Abstract
Bakgrunn
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor gamma (PPARy) agonister, slik som thiazolinediones (TZDs), har blitt studert for deres potensielle bruk som kreft terapeutiske midler. Vi undersøkte effekten av fire TZDs-rosiglitazon (Rosi), ciglitazon (CGZ), troglitazon (TGZ), og pioglitazon (PAD)-on ovariecancer celleproliferasjon, PPARy uttrykk og PPAR luciferase reporter-aktivitet. Vi utforsket om TZDs opptre på en PPARy avhengig eller uavhengig måte ved å benytte molekylære metoder for å hemme eller overuttrykker PPARy aktivitet.
hovedfunnene
Behandling med CGZ eller TGZ i 24 timer redusert spredning i tre eggstokkreft kreftcellelinjer, Ovcar3, CaOv3, og SKOV3, mens Rosi og Pio hadde ingen effekt. Denne reduksjonen i Ovcar3 celleproliferasjon var på grunn av en høyere fraksjon av celler i G
0 /G
1 fasen av cellesyklusen. CGZ og TGZ behandling økt apoptose etter 4 timers behandling, men ikke etter 8 eller 12 timer. Behandling med TGZ eller CGZ økt PPARy mRNA uttrykk i Ovcar3 celler; Men proteinnivået uendret. Overraskende, luciferase promoter analyser viste at ingen av de TZDs økt PPARy aktivitet. Overekspresjon av villtype PPARy økt reporter aktivitet. Dette ble ytterligere forsterket av TGZ, Rosi, og Pio indikerer at disse cellene har den endogene kapasitet til å megle PPARy trans. For å bestemme hvorvidt PPARy medierer TZD-indusert reduksjon i proliferasjon, ble cellene behandlet med CGZ eller TGZ i fravær eller nærvær av en dominant negativ (DN) eller villtype overekspresjon PPARy konstruere. Verken vektor endret TZD-mediert celleproliferasjon foreslå denne effekten av TZDs på eggstokkreft celler kan være PPARy uavhengig.
Konklusjoner
CGZ og TGZ føre til en reduksjon i eggstokkreft celleproliferasjon som er PPARy uavhengig. Dette konseptet er støttet av funn at en DN eller overekspresjon av vill type PPARy ikke påvirker endringene i celleproliferasjon og cellesyklus
Citation. Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry TE (2011) Spesifikk Tiazolidindioner Hemme Ovarian Cancer Cell linje spredning og forårsake cellesyklus arrest i en Independent PPARy Manner. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10,1371 /journal.pone.0016179
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 17 august 2010; Godkjent: 14 desember 2010; Publisert: 21 januar 2011
Copyright: © 2011 Al-Alem et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (tilskudds tall CA95609, HD057446 og RR15592). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den femte største årsaken til kreftdød hos kvinner. Av de tre hovedtyper av kreft i eggstokkene (epitel, bakterie celle, og sex ledningen stromale kreft), ovarialcancer står for ca 90% av alle tilfeller, og er den første dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer [1], [2] . Til tross for intens forskning på kreft i eggstokkene med nye mål blir stadig undersøkt, behandling mål står sparsom. En av utfordringene i eggstokkreft forskning er fraværet av en eksperimentell dyremodell som sammenfatter den humane sykdommen som kan eksperimentelt manipuleres [1], [3]. Dermed har ovarian kreft cellelinjer blitt ansatt for å forstå de grunnleggende prosessene som er involvert i kreftcellevekst, differensiering og spredning. Denne studien benyttet tre eggstokkreft celler, Ovcar3, CaOv3 og Skvo3, som er utledet fra humant ovarialcancer [4], [5] for å utforske videre terapeutiske modaliteter i kreftcellevekst og spredning.
En av de terapeutiske mål under etterforskning for eggstokkreft er kjernereseptorer. Legemidler som aktiverer eller hemmer nukleære reseptorer er blitt brukt til behandling av mange sykdommer. Faktisk, om lag 13% av legemidlene på markedet er rettet mot kjernereseptorer [6]. PPARy er en svært konservert atom reseptor [7] uttrykt i hele kroppen [8] og er over uttrykt i mange kreftformer, blant annet eggstokkreft og brystkreft, noe som gjør det til et potensielt viktig aktør i utviklingen av kreft.
