin-HRP (Pierce, Darmstadt, Tyskland) for 2 timer i romtemperatur før du rister inkubasjon av 50 ul substrat (SuperSignal ELISA FemtoMaximum sensitivitet).
Resultater
den gigantiske cadherin Fat1 er en viktig komponent i secretome av kreft i bukspyttkjertelen celler
Som en del av vår biomarkører program har vi katalogisert repertoaret av proteiner frigjøres fra fem menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved hjelp av massespektrometri (A818-4, BxPC3, MiaPaca2, Paca44 og Panc1) og sammenlignet dette til secretome av immortalisert menneskelig pankreatisk duktus epitel (HDPE) celler. Secretomes ble fremstilt som tidligere beskrevet [12], [13], [19] og separert på en 1D-gradient gel. Hver gel felt ble skåret i 29 skiver. Tryptiske fordøyelse og massespektrometri ble utført separat for hver gel slice og database søk førte til identifisering av mer enn 1000 proteiner per secretome og over 3000 unike proteiner totalt (upubliserte data).
Spesielt mange peptider kartlegging for å den gigantiske protocadherin Fat-1 ble funnet i alle seks secretomes innenfor gel skiver to og tre tilsvarende proteiner 400 kDa i samsvar med den forutsagte massen av Fat1 av rundt 500 kDa (sammenlign tabell 1). Faktisk, i form av antall peptider identifisert, som er et relativt mål på protein overflod, Fat1 var blant de mest tallrike proteiner i kreftcelle secretomes som representerer opp til 0,9% av alle peptider og den mest rikelig derivat av en hvilken som helst TM protein. Fordelingen av Fat1 peptider blant cellelinjer og peptider som stammer fra andre Fat proteiner (Fat2 og Fat4) er vist i tabell 1.
neste profilert mRNA uttrykk av alle fire Fat familie cadherins i bukspyttkjertelkreft cellelinje panelet med microarray analyse (tabell S1) etterfulgt av sekundær bekreftelse hjelp kvantitativ PCR (figur S1). Fat1 ble uttrykt i høye nivåer i alle seks cellelinjer, Fat2 og Fat4 til moderate nivåer i bare to av de seks cellelinjer. I motsetning bare bakgrunnsnivåer ble oppnådd for Fat3 i denne analysen.
De bestemte nivåer av mRNA hovedsakelig korresponderte med proteomikk data, men å sammenligne kreftceller til HPDE celler det var noen avvik. Spesielt HDPE celler vises høy Fat1 mRNA uttrykk, men omvendt ga det laveste antallet Fat1 peptider i secretome. Likeledes peptid tall for Fat2 og Fat4 i HPDE secretome er lavere eller til og med fraværende, respektivt, når sammenlignet med kreftcellelinjer som uttrykker også sammenlignbare nivåer av Fat2 og Fat4 mRNA (BxPC3 og Panc1, henholdsvis) som tyder på at cancercellene frigi mer fett proteiner enn normale celler.
å uavhengig validere disse funnene vi foretok Western blot analyse av bukspyttkjertelen celle secretomes og sammenlignet disse med tilsvarende cellelysatene. Deteksjon med antistoffer rettet mot aminoterminus av Fat1 proteinet avslørte overveiende et enkelt bånd litt over 460 kDa i secretomes med tilhørende cellelysatene fra kreftceller som viser et bånd av lignende mobilitet (figur 1). I motsetning til dette, HDPE celler oppviste liten reaktivitet for Fat1 i secretome og hovedbåndet påvist i lysatene syntes større tyder det kan være post-translasjonelle forskjeller. Siden bandet intensiteter i secretomes korrelerte med peptid teller bestemmes for hver respektive cellelinje (tabell 1), tatt sammen disse dataene gir god dokumentasjon på at Fat1 er svært rik på de secretomes av bukspyttkjertelkreft cellelinjer, men i mindre grad i deres normale celle kolleger
Western blot analyse av Fat1 i de respektive secretome. (S; 8 mikrogram lastet) og lysat (L; 50 ug lastet) fraksjoner fra fire bukspyttkjertelen cellelinjer og HPDE. Blottet ble undersøkt med et antiserum mot ekstracellulære domenet til Fat1 (ECD1).
