Abstract
Bakgrunn og Objective
hemmere av apoptose proteiner (RSU) har blitt godt undersøkt i humane kreftformer, hvor de er ofte overuttrykt og assosiert med dårlig prognose. Her utforsket vi rollen som baculoviral IAP gjenta inneholder 6 (BIRC6), et medlem av IAP, i menneskelig tykktarmskreft (CRC).
Metoder
Vi brukte Western blotting og immunhistokjemi for å undersøke BIRC6 ekspresjon i 7 CRC-cellelinjer og 126 CRC-kliniske prøver. Vi bestemte den biologiske betydningen av BIRC6 i CRC cellelinjer av et lentivirus-mediert stanse metoden.
Resultater
Vi rapporterte at BIRC6 ble overuttrykt i CRC cellelinjer og kliniske CRC vev. BIRC6 overekspresjon var korrelert med tumorstørrelse og invasjon dybde på CRC. BIRC6 overekspresjon er assosiert med dårligere total overlevelse (OS) (
P
= 0,001) og kortere sykdomsfri overlevelse (DFS) (
P
= 0,010). BIRC6 knockdown hemmet celledeling, arrestert cellesyklus i S-fasen, downregulated cyclin A2, B1, D1 og E1 nivåer, og lysfølsomt CRC celler til kjemoterapi
in vitro Hotell og
in vivo
.
Konklusjoner
til sammen tyder disse data som BIRC6 overekspresjon er en prediktor for dårlig prognose ved kolorektalkreft og BIRC6 kan være et potensielt mål for CRC terapi
Citation. Hu T , Weng S, Tang W, Xue R, Chen S, Cai G, et al. (2015) Overuttrykte BIRC6 Er en Predictor av Prognoser for tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (5): e0125281. doi: 10,1371 /journal.pone.0125281
Academic Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 15 juli 2014; Godkjent: 23 mars 2015; Publisert: 01.05.2015
Copyright: © 2015 Hu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering. Dette arbeidet ble støttet av Shanghai Science and Technology Commission (tilskuddsnummer: 10411950100 til XS, 12ZR1405300 til YC), National Natural Science Foundation of China (tilskudds tall : 81100344, 81173078 til SZ, 81371268 til SC, 81172273, 81272388 til LD, 81472673 til YC, 81272388, 81400628 til XS), National Clinical Key Special Subject of China (stipend nummer: 371 til XS), og Shanghai Pujiang Program ( tilskuddet nummer~~POS=HEADCOMP: No.13PJD008 til GC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje hyppigst diagnostisert kreft og den fjerde største årsaken til kreftdød på verdensbasis [1]. På grunn av screening og fjerning av premaligne polypper, har forekomsten gått ned de siste 3 tiår [2]. Bruken av nye stoffer som oksaliplatin, bevacizumab, cetuximab og panitumumab tillater pasienter med metastatisk kolorektalcancer overleve lenger [3,4,5,6]. Til tross for fremskritt i diagnose og behandling av CRC, forblir dødeligheten av denne sykdommen høy. Gitt dårlig prognose for CRC, nye prognostiske markører og terapeutiske strategier må utvikles for å ytterligere forbedre utfallet av tykktarmskreft.
hemmere av apoptose protein (IAP) familie har vist seg å være avgjørende i apoptoseresistens i et bredt spekter av malignitet [7,8,9,10]. Disse proteinene kjennetegnes ved tilstedeværelse av opp til tre kopier av Baculoviral IAP Repeat (BIR) domene. Den tilgangspunkter binder til og undertrykke en rekke pro-apoptotiske faktorer, for derved effektivt å hemme apoptose i kreftceller [11]. Baculoviral hemming av apoptose protein gjenta inneholdende 6 (BIRC6), også kjent som Apollon eller Bruce, er den største medlem av IAP familie med et enkelt BIR domene ved dets N-terminal og en aktiv ubiquitin-konjugasjon (UBC) enzym domene ved dets C-terminale [12]. I tillegg til sin IAP aktivitet, har BIRC6 den karakteristiske egenskap av aktivitet som et kimært E2 /E3 ubiquitin ligase i pattedyr [13]. Med sin UBC domene, fremmer BIRC6 nedbrytning av Smac og inhiberer aktiviteten av caspase-9, som spiller nøkkelroller i initiering av apoptose [14]. Mens BIRC6 selv er regulert av ubiquitinering og proteasomal degradering formidlet av E2, UbcH5c og Nrdp1 [15].