Endogene PPARy-ligander er fortsatt ukjent, men godt karakteriserte kandidater innbefatter flerumettede fettsyrer, prostaglandin J
2 (PGJ
2) og arakidonsyre [9]. Syntetiske PPARy ligander inkludere tiazolidindioner (TZDs), som består av rosiglitazon (Avandia®), Troglitazone (Rezulin®), Pioglitazone (Glustin ® /Actos®), og ciglitazon, som alle har blitt utviklet og /eller som brukes til å behandle type II diabetes [10], [11], [12]. Anvendelsen av TZDs som en terapeutisk tilnærming i kreft har blitt undersøkt, men resultatene har vært kontroversielle [13], [14], [15]. I denne studien benyttet vi molekylære, fysiologiske og farmakologiske tilnærminger for å undersøke effekten av de fire forskjellige TZDs på eggstokkreft celler og avgjøre om disse effektene er PPARy avhengige eller uavhengige.
Resultater
Ovcar3, CaOv3 og SKOV3 eggstokkkreft cellelinjer uttrykke PPARy
for å finne ut om eggstokkreft celler uttrykker PPARy, ble real time PCR og Western blot analyse utført. Det var differensial PPARy uttrykk i de tre ulike cellelinjer både på mRNA og proteinnivåer. Mens PPARy mRNA uttrykk var høyest i SKOV3 celler (figur 1A), SKOV3 cellene hadde de laveste PPARy protein nivåer (Figur 1b). I motsetning til dette, Ovcar3 hadde lave nivåer av PPARy mRNA-ekspresjon, men rikelig ekspresjon av PPARy-protein (figur 1A og 1B henholdsvis). PPARy aktivitet i de tre cellelinjer ble undersøkt ved hjelp av celler transfektert med en 3XPPRE-Luc-
Renilla
konstruere og sammenlignet med celler transfektert med luciferase og
Renilla
konstruerer mangler PPRE. Ovčar tre celler utstilt ca 2 ganger mer endogen PPRE aktivitet sammenlignet med CaOv3 celler, mens SKOV3 celler viste 50% mer PPRE aktivitet sammenlignet med Ovcar3 celler (figur 1C).
(A) mRNA uttrykk (B) Protein uttrykk og (C) PPRE luciferase-aktivitet. Data ble normalisert til nivåer av PPARy uttrykk og aktivitet i Ovcar3 celler. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05). Celler transfektert med Luc og Renilla konstruerer mangler PPRE (PPRE -) var betydelig lavere enn i samme cellelinje transfektert med PPRE-Luciferase-Renilla konstruerer (PPRE +) ved Welch t-test (
p
0,05) .
retinsyrereseptor (RXR) er ikke en begrensende faktor i PPARy aktivitet
PPARy bindes til sin heterodimert partner RXR før binding til DNA [16]. RXR er kjent for å være konstitutivt uttrykt i celler, og har vist seg å heterodimerize med andre reseptorer i tillegg til PPARy, slik som vitamin D-reseptoren [17]. For RXR å bli aktivert, sin ligand 9-
cis
-retinoic syre (9-
Cis
-RA) må være til stede. For å sikre at aktiverte RXR er ikke en begrensende faktor i våre eksperimenter ble celler behandlet med 9-
Cis
-RA. I disse eksperimentene, ble celler transfektert med forskjellige PPARy konstruksjoner, inkludert Δ467 som er en dominant negativ (DN) form av PPARy [18], [19], så vel som en over uttrykk formen av villtype PPARy (OE) som brukes for å øke PPARy uttrykk. En DN form av PPARy ble anvendt i disse studiene basert på innledende forsøk som viste at DN transfeksjon redusert PPRE aktivitet 40% under nivåer i celler transfektert med shRNA PPARy (data ikke vist). For å sikre at PPARy ble overuttrykt enten i DN eller OE skjema sammenlignet med kontrollceller (dvs. celler transfektert med PGL3), ble PPARy proteinekspresjon målt ved anvendelse av Western blot-analyse. Som forventet var det en markert induksjon av både DN og OE form av PPARy (figur 2A innsats). Etter transfeksjon med kontrollen, DN eller OE vektor, celler ble deretter behandlet med vehikkel-kontroll eller 1 uM av 9-
Cis
-RA i 24 timer i mørket. Vi har observert at nærvær av 9-
Cis
-RA påvirket ikke aktiviteten av PPARy reporter analysen i OVCAR 3-celler, noe som indikerer at aktiverte RXR er ikke en begrensende faktor i denne cellelinjen (figur 2A). Tillegg av 9-
Cis
-RA å CaOv3 celler ikke endre PPRE aktivitet før PPARy ble overexpressed (figur 2B) som tyder på at aktivert RXR er ikke hastighetsbegrensende før PPARy er svært rik på denne cellelinjen. Overraskende, i SKOV3 celler, 9-
Cis
-RA økte PPARy reporter aktivitetsanalysen i kontrollceller (PGL3), men hadde ingen effekt når PPARy ble over uttrykt i forhold til kontroll (figur 2C).
