Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. I USA, bare én av seks lungekreftpasienter overlever fem år etter diagnose. Denne statistikken kan bli bedre hvis nye terapeutiske mål er identifisert. Vi har tidligere rapportert at et enzym av fettsyremetabolisme, meget langkjedet acyl-CoA-syntetase 3 (ACSVL3) er overuttrykt i maligne gliomer, og at tappe glioblastom celler av ACSVL3 minsker deres ondartede egenskaper. For å avgjøre om ACSVL3 uttrykk ble også økt i lungekreft, studerte vi svulst histologiske snitt og lungekreftcellelinjer. Immunhistokjemisk analyse av normal human lunge viste moderat ACSVL3 ekspresjon bare i bronkiale epitelceller. I motsetning til dette er alle 69 forskjellige lungesvulster testet, inkludert adenovirus, platecelle, stor celle, og små karsinomer, hadde robust forhøyet ACSVL3 nivåer. Western blot-analyse av lungecancercellelinjer avledet fra disse tumortyper hadde også signifikant økt ACSVL3 protein sammenlignet med normale bronkiale epitelceller. Avtagende vekst av lungekreftcellelinjer ikke endre ACSVL3 uttrykk. Imidlertid banket ned ACSVL3 ekspresjon av RNA-interferens redusert cellevekstrater i kultur med 65-76%, og evnen av tumorceller til å danne kolonier i bløt agar suspensjon ved 65-80%. Vi har også gjennomført studier for å få en bedre forståelse av de biokjemiske egenskaper av menneskelig ACSVL3. ACSVL3 mRNA ble påvist i mange humane vev, men den uttrykksmønster noe forskjellig fra den til mus. Enzymet aktiverte lang- og meget langkjedete mettede fettsyre substrater, så vel som langkjedede mono- og flerumettede fettsyrer til deres respektive koenzym A-derivater. Endogent humant ACSVL3 protein ble funnet i en punktformet subcellulære kupé som delvis colocalized med mitokondrier som bestemmes av immunfluorescens mikroskopi og subcellulære fraksjonering. Fra disse studiene konkluderer vi med at ACSVL3 er en lovende ny terapeutisk mål i lungekreft
Citation. Pei Z, Fraisl P, Shi X, Gabrielson E, Forss-Petter S, Berger J et al. (2013) Very Long-Chain acyl-CoA syntetase 3: Overuttrykte og vekst Dependence i lungekreft. PLoS ONE 8 (7): e69392. doi: 10,1371 /journal.pone.0069392
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 02.07.2012; Akseptert: 13. juni 2013, Publisert: 23.07.2013
Copyright: © 2013 Pei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir HD024061, NS037355, og NS062043 (PAW) og den østerrikske Science Fund (FWF) P14163-MOB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Acyl-CoA-syntetaser (ACS) katalyserer den ATP-avhengige thioesterification av fettsyrer (FA) for å koenzym A (CoA) [1]. Denne «aktivering» trinnet er nødvendig for FA å delta i nesten alle etterfølgende metabolske reaksjoner. Basert på deres acylkjede-lengden preferanse, så vel som deres aminosyresekvens homologi, de 26 forskjellige ACSS funnet i mennesker kan deles inn i flere forskjellige familier av enzymer, inkludert «meget langkjedet» (ACSVL) familien, som inneholder 6 medlemmer. Fem enzymer i ACSVL familien kan aktivere lang aller langkjedede FA underlag; det sjette medlem av denne familien er en leverspesifikk gallesyre-CoA-syntetase [2]. I tillegg til deres metabolske funksjoner, har disse enzymene også blitt undersøkt som FA transportproteiner (FATP) [3], som tre av de seks familiemedlemmer fremme cellulært opptak av langkjedede FA [4]. Den offisielle betegnelsen på de genene som koder for ACSVL /FATP familien er
SLC27A1-6
Vi har tidligere beskrevet egenskapene til mus ACSVL3 (Slc27a3; FATP3). [5]. Når ACSVL3 ble overuttrykt i COS-7-celler, protein lokalisert til det endoplasmatiske retikulum. Men den endogene enzymet i MA-10 mus testis Leydigcellene delvis colocalized med mitokondrier av både differensialsentrifugering og immunfluorescens. Forbigående knockdown av ACSVL3 ved hjelp siRNA redusert evne til MA-10-celler til å aktivere enten langkjedede (palmitat, C16:0) eller meget langkjedet (lignocerat; C24:0) FA. Imidlertid gjorde ACSVL3 knockdown ikke påvirke evnen til MA-10-celler til å ta opp C16:0. Sistnevnte observasjon ble senere bekreftet ved ekspresjon av pattedyr ACSVL3 i gjær mislyktes i å fremme langkjedede FA-opptak [4]. Northern blot og Western blot analyser av voksne mus vev viste at enzymet er uttrykt primært i adrenal kjertel, eggstokk, og testis, med svakere ekspresjon i andre vev så som hjerne, lunge og nyre [5]. Høye nivåer av ACSVL3 mRNA var tilstede i embryo (E12) mus hjernen; imidlertid uttrykk raskt redusert og etter en måneds alder, mRNA var knapt synlig.