En stor mengde bevis viste at BIRC6 ble sterkt uttrykt i flere typer kreft. Det har blitt rapportert at hjerne kreftceller med høye nivåer av BIRC6 var resistente mot forskjellige kreftmedisiner [12]. BIRC6 overekspresjon var assosiert med ugunstig prognose i barndommen
de novo
akutt myelogen leukemi [16]. Videre har det blitt rapportert at p53 er et nedstrøms effektor av BIRC6 [17,18]. Disse funnene tyder på at BIRC6 kanskje en ny terapeutisk mål for ondartet svulst.
Qiu
et al
. [14] første beviste at sirnas målgruppe BIRC6 fremmet apoptotisk celledød. Deretter flere studier bekreftet at stanse BIRC6 forårsaket forhøyet apoptose [17,18,19]. I tillegg foreløpig undersøkelse viste at BIRC6 uttrykket var mer tallrike i CRC vev enn i ikke-neoplastiske vev ved hjelp av cDNA mikromatriser [20]. Lignende resultat ble oppnådd i sammenlignings proteomforskning studiet av tykktarmskreft stamceller [21]. Men det har vært noen rapporter om sin prognostisk betydning basert på kliniske data. I denne studien, vi utforsket prognostiske betydning og biologiske funksjoner i BIRC6 i tykk- og endetarmskreft. Våre data viser en sterk sammenheng mellom BIRC6 overekspresjon og ugunstige kliniske funksjoner. I tillegg BIRC6 oppregulering i CRC forutsagte dårlig prognose av pasientene. Videre fant vi ut at BIRC6 knockdown hemmet CRC celleproliferasjon, arrestert CRC cellesyklus i S-fasen, downregulated cyclin A2, B1, D1 og E1 nivåer, og lysfølsomt CRC celler til kjemoterapi.
Materialer og metoder
Pasienter, vevsprøver og oppfølgings
Denne studien ble hovedsakelig utført av en retrospektiv design. CRC prøver (n = 126) ble innhentet fra pasienter som fikk kirurgi ved Zhongshan Hospital, Fudan University mellom januar 2008 og august 2008. Ingen av dem fikk strålebehandling. Blant 126 pasienter, 42 pasienter mottok oksaliplatinbasert kjemoterapi (FOLFOX4, oksaliplatin, 5-fluorouracil og folinsyre) etter kurativ reseksjon. Oppfølgingen informasjon om alle deltakerne ble oppdatert hver 3. måned via telefon. Alle pasientene ble fulgt prospektivt av serum CEA, ultralydundersøkelse, endoskop, computertomografi hver 3-6 måneder. Diagnosen tilbakefall var basert på bilde metode og biopsi (hvis mulig). Pasientene ble fulgt inntil død eller 1 april 2013, med en gjennomsnittlig postoperativ oppfølging varighet på 59 måneder. Total overlevelse (OS) ble definert som tiden fra dato for operasjonen til døde av noen årsak, pasienter i live blir sensurert i siste oppfølging. Sykdomsfri overlevelse (DFS) ble definert som tiden har gått fra kirurgi til første forekomst av en av følgende hendelser: tykktarmskreft fjernmetastaser; tilbakefall av tykktarmskreft; utvikling av andre ikke-kolorektal kreft eksklusiv basalcellekreft i huden og carcinoma in situ i cervix; eller død uavhengig av årsak, uten dokumentasjon av en kreft-relatert hendelse. Pasienter med TNM stadium IV svulster ble ekskludert når analysere DFS. Tretti sammenkoblede frisk reseksjon CRC vev og sammenkoblede tilstøtende ikke-kreft vev ble samlet inn for Western blotting. Studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Zhongshan Hospital. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke skjemaer for denne studien
mikro ustabilitet (MSI) analyse og KRAS mutasjonsanalyse
MSI analyse ble undersøkt ved hjelp av tre mononukleotid gjenta markører. BAT25, BAT26, og CAT25 som beskrevet tidligere [22]. KRAS mutasjon analyse ble utført ved hjelp av PCR amplifisering av genomisk DNA ved hjelp av følgende primere. Følelse 5′-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3 «og antisense 5′-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3»
Immunohistochemistry og evaluering
Parafin -embedded deler av normale og tumorvev ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en avtagende etanol serie fortynnet i destillert vann. Etter antigen gjenfinning med en 10 mM citratbuffer, ble CRC seksjoner inkubert over natten ved 4 ° C med den primære anti-BIRC6 polyklonalt antistoff (Abcam, Cambridge, MA). Etter 30 min inkubering med sekundært antistoff mot HRP-konjugert kanin-Ig ble snittene utviklet i 3, 3′-diaminobenzidin løsning under mikroskopisk observasjon og motfarget med hematoksylin.