Celler ble dobbelt transfektert med en PPRE konstruere og ett av følgende: Empty vektor (PGL3), DN form av PPARy (DN) eller hvete form av PPARy (OE). Etter at de doble transfeksjoner ble cellene behandlet i 24 timer med bærerkontroll (DMSO) eller 1 uM av 9-
Cis
-RA i mørket. PPRE luciferase-aktivitet er vist for (A) Ovcar3, (B) CaOv3, og (C) SKOV3. Kontrollene representerer celler som ble transfektert med den tomme vektoren og behandlet med vehikkel-kontroll, vist som den første linjen i hvert panel. Resultater for PPRE luciferase-analysen er gjennomsnitt ± SEM for minst 9 målinger. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05). Sett Panel A: Western blot av PPARy protein i Ovcar3 celler dobbel transfektert med en PPRE konstruere og enten tom vektor, DN eller OE PPARy konstruksjoner og behandlet med kjøretøy kontroll i 24 timer
CGZ og TGZ årsak. en nedgang i celleproliferasjon
for å definere effekten av PPARy ligander på celleproliferasjon, ble MTS analyser utført. Ovcar3 celler ble behandlet med konsentrasjoner på 0, 0,1, 1 eller 10 uM av Rosi, CGZ, TGZ eller Pio i 24 timer. Den maksimale TZD konsentrasjon brukt var 10 mikrometer siden PPARy konkrete handlinger er rapportert med TZDs ved konsentrasjoner ≤10 iM [20] og høyere konsentrasjoner er kjent for å indusere celledød [21]. Administrasjon av de fire TZDs resulterte i forskjeller i celleformering. Behandling med CGZ redusert proliferasjon 80%, TGZ forårsaket en 65% reduksjon, mens Rosi og Pio hadde ingen virkning på proliferasjonen (fig 3A-D svarte søyler). I et forsøk på å forstå om nedgangen i spredning følgende TZD behandling er vanlig på tvers av andre eggstokkreft celler, ble TZD behandling av CaOv3 og SKOV3 utforsket. En tilsvarende reduksjon i proliferasjon ble observert i disse cellelinjene når de ble behandlet med CGZ og TGZ ved 10 uM. CaOv3 cellene vise en 80% og 30% reduksjon i celleformering ved behandling med CGZ og TGZ, henholdsvis (figur 3A-B). SKOV3-celler viser en reduksjon 45% og 35% ved behandling med 10 uM CGZ og TGZ, henholdsvis (figur 3A-B). I likhet med Ovcar3 celler, CaOv3 og SKOV3-celler ble behandlet med Rosi eller Pio ikke oppviser en endring i spredning (figur 3C-D).