Voksen mus hjernen seksjoner viste svak ACSVL3 farging i kortikale nevroner, hippocampus nevroner og lillehjernen Purkinje celler, men proteinet ble ikke oppdaget i gliaceller [5]. Det var derfor uventet da vi har funnet ACSVL3 ikke markert overuttrykt i maligne gliomer og i human glioblastoma cellelinjer [6]. Knocking ned ACSVL3 uttrykk i menneske U87 glioblastom celler redusert sin ondartet oppførsel både i kultur og når injiseres enten subkutant eller intracranially i mus. Derfor spurte vi om ACSVL3 er uttrykt i andre menneskelige ondartede sykdommer som lungekreft, som er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [7]. I denne artikkelen viser vi at ACSVL3 er sterkt overuttrykt i alle lungesvulster og cellelinjer undersøkt. I lunge kreft cellelinjer, ACSVL3 uttømming betydelig forbedret sine ondartede vekstegenskaper. Vi beskriver også flere biokjemiske egenskaper ved menneskelig ACSVL3.
Materialer og metoder
Material
[1-
14C] palmitinsyre (C16:0), [1 –
14C] oljesyre (C18:1), [1-
14C] arakidonsyre (C20:4), [1-
14C] dokosaheksaensyre (C22:6) og [1-
14C] lignocersyre syre (C24:0) ble hentet fra Moravek Biochemicals Inc. (Brea, CA, USA). [1-
14C] linolsyre (C18:2) var fra amerikanske Radiomerket Chemicals (St. Louis, Missouri, USA). Polyklonalt sau antiserum til 70 kDa peroksisomal membran protein (PMP70) var en gave fra Dr. S. Gould (Johns Hopkins Univ. Sch. Med.). Mus monoklonalt antistoff mot protein-disulfid-isomerase og polyklonalt kanin-antistoff til mangan-superoksyd dismutase (MnSOD), var fra Stressgen (San Diego, CA, USA). Polyklonale kanin antistoff til ATP syntase var fra Chemicon (Chemicon International, Temecula, CA, USA). Polyklonale kanin antistoff til fosfatidyletanolamin N-metyltransferase 2 (PEMT), var en gave fra Dr. D. Vance (University of Alberta, Edmonton, Canada). Affinitetsrenset polyklonalt kanin-anti-ACSVL3 antistoff ble tidligere beskrevet [5]. HRP-konjugerte sekundære antistoffer for Western blot var fra enten Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) eller Santa Cruz Bioteknologi, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), og sekundære antistoffer for immunfluorescens var fra Jackson Immunoresearch (West Grove , PA, USA). De identifiserte, formaldehyd fiksert parafinsnitt av humane lungekreft vev fra to pasienter ble innhentet og brukt i samsvar med en protokoll godkjent av Johns Hopkins Riks mennesker forskning Institutional Review Boards (Protocol NA_00003308); denne protokollen tillater bruk av avidentifiserte vev uten ekstra skriftlig samtykke (annet enn det som inngår i prosedyren samtykkeerklæringer). En vev array (katalog # CBL-TMA-078) som inneholder normal human lunge og 67 forskjellige lungesvulster ble kjøpt fra Creative Biolabs (Port Jefferson Station, New York).