Seksjonene ble observert under et lys mikroskopi, for histologisk vurdering, for å undersøke tumor mikroheterogenitet i antigen distribusjon. ble observert fem randomiserte mikroskopiske utsikt over 400 ganger forstørrelse av hver seksjon og scoret. Både intensiteten av immunhistokjemisk farging (0, negativ, 1, svak, 2, mellomproduktet, 3, sterk) og prosentandelen av positive celler (0, 0% positive celler, 1, 1-10% positive celler, 2, 11- 50% positive celler, 3, 50% positive celler) ble evaluert. Sluttresultatet i hver prøve ble oppnådd ved å multiplisere resultatet av fargeintensitet og andelen positive celler. Prøvene ble klassifisert som negative når de endelige score var 0-3 og positiv når 4-9 [23]. Den BIRC6 farging ble scoret uavhengig av to patologer blindet for de kliniske kjennetegn ved pasientene. Den intra-observatør reproduserbarhet ble testet ved å skaffe de mest brukte statistiske κ-score som gradere styrken avtale om seks kategorier [dårlig (κ-poengsum, 0,00), liten (0,00 til 0,20), rettferdig (0,21 til 0,40) , moderat (0,41 til 0,60), betydelig (0,61 til 0,80) og nesten perfekt (0,81 til 1,00)] [24].
Cell kultur
LoVo, SW620, DLD-en, HT -29, ble HCT116, SW480 og SW1116 kjøpt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), human kolon sunn cellelinje NCM460 ble kjøpt fra Incell aksjeselskap. Den SW620, HT-29, ble SW480 og HCT116-celler rutinemessig opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT). LoVo, DLD-1 og SW1116 ble opprettholdt i RPMI 1640-medium pluss 10% føtalt bovint serum. NCM460 ble dyrket i M3: 10 medium. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator under 5% CO
2.
etablering av stabile BIRC6-knockdown kloner
Lentiviral transduksjon ble brukt til å etablere BIRC6 knockdown stabile kloner. Et panel av shRNA (kort hårnål RNA) lentiviral vektorer skilte seg i BIRC6 målretting sekvenser (TRCN0000041-57 ~ 61) og pLKO.1-puro tom vektor ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA). Cellene ble transfektert ved en MOI av 1 for 24 timer, skjermet av puromycin. Inhiberingen effektivitet ble identifisert ved Western blotting.
Western blotting
Colorectum vev eller høstede celler ble homogenisert på SDS-lysebuffer (40 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 1 mM aprotinin, 1 mM PMSF og 10 mg /ml leupeptin) og deretter sentrifugert i 15 min ved 4 ° C. Totalt proteinlysatene hentet fra prøvene ble kvantifisert med BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). En alikvot av protein ble kokt med protein ladningsbuffer i 5 min, og ble applisert på SDS-polyakrylamidgel. Like mengder protein ble separert ved 8% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) ved anvendelse av en mini trans-blot-apparat (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med PBS-0,05% Tween 20 som inneholdt 5% fettfri tørrmelk i 1 time, etterfulgt av inkubering med antistoff mot BIRC6 eller glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-antistoff ved 4 ° C over natten. Membranen ble deretter inkubert med sekundær pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin eller anti-mus-antistoff (Jackson Immun Research Laboratories Inc, West Grove, PA). Blottene ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence kit (Tiangen, Kina). Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
celleproliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av Cell telling leder-8 (CCK-8) (Dojindo Co., Kumamoto, Japan) ifølge til instruksjonene fra leverandøren. Celler ble inkubert med CCK-8 i 1 time med 3 multipler og formeringshastigheten ble bestemt ved å måle absorbansen ved 450 nm med den universelle mikroplateleser. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger, [25].