eggstokk-kreft-celler ble serum-sultet i 24 timer og behandlet i ytterligere 24 timer med bærerkontroll (DMSO) eller 0,1, 1,0 eller 10 uM av CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), eller Pio (D). Celleproliferasjon ble vurdert med MTS analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. ble utført statistiske analyser innenfor hver cellelinje. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig innenfor en behandlingsgruppe (
p
0,05). Svarte striper: Ovcar3, Grey: CaOv3, lys grå. SKOV3
CGZ og TGZ nedgang BrdU DNA inkorporert
MTS analyse tiltak mitokondrie aktivitet i celler, noe som er en indikasjon på deres levedyktighet [22] og betraktes som en indirekte vurdering av celleproliferasjon. Men det er en rapport om at TZDs kan interferere med MTS-analyse [23]. Derfor har vi også målt frekvensen av DNA replikasjon i Ovcar3 celler ved hjelp BrdU inkorporering som en annen indeks over celleproliferasjon. Ovcar3 celler ble behandlet med 0, 0,1, 1 eller 10 uM av Rosi, CGZ, TGZ eller Pio i 24 timer. BrdU analyser viser lignende resultater som de av MTS analysen. Det var omtrent en 70% reduksjon i proliferasjon i celler behandlet med 10 pM av CGZ eller TGZ, og ingen effekt av Rosi eller Pio på celleformering (figur 4A-D).
Ovcar3 celler ble serum-sultet i 24 timer og behandlet i ytterligere 24 timer med bærerkontroll (DMSO) eller 0,1, 1,0 eller 10 uM av CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), Pio (D). Celleproliferasjon ble vurdert med BrdU analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig innenfor en behandlingsgruppe (
p
0,05).
PPARy mRNA uttrykk forsterkes av TZD behandling av eggstokkreft celler
for å vurdere sammenslutning av disse ligander med regulering av PPARy, undersøkte vi effekten av TZDs på uttrykk for PPARy i Ovcar3 celler. Celler ble behandlet med eller uten 10 uM av TZDs og PPARy mRNA og proteinnivåer ble analysert 24 timer senere. PPAR (uttrykk ble økt i Ovcar3 celler behandlet med CGZ (6,9 ganger) og TGZ (18,1 ganger) (figur 5A). Overraskende nok var det en økning i PPAR (protein følgende Rosi men ikke CGZ eller TGZ behandling (figur 5B). I et forsøk på å forklare dette avvik mellom mRNA og protein ekspresjon, undersøkte vi et tidsforløp av PPAR (mRNA og protein ekspresjon. Celler ble behandlet med de forskjellige TZDs for 4, 8, 12 eller 24 timer og både sanntids-PCR og Western blot-analyse ble utført. Vi ikke observere en korrelasjon mellom de uttrykk mønstre for PPAR (mRNA og protein på tvers av tid som angir at det er potensielt andre mekanismer som påvirker nivået av PPAR (proteinet i disse cellene. en mulighet er at den TZDs øke omsetningen og degradering av PPAR (protein som sett i andre systemer [24], [25].
PPARy mRNA og protein ekspresjon ble målt i Ovcar3-celler under anvendelse av (A) Sanntids PCR og (B) western blot-analyse etter TZD . behandling Celler ble serumsultede i 24 timer og behandlet i ytterligere 24 timer med kjøretøy kontroll (DMSO) eller ett av følgende: 10 mm av Rosi, CGZ, TGZ, eller Pio. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra to individuelle eksperimenter. Barer med forskjellige superscripts er signifikant forskjellig (
p
0,05).
Siden CGZ og TGZ forårsaket en reduksjon i celleproliferasjon i CaOv3 og SKOV3 celler, vi målt mRNA uttrykk av PPARy i disse cellene. I CaOv3 celler, mRNA uttrykk av PPARy etter CGZ og TGZ behandling var 3,6 og 4,4 ganger over bilen kontroll henholdsvis selv om disse endringene ikke nådde betydning. SKOV3-celler viste ingen forandringer i PPARy uttrykk etter behandling med TZDs (data ikke vist). Samlet viser våre data at PPAR (mRNA er til stede og er regulert av TZDs i eggstokkreft celler om enn i ulik grad avhengig av celletype og liganden brukes til å aktivere PPARg.