Fat1 i bukspyttkjertelkreft secretome består av skur ekstracellulære domenet
Den tilsynelatende molekyl området ( Mr) til de Fat1 bandet i bukspyttkjertelkreft secretomes er i størrelsesorden av den forutsagte Mr av full-lengde kjerne Fat1 polypeptid av 505 kDa (figur 1). Mens nominelt dette tyder på at utskilt Fat1 kan være intakt, innretting av de identifiserte peptidene til Fat1 aminosyresekvensen viste at alle peptider utelukkende stammer fra de ekstracellulære domener (ECD, aminosyrer 1-4180) med det mest C-terminale aminosyren er identifisert i en peptidkartlegging til AA-3997 (fig. 2 og fil S1).
Massespektrometrisk-analyser ble utført med alle seks secretomes og Fat1 spesifikke peptider ble påvist som begynner nær aminoenden ned til og med EGF domene ( se filen S1 for detaljer). Vist her er justeringer av Fat1 spesifikke peptider fra tre eksempler på resultater med høy sekvensdekning i den delen av aminosyrene 3500 ned til C-terminus på AA4588 (i henhold til HPRD).
Videre eksistensen av et større band i HPDE cellelysat antydet, at posttranslational modifikasjoner kan bidra til den totale størrelsen av protein isoformer som ofte er observert for TM proteiner, inkludert mange cadherins. Faktisk deglykosylering eksperimenter bekreftet at omtrent en ytterligere 70 kDa av den totale proteinmasse er på grunn av glykosylering av de cellulære former, og av den oppløselige formen av Fat1 (figur S2). Når det gjelder de signaler som i cellelysatene, den meget høye Mr båndet til stede i HPDE-celler tyder disse hovedsakelig uttrykker full-lengde glykosylert protein. Den litt mindre bånd er tilstede i kreftcellelysatene kan representere den N-terminale del av den nylig beskrevne Fat1 heterodimer, som består av en N-terminal gp 490 (P420), og en P85 C-terminale transmembrane fragment. Denne ikke-kovalent bundet heterodimer fremstilles ved endoproteolytic S1-spalting i trans-Golgi-nettverk [25] før den når plasmamembranen. For å klargjøre innholdet i Fat1 stede i secretome og for å bekrefte identiteten til bandene observert i cellelysatene, foretok vi Western blot analyser med domene spesifikke antistoffer [25].
Figur 3 sammenligner en representant secretome brøkdel sammen celle lysates fra dyrkede bukspyttkjertelen celler. Blottet ble probet med antistoffer rettet mot det intracellulære domenet av Fat1 som lett detekterer et enkelt bånd av 500 kDa i cellelysatene i klar kontrast til den secretome der ingen signaler var tydelig. Deretter ble den samme blott inkubert med antistoffer rettet mot et ekstracellulært domene Fat1 hvor bukspyttkjertelen cellelysater ga to tett plasserte bånd i cellelysatene: det øvre bånd er identisk med den som detekteres av intracellulære antistoffer. Den manglende reaktivitet av det nedre band med intracellulære domene antistoffer som identifiserer denne dublett av band som hele lengden og heterodimeriske former av Fat1, henholdsvis (figur 3). Videre, som forventet fra MS-resultatene, ekstracellulære domene antistoffer ga sterke signaler i secretome prøven. Kollektivt, resultatene av både biokjemiske og massespektrometrisk (MS) analyser indikerer at Fat1 tilstede i secretome helt mangler C-terminale rester. Siden begge kjente former for mobilnettet Fat1 er TM proteiner, overbevisende konklusjon fra disse dataene er at Fat1 påvises i secretome representerer ekstracellulære Shedding gjennom proteolytisk spalting i sitt ekstracellulære domene nedstrøms fra lamG domene. Ved Western blotting av cellelysatene kunne vi ikke finne bevis for tilstedeværelsen av en C-terminal rest fragment forventes å oppstå fra ectodomain Shedding, heller ikke vi oppdage P85 C-terminale fragment fra heterodimer.