Kloning av menneske ACSVL3 cDNA og konstruksjon av ekspresjonsplasmider
Full-lengde ACSVL3 sekvens ble oppnådd ved å bruke en kombinatorisk tilnærming til uttrykk sekvens tag (EST) screening og isolering av assosierte sekvenser ved hjelp av ulike kloningsstrategier. I korte trekk, en enkelt klon (C24355, Stratagene;. GenBank Accession no BC003041) som inneholdt en lang men 5′-unbounded åpen leseramme ble anvendt som en basis for å oppnå ytterligere 5′-sekvens, ved anvendelse av genomisk primer walking. Den senere identifiserte 5 «utvidet genomisk DNA-sekvens som tjente til å identifisere en ytterligere EST-klon, som stammer fra et bibliotek anriket i full-lengde kloner som var blitt oppnådd via de Cap-fangstmetode [8], plassert oppstrøms for den første ATG i klon BC003041 . Denne nye EST klone (GenBank Tiltredelse nei. BG720126), kan være på linje med genomisk DNA og ga romanen cDNA sekvensen fra posisjon -115 til 179, som fungerte som en mal for videre primer design for å oppnå full-lengde cDNA . En konstruksjon med en fullstendig åpen leseramme av det humane ACSVL3-genet ble satt sammen i en to-trinns protokoll. Først, et 2480-bp
Hind III-
EcoR
I-fragment ble skåret ut fra cDNA-klon C24355 og satt inn i ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), hvilket ga p434. I det andre trinnet ble en 915-bp PCR-fragment amplifisert fra ekson 1 av den genomiske klonen ACSVL3, ved hjelp av forover primer, 549 (5′-CGCCAAGCTTAGCCAGATGCCTAAA-3 «), med ATG (1) understreket, og revers primer 530 (5»-AGCGCCACAGTTGCTCCAGGT-3 «), renset, spaltet med
Hind III
(innført med primer 549) og
Eco47
III, et unikt restriksjonssete i ACSVL3 cDNA og klonet inn i
Hind
III,
Eco47
III fordøyd p434, noe som resulterer i plasmid p435, som inneholder full-lengde konstruere av ACSVL3. DNA-sekvensering ble utført av MWG Biotech (Ebersberg, Tyskland).
cellelinjer og vekstvilkår
Menneske HepG2 hepatoma, COS-en, og A549, H82, H460, EKVX, og U1752 lunge kreftcellelinjer var fra ATCC (Rockville, MD). HepG2-celler ble opprettholdt i minimalt essensielt medium (Mediatech, Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gemini Bioproducts). COS-1-celler ble dyrket i DMEM (Mediatech) supplert med 10% FBS. Alle lungecancercellelinjer ble holdt i RPMI (Mediatech) supplert med 10% FBS. Udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller (HBEC) [9] ble sjenerøst gitt av Dr. Jerry Shay (University of Texas Southwest Medical Center), og ble opprettholdt i serumfritt BEGM (bronkial Epitelial vekstmedium, Lonza, Walkers, MD). Alle celler ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C under 5% CO
2/95% luft.
Produksjon av Klonale linjer med stabil ACSVL3 knockdown og Måling av heftende og forankrings-uavhengig cellevekstrater
kloner med stabil knockdown av ACSVL3 ble fremstilt ved bruk av pSilencer ™ 4,1-CMV-vektoren hygro (Ambion) som tidligere beskrevet [6]. Vektorer som inneholder knockdown sekvenser ACSVL3-3 (målgruppe nukleotider 397-415) og ACSVL3-4 (målretting nukleotider 1863-1881), som begge ble tidligere vist å redusere ACSVL3 uttrykk i humane celler, ble transfektert sammen til A549, EKVX, H82, og H460 lunge kreft cellelinjer ved elektroporasjon. Kontroll celler ble transfektert med en pSilencer vektor (levert av Ambion) som ikke rettet mot noe menneske mRNA sekvens. Kloner som stabilt skjuler kontroll og knockdown plasmider ble valgt av hygromycin (250 ug /ml) resistens og analysert for ASCVL3 ekspresjon ved immunfluorescens og Western blot. Celleproliferasjon og forankrings-uavhengig vekst ble målt som tidligere beskrevet [6].