kolonidannelse assay
forankrings-uavhengig vekst evne ble målt ved anvendelse av bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen og platen kolonidannelsesbestemmelsen respektivt. For bløt agar-kolonidannelse, kontroll eller stabile BIRC6-knockdown-celler (1 x 10
3 celler /brønn) ble resuspendert i DMEM eller RPMI 1640 inneholdende 0,3% agarose edel (Takara Shuzo Co., Tokyo, Japan) i seks- brønners plater. Suspensjonen ble lagt over DMEM eller RPMI 1640 inneholdende 0,6% agarose edel og ytterligere dekket med 0,5 ml DMEM eller RPMI 1640. Platene ble deretter inkubert i en 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C i 14 dager, med etterfylling av medium annenhver dag. Kolonier ble fotografert ved hjelp av Nikon ECLIPSE TE300 og makroskopisk synlige kolonier i 3 tilfeldig utvalgte felt per brønn ble regnet for kvantifisering. For plate kolonidannelse analysen ble cellene fra forskjellige behandlede grupper sådd ut i seks-brønns plater (800 celler /brønn) i 2 uker. Koloniene ble farget med 0,1% krystallfiolett i 20% metanol, og kolonier som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet. Plating effektivitet ble beregnet som:. Plating effektivitet = (koloni nummer /plating celle nummer) x 100%, i tre eksemplarer
Cellesyklus og apoptose analysen
Effekten av BIRC6 knockdown på cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri. Cellene ble trypsinert og fiksert med iskald 70% etanol ved 4 ° C over natten. For DNA-innhold-analyse ble celler inkubert med 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma, St. Louis, MO) i nærvær av 100 ug /ml RNase og 0,2% Triton X-100 i 30 minutter ved 37 ° C. DNA-innhold ble bestemt i BD FACSAria
II. Fordelingen av cellene i hver fase av cellesyklusen ble beregnet ved anvendelse av FlowJo Programmet. Hvert forsøk ble utført in triplo.
For apoptose analyse ved flowcytometri, ble cellene behandlet med 5-FU, CDDP, oksaliplatin eller CPT-11 (alle fra Sigma, St. Louis, MO) [26]. Legemiddelindusert apoptose ble analysert ved hjelp Annexin V analysesett (BD Biosciences, San Jose, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
Tumor xenograft modeller
Twenty mannlig Balb /c nakne mus (4 ukers alder, 12-14 g) ble kjøpt fra forsøksdyr Center of Shanghai Institute of Life Science (Shanghai, Kina) og ble reist under spesielle patogenfrie forhold. Alle operasjoner ble utført under bedøvelse med natrium pentobarbital. DLD-1 celler (stabil BIRC6 knockdown 59 og styre kloner, 10
6) i 0,1 ml PBS ble injisert subkutant i høyre flanke av hver mus. Musene ble avlivet etter 4 uker etter injeksjon; Tumorene ble skåret ut og veiet. Tumorvolumet ble beregnet ved følgende formel: 0,5 x L x W
2 (L = lengde av tumor; W = bredden av svulsten). Dyreforsøk ble utført i henhold til kriteriene som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, utarbeidet av National Academy of Sciences og publisert av National Institutes of Health, og også godkjent av etisk komité av Fudan University.
statistisk analyse
statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistisk programvare (versjon 17.0). Kategoriske variabler ble sammenlignet med χ
2 test eller Kontinuitet Correction eller Fishers eksakte tester som passer. Kontinuerlige variabler ble sammenliknet med Wilcoxon ranksum test og uavhengig to sample
t
-test. Univariat analyse ble utført for å identifisere faktorer som påvirker overlevelse av CRC. Multivariat analyse ble gjort ved hjelp av Cox multivariate proporsjonal hazard regresjonsmodell. Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden (log-rank test). Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) fra tre uavhengige eksperimenter og
P
-verdiene ble bestemt fra to-sidige tester. Statistisk signifikans ble vist som *,
P
0,05 eller **,
P
0.01.