Cellelysater (75 ug hver) og en representativ secretome (8 ug) ble blottet sammen med et protein markør (M). Den samme Blottet ble probet først, med et antiserum dannet mot det cytoplasmatiske domene (CTD) av Fat1 og deretter med et antiserum dannet mot det ekstracellulære domenet (ECD 2). Beta-Tubulin, endelig, ble anvendt som en kontroll for lasting cellelysat. Den ekstracellulære domene spesifikke antistoffer, bare registrere behandlet celleform og utgitt Fat1 i secretome.
Dermed neste utførte vi immunpresipitasjonsanalyse med domene spesifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved hjelp av tre representative adenokarsinom celle linjer. Ved hjelp av biotinylering å merke celleoverflateproteiner, viser denne analyse nærvær av primært to uløselige bånd utfelt med N- og C-terminale spesifikke mAbs i de fleste cellelinjer undersøkt. Etterfølgende Western blotting med et ekstracellulært domene spesifikt antistoff gjenkjenner større båndet eneste, mens det intracellulære domenet spesifikke antistoffkarakter både store celleformer (figur 4). Dette gir ytterligere bevis på dobbel behandling, hvorved begge full lengde og heterodimeriske former av Fat1 oppstår på celleoverflaten av pankreas adenokarsinom-celler som tidligere beskrevet for melanomceller. Spesielt, den intracellulære C-terminale domene spesifikt antistoff viste også nærværet av P85 båndet som indikerer den heterodimer (figur 4). Mest påfallende en -60 kDa båndet i overensstemmelse med den forventede ble observert ectodomain shedding spaltingssete i BxPC3 cellelysat og i mindre grad i PaCa44 celler. P60 bånd ble bare utfelt med C-terminal-spesifikk mAb som indikerer den representerer et produkt som ikke lenger er i forbindelse med det ekstracellulære domene. Dette er også i tråd med tidligere observasjoner i melanomceller [25]
Cells (Panc1, BxPC3 og A818-4) ble merket med biotin, lysert og utfelte med Fat1 spesifikke monoklonale antistoffer (NTD7 og CTD7.); protein A /G-perler ble anvendt som en kontroll. Den første inkubering av blottet med Neutravidin-HRP angitt bånd med høy molekylvekt som svarer til de kjente høye Mr former Fat1 og en antagelig crossreactive protein ved ≈200 kDa. Påfølgende Western blotting med det ekstracellulære domenet spesifikt antiserum igjen oppdager de to høye Mr former Fat1. Til slutt, Western blotting med det intracellulære domenet spesifikt antiserum detekterer den full-lengde proteinet og P85 C-terminale rest-fragment avledet fra klassisk behandling i både Fat1 bunnfall, noe som bekrefter foreningen av de N-terminale og C-terminale deler. En ekstra p60 er utelukkende påvises i bunnfallet ved hjelp av det intracellulære domenet-spesifikt antistoff med sterke signaler i BcPC3 og uke signaler i A818-4 lysatene. Immunoutfelling (IP) analyse av Fat1 etter celleoverflate-merking av Panc1, BxPC3 og A818-4 celler med biotin. IP-er ved hjelp av domene spesifikke mAbs mot Fat1 sammen med en kontroll (protein A /G-kuler inkubert med lysater) ble først undersøkt med Neutravidin å dekorere proteiner på celleoverflaten etterfulgt av polyklonale antistoffer mot ECD og CTD som vist. Bands er merket gp575, gp490 og P85 som per A) med p60 betegner en ytterligere proteolytisk produkt.