RNA dot blot og Northern blot analyser
En multippel vev uttrykket (MTE) matrise inneholdende poly (A) -selected RNA fra 61 forskjellige voksne humane vev ble oppnådd fra Clontech. Et cDNA sonde ble utarbeidet av PCR forsterkning av en 657-bp fragment (posisjon 1631-2287 av ACSVL3 /SLC27A3 mRNA, NCBI tiltredelse # NM_024330) ved hjelp av 5′-GCACTGTATGGCCACATCTCC-3 «og 5′-TCTCTCAGGTGCCTCAGGTGT-3′ som forover og bakover -primere, henholdsvis, og plasmid p435 inneholdende full-lengde ACSVL3 cDNA som templat. For å verifisere spesifisitet av sonden for ACSVL3, en BLAST søk og flersekvenssammenstillinger med de andre medlemmene av ACSVL /SLC27A familie ble utført og viste ingen likhet til SLC27A1, 4 og 5, og kun lav likhet med SLC27A2 og 6 ( ikke vist). For kontroll ble et 528 bp-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) probe fremstilt ved PCR ved anvendelse av 5»-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3 «og 5′-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3» som forover og revers primere, respektivt. Betingelser for å probe merking, hybridisering og påvisning ble som tidligere beskrevet [10], [11]. Hybridisering til GAPDH sonden var robust for alle mRNA flekker (ikke vist).
For Northern blot analyse, ble det samme sonde som for MTE rekke hybridisert til et menneske flere vev Northern blot (Ambion, Austin, TX, USA); en kylling β-actin probe ble anvendt som en kontroll. Hybridisering ble utført ved anvendelse av Express hybridisering oppløsning (Clontech) over natten ved 65 ° C og vasking ved lav stringens ved anvendelse av 2 x SSC, 0,05% SDS i 40 min ved 65 ° C, etterfulgt av 0,1 x SSC, 0,1% SDS i 40 min ved 50 ° C for høyere stringens. Hybridisering av prober ble påvist ved eksponering for Molecular Imager FX-system (Bio-Rad).
subcellulære fraksjonering og Western blot-analyse
HepG2-celler ble fraksjonert som tidligere beskrevet [12]. Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [13]. For immundeteksjon mus anti-MnSOD, ble kanin-anti-PEMT eller kanin-anti-ACSVL3 primære antistoffer anvendes sammen med HRP-konjugert anti-kanin og anti-muse sekundære antistoffer.
Indirekte immunfluorescens og Immunhistokjemi
HepG2-celler dyrket til -60% konfluens på dekkglass ble fiksert i 4% formaldehyd i PBS og permeabilisert med 1,0% Triton X-100 før inkubering med primær (kanin-anti-ACSVL3, sau anti-PMP70, mus anti-protein disulfid isomerase, eller kanin-anti-ATP syntetase) og sekundære (FITC-konjugert anti-kanin eller rhodamin-konjugert anti-mus eller anti-sau IgG) antistoff som tidligere beskrevet [14]. Fluorescens ble visualisert ved hjelp av et Zeiss Axiovert epifluorescens mikroskop. Immunohistokjemisk påvisning av ACSVL3 i histologiske snitt av humane lungetumorer ble som tidligere beskrevet [5], [6].
Acyl-CoA-syntetase-analysen
COS-1-celler ble transfektert med ACSVL3 uttrykket plasmid p435 eller tom vektor via elektroporering som tidligere beskrevet [15]. Cellene ble høstet 3 dager etter transfeksjon, ble vasket, suspendert i homogeniseringsbuffer, og ble lagret ved -80 ° C før analyse. Aktivering av [1-
14C] -merket FA (C16:0, C24:0, C18:1, C18:2, C20:4 eller C22:6) til deres CoA tioestere ble utført som beskrevet tidligere [15] . Analyser med C16:0 inneholdt 15 mikrogram av COS celle protein, analyser med C24:0 inneholdt 60 mikrogram protein, og analyser med all annen FA inneholdt 50 mikrogram protein.
Fatty Acid Composition
H460 og EKVX celler ble dyrket til nær konfluens, høstet ved mild trypsinisering og vasket med fosfat-bufret saltløsning. Cellepelletene som inneholdt 1,0 mg protein ble ekstrahert, derivatisert med Pentafluorobenzyl bromid, og kvantifisert ved kapillær gasskromatografi-elektron-capture negativ-ion-massespektrometri (GC /MS) som beskrevet av Lagerstedt et al. [16]. Resultatene er presentert som prosent av totale fettsyrer.