Resultater
Forbedret BIRC6 uttrykk i CRC cellelinjer og klinikk CRC vev
Vi først oppdaget den BIRC6 uttrykk i 7 CRC celler. Western blotting viste at BIRC6 ble overuttrykt i LoVo, SW620, DLD-1, HT-29, HCT116, SW480 og SW1116, mens den ble svakt detektert i normal colon epitelcellelinje NCM460 (figur 1A). Vi neste utført Western blotting å undersøke BIRC6 uttrykk i 30 sammenkoblede CRC vev og tilstøtende nontumorous vev. Dataene antydet at BIRC6 ble forhøyet i tumorvev (fig 1b). Vi vurderte videre BIRC6 uttrykk i 126 CRC pasienter ved immunhistokjemi. Som et resultat ble signifikant BIRC6 farging detektert i CRC-vev (positive, 73 av 126), mens fargingen i tilsvarende normale vev var mye svakere (positiv, 17 126) (figur 1C og 1D). Spesielt ble reproduserbarheten av vår klassifisering av BIRC6 uttrykk funnet å være «nesten perfekt» (κ-verdi, 0.816) når 126 lysbilder av CRC vev ble vurdert av to uavhengige observatører. Resultatene ovenfor indikerte at BIRC6 var signifikant oppregulert i CRC cellelinjer og klinikk CRC vev.
(A) Uttrykk for BIRC6 i en human kolon sunn cellelinje og 7 CRC cellelinjer. Øvre panel: Typiske mønstre av BIRC6 uttrykk i NCM460 og CRC cellelinjer. Nedre panel: Relativ intensitet BIRC6 normalisert til GAPDH. Data stede Mean ± SEM fra tre uavhengige forsøk. (B) Uttrykk for BIRC6 i 30 parvise CRC vev (T) og tilstøtende nontumorous vev (N). Øvre panel: Typiske mønstre av BIRC6 uttrykk i CRC vev. Nedre panel: Relativ intensitet BIRC6 normalisert til GAPDH. (C) Immunohistochemistry farging av BIRC6 i tumorvev og selv paret tilstøtende ikke-tumor vev fra fire representative CRC pasienter. (D) Resultater av immunhistokjemi farging av BIRC6 i 126 tilfeller. **
P
0.01.
Sammenheng mellom BIRC6 uttrykk og klinisk patologisk data
Vi undersøkte sammenhengen av BIRC6 uttrykk med clinicopathologic funksjoner i 126 CRC pasienter. Pasient kliniske kjennetegn er oppført i S1 tabell. Det var ingen signifikant sammenheng mellom BIRC6 uttrykk og alder, kjønn, tumor beliggenhet, lymfeknutemetastase (N scenen), fjernmetastaser (M scenen), histologi type, grad av differensiering, KRAS status og MSI status. Men BIRC6 uttrykk positivt korrelert med tumorstørrelse (
P
= 0,044) og invasjon dybde (T scenen) (
P
= 0,013) (tabell 1).
Prognostic verdien av forbedret BIRC6 uttrykk
Kaplan-Meier analyse og log-rank test ble benyttet for å bestemme forholdet mellom BIRC6 uttrykk og prognose. CRC pasienter med positiv BIRC6 uttrykk tendens til å ha kortere total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) (
P
= 0,001 og
P
= 0,010, henholdsvis) (Fig 2A og 2B). Vi neste delt pasientene inn i to grupper: ingen kjemoterapi gruppe og kjemoterapi gruppe. Som det viste i figur 2C og 2D, ble BIRC6 uttrykk korrelert med OS (
P
= 0,038) og DFS (
P
= 0,041) på ingen kjemoterapi gruppe. Lignende resultater ble observert i kjemoterapi gruppe (
P
= 0,003 og
P
= 0,010) (fig 2E og 2F). Univariat analyse viste at positiv BIRC6 uttrykket var forbundet med dårligere OS (
P
= 0,002) og DFS (
P
= 0,013) (tabell 2). Andre faktorer som korrelerte med OS var T stadium, N stadium, M scene og tumor differensieringsgrad. Faktorer som påvirker DFS inkludert T scenen, N scenen, KRAS status og MSI status. I tillegg multivariat analyse identifisert forbedret BIRC6 nivå en risikofaktor for både OS (
P
= 0,045) og DFS (
P
= 0,026) (tabell 3).