CGZ og TGZ ikke indusere apoptose
i denne og påfølgende forsøk undersøkt vi bare Ovcar3 celler som disse cellene viste de mest bemerkelsesverdige effekter når de behandles med TZDs. Videre er disse cellene som vanligvis brukes i studiet av eggstokkreft, tilrettelegging sammenlignet med tidligere studier. i et forsøk på å bedre forstå mekanismen mediering av den reduksjon i celleformering, undersøkte vi hvorvidt apoptose bidrar til denne reduksjonen. det ble observert en reduksjon i celleformering etter 24 timers behandling (figurene 3 og 4). når denne reduksjonen skyldes apoptose da dette celledød skal ha skjedd på et tidligere tidspunkt. Derfor undersøkte vi effekten av TZDs på Ovcar3 celler og fastslått om cellene var enten levedyktig eller som gjennomgår apoptose og var døde ved 4, 8 eller 12 timer etter behandling ved hjelp av FACS analyse. Det var en svak økning i apoptotiske og døde celler etter 4 timers behandling med CGZ og TGZ (figur 6A). Men denne økningen ble ikke påvist i prøver behandlet for 8 eller 12 timer (Figur 6B og 6C). Trypanblått eksperimenter for å bekrefte levende versus døde celler viste lignende resultater (data ikke vist).
Ovcar3 celler ble serum-sultet i 24 timer og behandlet med bærerkontroll (DMSO) eller 10 pM av CGZ eller TGZ for (A ) 4 timer, (B) 8 timer, eller (C) 12 timer. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM av 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Lys grå stolper representerer levedyktige celler; mørkegrå søylene representerer celler som gjennomgår tidlig og sent apoptose så vel som de som er døde. Barer som ikke deler en bokstav eller et tall betegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05)
CGZ og TGZ årsaken cellesyklus arrest
I en. forsøk på å klarlegge grunnen som ligger under reduksjon i proliferasjon, effekten av TZDs på cellesyklusprogresjon ble også vurdert. En betydelig økning i cellene i G
0 /G
1 fase ble observert etter behandling med TGZ og CGZ (figur 7A). CGZ administrasjon resulterte i en signifikant reduksjon i G2 /M-fasen av cellesyklus (figur 7B), mens ingen endringer i S-fasen ble observert i celler behandlet med CGZ eller TGZ (figur 7C). Celler behandlet med Rosi eller Pio viste ingen forandring i cellesyklusfordeling sammenlignet med kontroll (data ikke vist).
Ovcar3 celler ble serum-sultet i 24 timer og behandlet i ytterligere 24 timer med bærerkontroll (DMSO ) eller 10 mikrometer av CGZ eller TGZ. (A) G
0 /G
1, (B) G
2, (C) S-fasen. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer som ikke deler en bokstav eller et tall betegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05).
Effekter av TZDs på PPRE luciferaseaktivitet
For å klargjøre om antiproliferative og cellesyklus arrest effektene sett med utvalgte TZDs er en direkte effekt av PPARy trans, vi transient transfektert celler med en 3XPPRE-MTK-pGL3-reporter plasmid. Ytterligere to konstruksjonene ble transfektert, nemlig en DN form av PPARy og en overekspresjon (OE) av en hvete PPARy konstruere. Cellene ble deretter behandlet i 24 timer med 10 uM av Rosi, CGZ, TGZ, eller Pio. Ingen av behandlingene alene TZD øket PPRE-aktivitet (figur 8). Imidlertid, celler transfektert med DN viste en tilnærmet 40% reduksjon i PPRE mediert aktivitet både ubehandlede og behandlede celler TZD. Videre øker ekspresjonen av villtype PPARy viste en økning i luciferaseaktivitet når cellene ble behandlet med en hvilken som helst av de fire forskjellige TZDs sammenlignet med celler som kun ble behandlet med TZDs (figur 8A-8D).
Ovcar3 celler ble dobbelt transfektert med en PPRE konstruere og ett av følgende: Empty vektor, DN, eller OE PPARy. Etter at de doble transfeksjoner ble cellene behandlet i 24 timer med bærerkontroll (DMSO) eller 10 pM av (A) CGZ, (B) TGZ, (C) Rosi, (D) eller Pio. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05).