Resultater
Tissue Distribution of Human ACSVL3 mRNA
ACSVL3 mRNA uttrykk ble undersøkt av RNA dot blot analyse ved hjelp av en flere vev uttrykk (MTE ™) matrise som inneholder 61 voksent menneske vevsprøver (fig. 1a). Signalstyrken for hvert enkelt punkt ble kvantifisert og ACSVL3 ekspresjon relativt til GAPDH ble beregnet. De sterkeste normaliserte ACSVL3 signalene var til stede i bukspyttkjertel, mage, aorta, og milten. I det kardiovaskulære systemet, ACSVL3 mRNA var spesielt anriket i aorta, i forhold til alle områder av hjertet. Den ACSVL3 transkriptet var relativt rikelig i hele fordøyelsessystemet, noe som indikerer en mulig rolle i intestinal-FA-metabolisme. MRNA kan også bli lett oppdages i de fleste lymfevev, og i reproduksjonssystemet og urinveiene. Moderat signalintensitet ble innhentet fra de fleste kjertler, bortsett fra melkekjertlene og hypofysen hvor nivået dukket høyere. Nesten alle områder av sentralnervesystemet, med unntak av cerebellum og hypofysen, hadde svært lav ACSVL3 mRNA-nivåer. ACSVL3 ekspresjon i skjelettmuskel var også meget svak. Ingen signal som indikerer ikke-spesifikk binding av proben til ACSVL3 ulike kontroll RNA og DNA-prøvene ble observert.
(
A
) Humant multiple tissue uttrykket (MTE ™) matrise RNA dot blot-analyse. RNA dot blot ble hybridisert med en
32P-merket 657-bp PCR-fragment avledet fra den humane ACSVL3 cDNA, som beskrevet i Metoder. Membranen ble strippet og hybridisert med et GAPDH-probe for å kontrollere mRNA-overflod. Signalintensiteten av de enkelte punkter ble kvantifisert ved bruk av ImageJ programvare (tilgjengelig fra: https://rsbweb.nih.gov/ij/download.html), og den ACSVL3 uttrykket forhold til den for GAPDH ble beregnet. (
B
) Humant multiple tissue Northern blot inneholdende 2 ug av poly (A)
+ – valgt RNA ble hybridisert med den samme ACSVL3 cDNA-proben som i
(A)
. Banene er: M, Millenium Markers ™; 1, hjerne; 2, leveren; 3, placenta; 4, tynntarmen; 5, tykktarm; 6, thymus; 7 milt; 8, prostata; 9, testikler; og 10, eggstokk. Omtrentlige størrelser av de detekterte bånd er vist til høyre. Kontroll hybridisering med β-actin probe er vist i bunnpanelet.
For å etablere størrelsen av ACSVL3 mRNA, ble en human multiple tissue Northern blot hybridisert med proben anvendt for MTE blot. Denne sonden oppdaget en 2,7 kb ACSVL3 avskrift i alle vev unntatt hjernen (Fig. 1B, øverst). Fraværet av et signal fra hjernen prøven er sannsynlig på grunn av den lave mengden av mRNA til stede i dette felt, som dokumentert ved β-aktin-kontroll (Fig. 1B, nederst). MRNA-størrelse er lik den som er forutsagt fra cDNA ACSVL3. Et annet mRNA arter på ca 1,5 kb dukket opp i leveren, testikler og prostata (Fig. 1B, øverst). Dette mindre mRNA var mest rikelig i leveren, og derfor bidrar sannsynligvis til den høye signal i leveren på dot-blot. Den lille størrelsen på dette krysshybridiserende sekvens ikke ville være i stand til å betjene den åpne leserammen til en typisk ACS og derfor ikke ble analysert ytterligere. Totalt er det en god korrelasjon av uttrykket nivåer mellom Northern blot og rekke multi vev.
acyl-CoA syntetase aktivitet of Human ACSVL3
Vi analyserte funksjonsevne av menneskelig ACSVL3 protein for å aktivere FA til sine CoA tioestere følgende overekspresjon i COS-1 celler. Sammenlignet med COS-1-celler transfektert med tom vektor, celler som uttrykker ACSVL3 viste økt ACS aktivitet når de ble analysert med flere FA substrater. Statistisk signifikant økning i aktivering av palmitinsyre (C16:0), oljesyre (C18:1ω9), α-linolensyre (C18:2ω6) og arakidonsyre (C20:4ω6) ble observert (fig. 2). Selv om vi rutinemessig målt økt kapasitet for å aktivere den svært langkjedet FA, lignocersyre syre (C24:0), dette nådde ikke statistisk signifikans. En svak økning i aktivering av dokosaheksaensyre (C22:6w3) ble også observert, men ble ikke statistisk signifikant. I likhet med hva som har blitt vist for andre ACSVL enzymer [15], [17], [18], overexpressed ACSVL3 protein aktivert langkjedede FA i større grad enn svært langkjedede FA.