total overlevelse (A) og sykdomsfri overlevelse (B) mellom pasienter med positiv og negativ ekspresjon av BIRC6 ble estimert ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet med log rank test. Total overlevelse (C) og sykdomsfri overlevelse (D) ble beregnet på ingen kjemoterapi gruppe. Total overlevelse (E) og sykdomsfri overlevelse (F) ble estimert i kjemoterapi gruppe. Pasienter med TNM stadium IV svulster ble ekskludert når analysere sykdomsfri overlevelse.
BIRC6 knockdown hemmet CRC celleproliferasjon
Siden full-lengde cDNA av BIRC6 strekker seg til 14,5 kb, er det vanskelig å overuttrykker BIRC6 i en cellelinje. I stedet brukte vi lentiviral transduksjon å etablere BIRC6 knockdown stabile kloner i to CRC cellelinjer: SW480 og DLD-en. Den nedregulert BIRC6 ekspresjon ble observert signifikant i to BIRC6-knockdown-cellelinjene (59 og 61), som vist ved Western blotting (fig 3). Disse to kloner ble brukt i den påfølgende analysen.
(A) BIRC6 knockdown effektivitet ble bekreftet fra Western blotting. (B) Relativ ekspresjon av BIRC6 normalisert til GAPDH ble beregnet. **
P
0,01 vs. kontroll.
CCK-8-analysen viste at BIRC6 knockdown betydelig hemmet spredning av SW480 og DLD-1 celler i en tidsavhengig måte
in vitro plakater (fig 4A ). Kolonidannelse analyse viste at BIRC6 knockdown redusert kolonidannelse i agar i SW480 og DLD-1 celler (figur 4B). Lignende resultater ble observert i kolonidannelse i form av plater (fig 4C).
(A) Celle-vekstkurver for kontroll (CS) og to BIRC6 knockdown kloner (59 og 61). (B) Representative bilder av bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen og relative nivåer av kolonier i BIRC6 knockdown kloner normalisert til kontrollen. (C) Representative bilder av platen kolonidannelsesbestemmelsen og relative nivåer av kolonier i BIRC6 knockdown kloner normalisert til kontrollen. Data stede Mean ± SEM fra tre uavhengige forsøk. **
P
0,01 vs. kontroll.
BIRC6 knockdown indusert cellesyklus arrest i S-fasen og downregulated cyclin A2, B1, D1 og E1 nivåer i CRC celler
Cell syklus analyse viste at andelen av celler i S-fasen økte, mens prosentandelen av celler i G2 /senkes M fase etter BIRC6 knockdown i både SW480 celler og DLD-1 celler (figur 5A og 5B), som indikerte at BIRC6 knockdown hindret CRC-celler fra å komme inn den mitotiske fase . For å sjekke om BIRC6 kunne regulere gener som er involvert i cellesykluskontroll, vi har oppdaget effekten av BIRC6 på uttrykk for flere sykliner. Western blotting indikerte at BIRC6 knockdown reduserte nivåene av cyclin A2, B1, D1 og E1 i begge SW480-celler og DLD-1 celler (figur 5C).
(A) Representative bilder av cellesyklus bestemt ved PI farging . (B) Kvantifisering av cellesyklusfordelingen. Kontrollceller ble celler transfektert med pLKO.1-puro tom vektor; KD-59 og KD-61 var celler transfektert med shRNA lentiviral vektorer skilte seg i BIRC6-målretting sekvenser. (C) Uttrykk for cyclin A2, B1, ble D1 og E1 utført av Western blotting i kontroll og to knockdown kloner.