Analyse av TZD mediert PPARy avhengige og uavhengige handlinger
For for å bestemme hvorvidt effekten av TZDs er avhengige PPARy, ble cellene behandlet med 10 uM TZDs i fravær eller nærvær av PPARy antagonister (GW9662, T007). MTS-analysen ble utført for å bestemme hvorvidt nærværet av antagonister kunne reversere effektene av TZDs for ovarial cancer celleproliferasjon. Resultatene viste at det var en delvis «redde» når cellene ble behandlet med den GW9662 (figur 9A) eller T007 (figur 9B) forbindelser i kombinasjon med CGZ eller TGZ. Imidlertid handlingsmønster var inkonsekvent mellom de to antagonister, og selv med den samme antagonist i nærvær av forskjellige TZDs. For eksempel, T007 var i stand til å fullstendig blokkere effekten av CGZ på celleformering, men hadde ingen effekt på TGZ formidlet reduksjon i proliferasjon. I tillegg gjorde bruk av GW9662 eller T007 forbindelser alene ikke påvirke spredning på sine egne som var forventet. Dette kan skyldes det faktum at disse antagonister kan blandes agonister eller ikke PPARy spesifikk [9], [26]. Disse funnene tyder på at bruk av en farmakologisk tilnærming ansette rapportert PPARy antagonister alene ikke svare på spørsmålet om hvorvidt effekten av TZDs handle gjennom PPARy. Dette førte oss til å bruke en molekylær tilnærming ved hjelp av DN eller OE PPARy konstruerer for å undersøke om effektene sett på celleproliferasjon og cellesyklus var PPARy avhengige eller uavhengige.
Celler ble behandlet med GW9662 (A) eller T007 (B ) i 24 timer og celleformering ble undersøkt. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 4 målinger. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig (
p
0,05).
trans celler med DN eller OE former PPARy uten tilstedeværelse av ligander endret seg ikke celleproliferasjon som antydet med BrdU-analyser (figur 10). Enda viktigere, effekten av CGZ og TGZ for spredning ikke ble overvunnet ved tilstedeværelsen av DN form av PPARy (figur 10). Luciferase-analyser ble kjørt på prøver i samme platene for å sikre at celler ble transfektert og ekspresjon av DN forårsaket den forventede nedgang mens overekspresjon av vill-type-PPARy øket PPRE aktivitet, henholdsvis (data ikke vist). I samsvar med BrdU analyser, cellesyklus data indikerer også at effekten av CGZ og TGZ er ikke PPARy avhengige (data ikke vist).
Ovcar3 celler ble dobbelt transfektert, serumsultede i 24 timer og behandlet for en ytterligere 24 timer med kjøretøy kontroll (DMSO) OR 10 iM CGZ eller TGZ. Celleproliferasjon ble vurdert med en BrdU analysen. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for minst 9 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer som ikke deler en bokstavbetegnelse er signifikant forskjellig innenfor en behandlingsgruppe (
p
0,05).
Diskusjoner
TZDs har vist seg å ha et bredt spekter av effekter på kreftceller. Den antatte mål for TZDs, PPARy er overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert bryst, lunge, kolon, prostata og ovarier [2], [27], [28], [29]. Selv om den eksakte rolle TZDs og PPARy spille i eggstokkreft er fortsatt ukjent, denne studien viser at CGZ og TGZ har anti-proliferative handlinger på tre eggstokkreft cellelinjer, mens Rosi og Pio har ingen effekt. Det faktum at disse anti-proliferative handlinger blir observert i alle tre cellelinjer tyder på at dette er et vanlig fenomen og ikke begrenset til en enkelt ovarian cancer cellelinje. Forsøkene som er beskrevet her også vise at de fire TZDs har forskjellige handlinger på eggstokkreft celler eventuelt gjennom både PPARy avhengig samt uavhengige veier. Selv om flere rapporter tyder på at ulike cellelinjer reagerer forskjellig på TZDs, [30], [31], [32], [33], så vidt vi vet, en direkte sammenligning mellom disse fire TZDs i eggstokkreft og opptegning om disse effektene er PPARy avhengig av molekylære, fysiologiske og farmakologiske tilnærminger er ikke undersøkt.