COS-1 celler som overuttrykker ACSVL3 (grå søyler) fra plasmid p435 (se Methods) og kontrollceller transfektert med tom vektor (hvite søyler) ble analysert for ACS aktivitet ved hjelp av angitt
14C fettsyre som substrat som beskrevet i metoder. En enhet (U) av enzymaktivitet = 1 umol /min. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter transfeksjonsteknikker. ns, ikke signifikant. p-verdier: * 0,05; ** 0,01; ***. 0,001
ACSVL3 subcellulære lokalisering i HepG2 celler
Indirekte immunfluorescens ble brukt til å lokalisere endogent ACSVL3 i menneske hepatoma cellelinje HepG2. ACSVL3 oppviste en punktformet fluorescens mønster når observert ved konfokal mikroskopi (fig. 3a, d og g). ACSVL3 farging av disse punctate strukturene ikke colocalize med enten peroksisomal markør, PMP70 (fig. 3b og c) eller det endoplasmatiske retikulum markør, protein-disulfid-isomerase (fig. 3e og f). ACSVL3 immunofluorescens colocalized delvis med mitokondrier visualisert ved hjelp av ATP-syntase som en markør (fig. 3h og i).
Konfokalmikroskopi ble anvendt for å detektere endogent ACSVL3 i HepG2 celler ved farging med anti-ACSVL3 antistoff (a, d, og g). Dobbeltmerking med anti-ACSVL3 (a) og anti-PMP70 (b) viste at punctate ACSVL3-holdige vesikler ble ikke peroxisomes når bildene ble slått sammen (c). Dobbeltmerking med anti-ACSVL3 (d) og anti-protein-disulfid-isomerase (e) som en markør for endoplasmatiske retikulum viste ingen colocalization i det flettede bildet (f). Dobbelt merking ved hjelp av anti-ACSVL3 (g) og anti-ATP syntase (h) viste delvis colocalization av ACSVL3 med mitokondrier i det sammenslåtte bildet (i).
For å karakterisere videre subcellulære lokalisering av ACSVL3 , HepG2-celler ble fraksjonert ved differensiell sentrifugering. Homogenater ble separert i fraksjoner som er anriket i atomkjerner (N), mitokondrier (M), peroxisomes (L), endoplasmatiske retikulum (P), og den membran-fri cytosol (S), og analysert ved Western blotting. ACSVL3 ble funnet primært i M-fraksjonen (fig. 4), som indikert ved tilstedeværelsen i det mitokondrielle markørprotein MnSOD. I mindre grad proteinet kan også påvises i den N-fraksjonen. Ingen ACSVL3 signal kunne påvises i L-, P- eller S-fraksjoner. Tilstedeværelsen av ACSVL3 i den N-fraksjonen er sannsynligvis på grunn av forurensning med ufullstendig homogeniserte celler, som MnSOD og fosfatidyletanolamin N-metyltransferase 2 (PEMT) ble også påvist i denne fraksjonen (fig. 4).
HepG2 celler ble fraksjonert i kjerne (N), mitokondriell (M), lett mitokondrielle (L), mikrosomale (P), og cytosoliske (S) fraksjoner ved differensialsentrifugering, og en total mitokondriell (ML) fraksjon ble videre separert i renset mitokondriell (Mito ) og mitokondrier-assosiert membran (MAM) fraksjoner, som beskrevet i Metoder. Hvert felt ble ladet med ~ 30 ug protein. Western blot analyser av den samme membran ble utført ved anvendelse av antistoffer mot ACSVL3, mitokondrie markør Mn-superoksyd-dismutase (MnSOD), og MAM markør fosfatidyletanolamin N-metyltransferase (PEMT).