BIRC6 knockdown sensibiliserte CRC celler til kjemoterapi
in vitro
og
in vivo
Vi undersøker hvilken rolle BIRC6 i chmosensitivity av ESCC celler. Selv BIRC6 knockdown alene ikke indusere apoptose i SW480 celler og DLD-1 celler, BIRC6 knockdown sensibiliserte SW480 celler og DLD-1 celler til kjemoterapi-indusert apoptose inkludert 5-FU, CDDP, oksaliplatin og CPT-11 (figurene 6A og 6B og S2). Den finner at BIRC6 knockdown hemmet cellevekst og lysfølsomt CRC celler til kjemoterapi-indusert apoptose
in vitro
bedt oss om å finne ut om det utøver en lignende effekt
in vivo
. Kontroll eller BIRC6 stabil knockdown kloner av DLD-en ble subkutant inokulert i nakne mus. Da alle dyr hadde etablert tumorer med gjennomsnittlig fra 50 til 100 mm
3, ble tumorbearing mus behandlet med CDDP (4 mg /kg, i.p., to ganger ukentlig) [27]. Antitumoreffektiviteten ble målt ved å overvåke tumorvolum og vekt etter behandling. BIRC6 knockdown litt hemmet tumorvekst. Interessant kombinasjon av BIRC6 knockdown og CDDP behandling vesentlig hemmet tumorvekst sammenlignet med enten BIRC6 knockdown eller CDDP behandling alene (Fig 7A og 7B).
(A) Representative bilder av celle apoptose vurdert av Annexin V /PI farging i kontrollen (CS) og BIRC6 knockdown celler behandlet med CDDP (40 uM for SW480 eller 100 uM for DLD-1) i 24 timer eller ikke. (B) Representative bilder av celle apoptose for kontroll og BIRC6 knockdown-celler ble behandlet med 5-FU (75 mg /ml for SW480 eller 50 ug /ml for DLD-1) i 48 timer eller ikke. (C) Kvantifisering av apoptose hastighet. Data stede Mean ± SEM fra tre uavhengige forsøk. **
P
0,01 vs. kontroll.
DLD-1 celler stabilt transfektert med kontroll shRNA og BIRC6 knockdown shRNA (59) ble injisert subkutant i nakne mus. Tumorbearing mus ble behandlet med CDDP (4 mg /kg, i.p., to ganger ukentlig). (A) Et tumorstørrelse ble overvåket. (B) Totalt tumorvekt for hver gruppe av mus ble registrert. Foreliggende data Gjennomsnitt ± SEM av 5 mus i hver gruppe. *,
P
0,05; **
P
0.01.
Diskusjoner
Ervervet resistens mot apoptose er en av de definerende kjennetegnene til kreft [28]. IAP, en gruppe av anti-apoptose-proteiner som er sterkt evolusjonært konservert på tvers av flere arter, er viktige regulatorer av apoptose [29]. BIRC6, også navngitt som Apollon, er det største medlemmet av IAP familie med 4830 aminosyreresiduer [12]. Det er også den eneste kjente IAP element som er membranassosiert og lokaliserer til Golgi rommet og vesikulær system [30]. BIRC6 er sterkt konservert i forskjellige arter, noe som tyder på en felles biologisk funksjon. Sekvensanalyse viste at BIRC6 delte om 92% aminosyre identitet med Bruce, et medlem av IAP familien fra mus [12]. I tillegg eksisterer det Drosophila homolog av BIRC6 kalt dBruce [31]. I motsetning til de fleste andre pattedyr IAP, har BIRC6 blitt vist å være avgjørende for levedyktigheten. Komplett inaktivering av Bruce gen førte til perinatal dødelighet og veksthemming hos mus embryoer etter embryonale dag 14 [32]. Likeledes, delesjon av den C-terminale halvdel av Bruce som skyldes aktivering av kaspaser og apoptose i placenta og plommesekken, og resulterte i embryonale letalitet [17]. Videre har mange bevis indikerte at BIRC6 ble overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert gliom, barndom
de novo
akutt myeloid leukemi, brystkreft, neuroblastom, prostatakreft og ikke-små-celle lungekreft, og overekspresjon av BIRC6 var korrelert med kreftutvikling, progresjon og dårlig prognose for ondartet svulst [12,16,18,33,34,35]. Selv om tidligere studie viste at BIRC6 var oppregulert i tykktarmskreft ved hjelp av cDNA microarray og QRT-PCR-analyse, forholdet mellom BIRC6 uttrykk og kolorektal kreft progresjon har ikke blitt grundig undersøkt.