i denne studien, 10 mm av CGZ og TGZ redusert celledeling i alle tre av eggstokkreft cellelinjer undersøkt. Disse observasjoner er i overensstemmelse med andre studier som benytter eggstokkreft celler, så vel som andre cellelinjer hvor CGZ og /eller TGZ redusert aktivitet MTT [20], [21], [34]. Imidlertid våre funn er i motsetning til cancercellelinjer fra andre vev så som bryst, skjoldbruskkjertelen, urinblæren og andre som krever vanligvis mye høyere konsentrasjoner av TZDs å utløse en biologisk respons. Faktisk doser opp til 100 pM, som overstiger de rapporterte ligand-spesifikke konsentrasjoner på 10 uM eller mindre [12], kan det være nødvendig før en inhibering av proliferasjon ses [35], [36], [37], [38] , [39]. Imidlertid kan disse forskjellene skyldes delvis det bruk av forskjellige cellelinjer eller forskjeller i celledyrkningsbetingelser hvor, for eksempel, har forskere benyttet 1% FBS [39], 5% FBS [35], [36], [37 ], [38], [39] eller 10% FBS [21]. De foreliggende funn viser at denne reduksjon i proliferasjon er på grunn av en økning i cellesyklus-stans i stedet for en økning i apoptose. På samme måte har andre rapporter vist at TZDs føre til degradering av cyclin D1 i prostatakreft [40], noe som fører til cellesyklusstans, og en reduksjon i tumorcelleformering. På samme måte i A2780 eggstokkreft celler, CGZ synker cyclin D1 sammen med andre pro-overlevelse faktorer som resulterer i cellesyklus arrest [21]. Yang og kolleger [20] rapporterte at CGZ og TGZ behandling av ES-2 og PA-1 eggstokkreft celler resulterte i cellesyklus arrest; Men denne endringen i cellesykluskinetikk var forbundet med økte nivåer av apoptose. Selv om våre studier støtter tidligere funn hos forskjellige eggstokkreft celler at TZDs redusere celleproliferasjon ved å stanse celler i G0 /G1 fasen av cellesyklusen, eksisterer muligheten for at de høyere konsentrasjoner av TZDs som brukes i disse tidligere studier resulterer i induksjon av apoptose [20].
den foreliggende undersøkelse viser at hver av de TZDs har forskjellige virkninger på ovariecancer celleproliferasjon. CGZ og TGZ føre til en dramatisk reduksjon i eggstokkreft celleproliferasjon mens Rosi og Pio hadde ingen effekt. Dette er ikke uventet ettersom hver TZD har en annen tilhørighet og binding til PPAR [7], [41], rekrutterer ulike coactivators [42] og kan lokke fram ulike cellulære responser. Disse spesielle tiltak har ført til konseptet at TZDs er selektive modulatorer av PPARy og derfor rettet mot distinkte gener resulterer i vev-selektivitet [12], [42], [43], [44]. I tillegg TZDs har forskjellige spesifisiteter for PPAR’er. For eksempel er Rosi og Pio betraktet som den mest potente PPARy agonister av de fire TZDs brukt i denne studien [11]. Funnene som disse potente PPARy-agonister ikke hemmer celledeling ytterligere støtte vår hypotese om at handlingene til TZDs kan være uavhengig av PPAR. Videre Rosi, CGZ og TGZ er spesifikke for PPARy mens Pio har vist seg også å aktivere PPARa [45], [46]. Derfor kan våre data gjenspeiler forskjeller i selektiv modulering av PPARy, forskjeller i spesifisitet for PPARy, eller aktivering av distinkte PPARy uavhengige veier.