På grunn av colocalization ACSVL3 og mitokondrier av immunfluorescens var ikke fullstendig, vi spekulert i at ACSVL3 kan finnes i mitokondriene-tilknyttede membran (MAM) fraksjon, en endoplasmatiske retikulum-avledet kupé som sedimenter med mitokondrier i løpet av differensialsentrifugering [19]. Derfor besluttet vi MAM fraksjon fra renset mitokondrier ved sentrifugering gjennom Percoll. MAM-spesifikke markørprotein, PEMT, ble påvist i fraksjon MAM eneste, noe som viser den vellykkede separering av mitokondrier og MAM. Det var en betydelig anrikning av ACSVL3 signal i renset mitokondriene, men proteinet var ikke påvisbart i MAM fraksjon (fig. 4). Som vi observerte bare delvis colocalization av ACSVL3 med mitokondrier ved immunfluorescens analyse (Fig. 3), til tross for sin sedimentering i denne fraksjonen og dens fravær fra MAM fraksjon, foreslår vi at ACSVL3 protein er bosatt i en roman subcellulære kupé som er forskjellig fra, men tett forbundet med mitokondrier. Et lignende resultat ble oppnådd for murine ACSVL3 [5].
ACSVL3 Expression i normal human lunge og lungesvulster
Vi har tidligere rapportert at, til tross for svake uttrykk i hjernen og i hovedsak noen påviselig protein i gliaceller, ACSVL3 nivåer ble forhøyet robust i ondartet gliom og i human glioblastoma cellelinjer [6]. For å finne ut om andre kreftformer uttrykt ACSVL3, undersøkte vi uttrykket av dette proteinet i normal menneskelig lunge og lungesvulster ved immunhistokjemi. Modest ACSVL3 ekspresjon ble observert i normale bronchial og bronchiolar epitelceller (fig. 5). Ingen ACSVL3 histokjemisk farging ble observert i type I eller type II alveolare celler, slimceller, stromaceller, eller celler som omfatter pulmonale kar. I kontrast, vevssnitt fra svulster resected fra to pasienter ved Johns Hopkins Hospital, en diagnostisert adenokarsinom og andre som plateepitelkarsinom, viste svært høye ACSVL3 nivåer (ikke vist). For å bekrefte disse innledende observasjoner, utførte vi immunhistokjemisk analyse på en vev array som inneholder 67 forskjellige humane lungesvulster. Representert på tabellen var 25 plateepitelkarsinom, 21 adenokarsinomer, 6 papillær adenokarsinomer, 7 små cellekreft, 3 store cellekreft, en bronchioloalveolar karsinom, en basaloid plateepitelkarsinom, og 3 karsinoider. Av disse svulstene, 100% viste overekspresjon av ACSVL3; flere representative tumorer er vist på fig. 5. Det var ingen åpenbar sammenheng mellom omfanget av ACSVL3 uttrykk og differensiering tilstand av svulsten.
Parafin deler av lungesvulster stede på en vev utvalg ble immunostained med anti-ACSVL3 antistoff (brun) og kontra med hematoxylin (blå). Svulster representative for de 67 forskjellige tumorer som er tilstede på matrisen, samt normalt lungevev, er vist. Alle svulster farget positivt for ACSVL3. Total forstørrelse, 400 ×. Bar = 50 mikrometer.
ACSVL3 Expression i Lung tumorcellelinjer
For å bekrefte og utvide disse observasjonene vi undersøkt ACSVL3 uttrykk i normale humane bronkiale epitelceller (HBEC), og i flere lunge kreft cellelinjer. ACSVL3 uttrykk var knapt synlig i HBEC (Fig. 6A og 6B). Cellelinjer avledet fra humane lungesvulster, som representerer småcellet karsinom (H82), ikke-småcellet karsinom (A549), adenokarsinom (EKVX), plateepitelkarsinom (U1752), og stor celle karsinom (H460), alle robust uttrykk ACSVL3 ( fig. 6A).
(
A
) Vekst under standard kultur forhold. HBEC og fem lungekreftcellelinjer ble dyrket som beskrevet i Metoder og analysert for ACSVL3 uttrykk ved Western blot. Tumorcellelinjer ble avledet fra ikke-småcellet karsinom (A549), småcellet karsinom (H82), stor celle karsinom (H460), adenokarsinom (EKVX) og plateepitelkarsinom (U1752). p-aktin-ekspresjon ble bestemt som en lasting kontroll. (
B
) Effekt av vekstreduksjon på ACSVL3 uttrykk i lungekreftcellelinjer. HBEC, dyrket i serumfritt BEGM, vokse betydelig tregere enn kreft cellelinjer. Å bremse sine vekstrater, A549, H82, H460, og U1752 celler ble overført til BEGM. Alle celler ble opprettholdt i dette medium i 3 uker, ved hvilket tidspunkt de ble høstet og underkastet Western blot-analyse. Tumorceller dyrket i standard medium, RPMI pluss 10% føtalt bovint serum (FBS), ble høstet for sammenligning. Vekstratene i BEGM for alle kreftcellelinjer ble redusert med mer enn 50%.