Shedding av Fat1 cadherin innebærer ADAM10
Metallproteaser ofte regulere ectodomain utgytelsen av TM-reseptorer med membran forankret ADAM familie metallproteasene ofte involvert. mRNA profilering av pancreatic cellelinjer viste et begrenset uttrykk mønster av ADAM familiemedlemmer (tabell S2). ADAM10 spesielt er sheddase blir i stor grad ansvarlig for ectodomain Shedding av E-cadherin og LI-cadherin i kolorektal kreftceller (upubliserte data) og fire av de fem kreftcellelinjer vises høyere ADAM10 nivåer enn HPDE celler. På proteinnivå, ble ADAM10 spesifikke peptider ikke oppdaget i secretome kataloger, men i de beriket exosomes ved MS, nemlig ni kamper i HPDE exosomes og 62 kamper i Panc1 exosomes; ingen annen Adams ble påvist i disse katalogene (data ikke vist). Sammen disse dataene gir en begrunnelse for å undersøke hvilken rolle ADAM10 i Fat1 ectodomain Shedding.
For å vurdere involvering av metalloproteinaser og spesielt ADAM10 i Fat1 ectodomain Shedding, ble menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med det brede spekteret proteasehemmer Batimastat og den ADAM10 spesifikk hemmer GI245023X [28], [29]. Western blotting av Fat1 i secretomes i Paca44 og Panc1 cellelinjer viste Batimastat behandling reduserte nivåer av ectodomain utgytelsen av Fat1 til under kontrollnivåer. Den GI254023X inhibitor var like effektivt å redusere nivåene av ectodomain felle Fat1 i begge cellelinjer (figur 5A). Kvantitativ vurdering av effektene av disse midlene i tre påfølgende forsøk viste at Batimastat betydelig hemmet Fat1 Shedding i Panc1 og Paca44 celler (figur 5B) og bekrefter dermed rollen som metalloproteinaser i denne prosessen. Virkningene av GI254023X var tilsvarende som tyder på at ADAM10 er involvert i Fat1 shedding i disse cellene. Imidlertid har noen rapporter antydet at GI254023X ved de konsentrasjoner som benyttes, kan også ha en viss virkning på matriks-metallproteaser (MMP’er), f.eks [27], og videre forsøk ble utført med RNAi mot ADAM10.
Tallet i A) viser en representativ Western blot. PaCa44 og Panc1 cellene ble inkubert i serumfritt medium i to dager med tilsetning av enten den bredspektrede metallprotease-inhibitor Batimastat (B, 10 uM), eller den ADAM10-spesifikk hemmer GI245023X (GI, 5 uM) eller oppløsningsmiddel som en kontroll ( C, DMSO). Secretomes, 8 mikrogram protein per prøve, ble analysert ved Western blot analyse ved hjelp av Fat1 ECD2 polyklonale antistoff. Blotting mot transferrin ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Fat1 bestemte signaler fra tre uavhengige eksperimenter ble kvantifisert og normalisert med transferrin-signaler. Baren grafene viser gjennomsnittsverdiene +/- S.E.M. fra tre eksperimenter
Behandling av Paca44 og Panc1 kreft i bukspyttkjertelen celler med ADAM10 bestemt siRNA tomannsboliger resulterte i . 90% knockdown av ADAM10 protein nivåer stabil i 96 timer (figur 6). Undersøkelse av den secretome viste en samtidig reduksjon i løselig Fat1 nivåene produsert av Panc1 og Paca44 celler (figur 7). Selv om ADAM10 nivåene ble redusert til under 10% av kontrollnivåene den maksimale reduksjon i Fat1 sekresjon observert var rundt 50% av kontrollene. Tilsvarende reduksjoner i utskillelsen av E-cadherin, et kjent mål for ADAM10, ble observert i parallelle eksperimenter foretatt med de kjemiske hemmere eller ADAM10 siRNA tomannsboliger (figur S3 A og B). Kollektivt dette tyder på at ADAM10 er en signifikant effektor av Fat1 shedding men ikke den eneste er involvert.