For å begynne å forstå selektiv modulering av PPARy av TZDs i eggstokkene kreftceller, undersøkte vi at mRNA og protein uttrykk profiler av PPARy og aktiveringen av PPARy s promoter følgende TZD behandling. Det er en dramatisk økning i PPARy mRNA-ekspresjon når Ovcar3-celler ble behandlet med TGZ og i mindre grad med CGZ og Rosi. I motsetning til dette, ble den høyeste ekspresjon av PPARy-protein når cellene ble behandlet med Rosi. Denne uoverensstemmelse mellom ekspresjon av PPARy mRNA og protein etter TZD behandling er ikke blitt observert heller ikke undersøkt tidligere, men nivåene av PPARy-protein etter TZD behandling har vist seg å være meget variabel mellom ES-2 og PA-1 eggstokkreft celler [ ,,,0],21]. Vi har postulert at undersøkelse av en statisk 24 timers punktet kan ikke nøyaktig fange induksjon av PPARy mRNA og protein. Vi vurderte derfor nivået av PPARy mRNA, så vel som proteinmønstre på forskjellige tidspunkter etter TZD behandling og observerte mangel på korrelasjon mellom PPARy mRNA og protein ekspresjon ved alle tidspunkter. En alternativ teori for å forklare denne uoverensstemmelse er at økningen i ekspresjon av PPARy mRNA når cellene behandles med TGZ kan øke omsetningen og nedbrytning av PPARy-proteinet for derved å redusere proteinekspresjon. Det er tidligere blitt demonstrert i andre systemer hvor det ble vist at med økende doser av TZDs, var det en økning i PPARy proteindegradering som resulterte i en reduksjon i steady-state nivå av proteinet i endoteliale celler [24], [25] . Dette er antatt å forekomme på grunn TZDs formidle endringer i fosforyleringstilstanden av PPARy av MEK som forlater PPARy utsatt for nedbrytning [47]. I lys av denne informasjonen, kan våre proteindata kan forklares med det faktum at TZDs årsak differensial nedbrytning av PPAR (etter aktivering, og at turn-over frekvensen av PPAR (protein i celler behandlet med TGZ er raskere enn den av CGZ og Rosi resulterende i en reduksjon i proteinnivåer. i tillegg er det mulig at Rosi øker proteinstabilitet av PPAR (mens virkningene på proliferasjon etter behandling med CGZ og TGZ er PPAR (uavhengig. Alternativt kan TZDs føre til endringer i proteinet i seg selv, f.eks som fosforylering, som endrer andre handlinger i proteinet i stedet for bare å endre dets totale transaktivering som nylig blitt vist av Choi et al. [48].
i lys av de resultater som viste en mangel på korrelasjon mellom nivåene av PPAR (mRNA og protein etter TZD behandling, utforsket vi endringene i aktivering av en PPAR (reporter som en indeks for PPAR (aktivitet etter TZD eksponering. Overraskende, PPAR (aktivitet ble ikke stimulert ved en hvilken som helst av de 4 TZDs etter 24 h behandling, i motsetning til tidligere rapporter i andre ovarie cancer-cellelinjer som 50 mM CGZ økt luciferaseaktiviteten av en PPRE reporter ved 18 h [21]. Basert på dette tidligere rapport, spekulerte vi at arrangøren aktivering kan ha oppstått ved tidligere eller senere tidspunkter. Derfor ble det undersøkt virkningen av TZDs på promoteraktivitet ved 4, 8, 24 og 32 timer. Det var beskjeden økning i luciferase aktivitet i celler behandlet med CGZ 8 og 32 timer (data ikke vist), som var utilstrekkelig for å ta høyde for endringer i PPAR (uttrykk. Discordance mellom protein nivåer og PPAR (aktivitet har tidligere blitt sett på bryst kreftceller, men den eksakte mekanismen bak denne forskjellen er fortsatt ukjent [34]. imidlertid tyder en slik observasjon at analyse av bare PPARy protein nivåer kan feilaktig bli brukt til å tilskrive cellulære effekter eller respons til behandlinger.
TZDs gjorde ikke øke endogen PPAR-aktivitet i disse cellene, men TZD behandlingen økte luciferaseaktivitet når PPARy ble overuttrykkes i Ovcar3 celler. Dette indikerer at disse cellene konstitutivt aktiverer PPARy og når reseptoren er meget rikelig, er mulig ytterligere aktivering. Denne aktiveringen er ikke