HBEC vokse ved lav hastighet som de er dyrket i serumfritt syntetisk medium (BEGM) for å hindre squamous differensiering [ ,,,0],20]. På grunn av at tumorcellelinjer dyrket i rikt medium inneholdende føtalt bovint serum, vokser betydelig hurtigere enn HBEC, spurte vi om høy ACSVL3 nivåene var ganske enkelt en følge av den raske vekst. Fire tumorcellelinjer, A549, H82, H460, og U1752, ble overført til serumfritt BGEM og ble opprettholdt i dette mediet i tre uker. Til tross for en 50% reduksjon i veksten, disse cellelinjene alle opprettholdt høy ACSVL3 ekspresjon (Fig 6B.). Denne observasjonen tyder på at andre enn veksten faktorer er ansvarlig for vedlikehold av høye ACSVL3 nivåer i kreftcellelinjer.
Effekt av ACSVL3 knockdown på Heft og Non-tilhenger Vekst av Lung tumorcellelinjer i kultur
Stabil knockdown av ACSVL3 uttrykk i glioblastom celler redusert sitt ondartede fenotype i kultur [6]. Begge vekst på kulturskåler og evnen til å danne kolonier i bløt agar suspensjon var mer karakteristisk for normale celler når ACSVL3 var oppbrukt. For å avgjøre om ACSVL3 uttrykk også påvirket veksten av lunge kreftceller, produserte vi fire linjer med stabil ACSVL3 knockdown ved hjelp av RNA-interferens som beskrevet i metoder. Kontrollcellelinjer som stabilt skjuler et plasmid som koder for et kodet kort hårnål-RNA ble også produsert. Alle fire knockdown cellelinjer hadde sunket ACSVL3 protein nivåer av Western blot (Fig. 7).
Den korte hårnål-produserende vektor pSilencer (Ambion) ble brukt til å generere flere lungekreft cellelinjer med redusert ACSVL3 uttrykk som beskrevet i metoder. Klonale linjer av H460, H82, A549, og EKVX lungekreftceller med stabil knockdown (KD) av ACSVL3 ble valgt. Kontroll linjer stabilt havn en plasmid som inneholder en kryptert sekvens som er ikke rettet mot noen mennesker eller gnager mRNA. (
A
) ACSVL3 uttrykk i kontroll og KD celler ble vurdert ved Western blotting. (
B
) Gel-Pro Analyzer 4.0-programvaren ble brukt til å kvantifisere Western blot signalene i (A). Ekspresjon av ACSVL3 i forhold til p-aktin ble beregnet for hvert par av kontroll og KD-cellelinjer. Kontrollcellelinje forhold ble vilkårlig satt til 100 og den relative, normaliserte ekspresjon av ACSVL3 i KD-celler ble beregnet. Hvite barer, kontrollceller; grå barer, KD celler.
Vi målte effekten av ACSVL3 knockdown på spredning av dyrkede H460 og H82 lungekreftcellelinjer. Som vist på fig. 8A, mangel på ACSVL3 redusert cellevekstrater med 65-76% (målt på dag 6). Vi har også målt ikke-klebende vekst av fire cellelinjer, A549, EKVX, H82 og H460, i bløt agar suspensjon. Som vist på fig. 8B, kolonidannelse ble redusert i alle ACVL3-manglende cellelinjer med 65-80%. Disse funnene tyder på at ACSVL3 uttømming i lungekreftceller, som i glioblastom celler, reduserer deres ondartet
in vitro
vekst fenotype.
(
A
) Vekst i kultur. Kontroll (▪) og knockdown (▴) H460 og H82-celler (5 × 10
3) ble sådd i 6-brønners plater. På dagene 2, 4, 6 og 8, ble celler fra triplikate brønner høstet ved trypsinering og telt ved bruk av et hemacytometer. Gjennomsnitt ± S.D. er plottet.