I denne studien har vi observert at ekspresjonen av BIRC6 kunne påvises i både kolorektal kreft og tilstøtende vev, men med forskjellig prosentandel. Nivået av BIRC6 ble åpenbart oppregulert i CRC vev sammenlignet med tilstøtende nontumorous vev. Vi viste også at høyt uttrykk for BIRC6 var assosiert med uønskede kliniske og patologiske funksjoner i tykk- og endetarmskreft. Videre pasienter med positiv BIRC6 uttrykk tendens til å overleve kortere og hadde en høyere risiko for tilbakefall enn de med negative BIRC6 uttrykk. Univariat og multivariat analyse viste at BIRC6 uttrykk var signifikant korrelert med OS og DFS, noe som indikerer at BIRC6 var en prediktor for prognose.
På samme måte BIRC6 ble også overuttrykt i 7 CRC cellelinjer. Vi søkte RNAi tilnærming til å undertrykke BIRC6 uttrykk og utforsket rollen BIRC6 i CRC progresjon. Våre resultater viste at knockdown av BIRC6 redusert CRC celleproliferasjon, som er i samsvar med den tidligere undersøkelsen i flere andre tumorer. Analysen cellesyklus indikerte at BIRC6 knockdown resulterte i S-fasen blokken, og dermed hindre CRC-celler fra å gå inn i mitose. Videre fant vi at BIRC6 knockdown redusert cyclin A2, B1, D1 og E1 nivåer i CRC celler. Vi foreslo at redusert Cykliner nivåer kan bidra til BIRC6 knockdown-indusert S-fasen blokk. I samsvar med vår hypotese, Lee
et al
. [36] funnet at forbindelsen som består av hinokitiol reduserte nivåene av cyklin A og cyclin E og ført til S-fasen arrest i HCT116 og SW620-celler. Joe
et al
. [37] rapporterte at resveratrol redusert nivåene av cykliner D1, A og B1 og resulterte i S-fasen arrest i SW480 celler. Men i motsetning til våre resultater, Kikuchi
et al
. [38] fant at BIRC6 ubiquitylated cyclin A og BIRC6 mangel akkumulert mer cyklin A i 293T celler. Følgelig er effekten av BIRC6 på cykliner synes å avhenge av celletyper og målproteiner. Til slutt fant vi ut at BIRC6 knockdown sensibilisert CRC celler til kjemoterapi både
in vitro Hotell og
in vivo
, som gir en begrunnelse for å kombinere BIRC6 antagonisme med cellegift for å behandle CRC.
Denne studien har visse begrensninger. For eksempel, var korrelasjonen mellom BIRC6 og prognose bestemt i et begrenset antall av CRC-pasienter (n = 126), og denne korrelasjonen kreves bekreftelse på en større skala-basis. På samme måte, det faktum at vi ikke observerer en signifikant korrelasjon mellom BIRC6 uttrykk og MSI status må videre etterforskning i større prøver før fastere konklusjoner kan trekkes. Det er verdt å merke seg at vi fant ut at BIRC6 regulert cellecyklusprogresjonen via modulering av cellesyklus-regulering proteiner. Mens økende bevis har antydet en biologisk sammenheng mellom MSI og endringer i cellesyklusregulering proteiner i kreft [39,40].
Avslutningsvis tilveiebringer foreliggende studien bevis for at BIRC6 fungerer som en prognostisk faktor av humant CRC. Videre våre resultater tyder på at BIRC6 knockdown i kombinasjon med kjemoterapi kan ha terapeutisk potensial i behandlingen av menneskelige CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 datasett. Data for alle Western blotting, immunhistokjemi og overlevelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125281.s001 plakater (docx)
S2 datasett. Data for celleproliferasjon analysen, kolonidannelse analysen, cellesyklus og apoptose analyse og tumor xenograft modeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125281.s002 plakater (docx)
S1 Fig.
