Abstract
Bakgrunn
En svulst er ansett som en heterogen kompleks i et tredimensjonalt miljø som er i flukt med patofysiologiske og biomekaniske signaler. Celle-interaksjoner stromaceller lede utvikling og generering av tumorer. Her vurderer vi bidrag fra normale fibroblaster til magekreft.
metodikk /hovedfunnene
Etter coculturing normale fibroblaster i monolag av BGC-823 magekreftceller, tumorceller sporadisk utviklet kort, spindel -liker morfologiske egenskaper og vist forbedret spredning og invasiv potensial. Videre er de transformerte tumorceller påvises redusert tumordannelse og økt lymphomatic og intestinal metastatisk potensial. Ikke-transformerte BGC-823-celler, i motsetning, viste primær tumordannelse og forsinket tarm og lymfeknute invasjon. Vi har også observert E-cadherin tap og oppregulering av vimentin uttrykk i de transformerte tumorceller, noe som antydet at økningen i metastase ble indusert ved epitel-til-mesenchymale overgang.
Konklusjon
Kollektivt våre data indikerer at normale fibroblaster tilstrekkelig indusere epithelial-til-mesenchymale overgang i kreftceller, og dermed føre til metastase
Citation. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) Normale Fibroblaster Frem E-cadherin tap og øke lymfeknutemetastase i magekreft. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306
Redaktør: Elad Katz, AMS bioteknologi, Storbritannia
mottatt: 10 desember 2013; Godkjent: 16 april 2014; Publisert: May 20, 2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Health Key Special Fund (https://program.most.gov.cn; No.200802112), National Science Fund Committee (https://www.nsfc.gov.cn; generell prosjekt Nei .81372302 No.81272120), helse Institutt fondet (https://program.most.gov.cn; No.2007A093), nøkkelen prosjektet i Zhejiang-provinsen (https://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). The Natural Science Fund i Zhejiang-provinsen (https://www.zjnsf.gov.cn; No.Y2080001, Y12H160121, og Z2080514), og tradisjonell kinesisk medisin Bureau Fund (https://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er ansvarlig for opp til 90% av kreftrelatert dødelighet. Mange pasienter som viser ingen tegn til metastaser ved første diagnose vil etter hvert utvikle metastaser. Selv om metastaser forårsake de fleste kreftdødsfall, forblir denne prosessen en av de mest gåte aspekter av sykdommen.
metastatisk tumorceller angi vev via ekstravasasjon. Vevet, men gjennomgår uklare prosesser ved hvilke cellene er integrert i de vev matrisen og kommer i direkte kontakt med stromale celler, hvorav de fleste er normale fibroblaster. Tumorceller har alle muligheter til å komme i kontakt med stromale celler, inkludert neoplastiske og metastatiske celler [1]. Dette fører til gjensidig cross-talk med normale fibroblaster i vevet.
Fibroblaster er de mest tallrike stromale celler, og de stimulerer mikromiljøet og tjene som en rik kilde for parakrint sti under tumorigenesis og progresjon. Effektene av normale fibroblaster på tumorceller er omstridt. Det har blitt rapportert at normale fibroblaster undertrykke ondartet omdannelse av udødelig prostata epitel [2], mens i brystsvulster, fibroblastene omdanne duktalt karsinom til invasivt karsinom [3].
Denne uoverensstemmelse viser at innvirkningen av fibroblaster på kreftcellene er annerledes enn for kafeer (kreft assosiert fibroblaster). For denne studien, cocultured vi tumorceller med normale fibroblaster i Petri-skåler for å etterligne hvor tumorceller kontakt med fibroblaster. Vi fokuserte på bidrag fra normale fibroblaster til magekreft. Vi dyrkes de normale fibroblaster til å danne tette monolag, som så ble formidlet med tumorceller for å etterligne metastatiske tumorceller. Vi antok at høy andel av fibroblaster til kreftceller kan etterligne vev der metastasized kreftceller bor. Således ble dermale fibroblaster fra friske individer som brukes for å fremstille det cellulære miljø. Den magekreft cellelinje, BGC-823, ble brukt her fordi det er morfologisk distinkt fra fibroblaster.
Materialer og metoder
Etisk erklæringen
Primære menneskelige dermal vev ble oppnådd fra barn som gjennomgikk omskjæring etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra sine omsorgspersoner, som var inkludert i deres journaler. Dette eksperimentet ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine (etisk kode: Forskning 2013-047). Pasientene inkludert i denne studien var utstyrt med en kopi av skriftlig informert samtykke og ga tillatelse til å publisere.
Alle forsøkene ble gjennomført i henhold til retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr i Rådet for vitenskap og teknologi of China. Studien protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk komité Zhejiang University.
Reagenser og antistoffer
Penicillin G /streptomycin, fosfat-bufret saltvann (PBS), Triton X-100, storfe serumalbumin, kollagenase type I og trypsin ble anskaffet fra Jinuo (Kina). Høy-glucose DMEM ble oppnådd fra Gibco (Kina) og føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Gibco (SA). Cisplatin, 5-fluoruracil, puromycin, og kollagen type I ble innkjøpt fra Sigma (USA). Cisplatin ble oppløst i dimetylformamid (DMF), 5-fluoruracil i DMSO, og puromycin i PBS for å lage lagerløsninger som så ble lagret ved -20 ° C. Kollagen type I (5 mg /ml) ble fortynnet til 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol-HCl) i PBS ble oppnådd fra Roche, og geite-anti-mus og kanin IgG, sekundært antistoff-TIRTC, og sekundære antistoffer ble oppnådd fra ZSGB-Bio (Kina). Antihuman-E-cadherin kanin (ab40772), antihuman kanin-vimentin (ab92547) og antihuman-β-catenin kaninantistoffer (ab9274) ble oppnådd fra Abcam (UK). Antihuman-pan-CK-mus-antistoff (C11) og N-cadherin kanin-antistoff (C4061) ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Kina) og antihuman-β-aktin og sekundært geite-anti-kanin-antistoffer ble oppnådd fra BOOSTER (Kina) . Antistoffer ble fortynnet med 5% FBS å jobbe konsentrasjoner med mindre annet er nevnt.
Cell Culture
De etablerte cellelinje, human magekreft BGC-823 cellene som brukes i vårt eksperiment ble kjøpt fra cellen bank Guangzhou Institute biomedisin og helse. Cellene ble tint og passert til 4-5 ganger og deretter ble anvendt i ko-kultur-eksperimenter. Primære dermale fibroblaster ble innhentet fra de kirurgiske eksemplarer av barn som hadde gjennomgått omskjæring og gitt informert samtykke. Fibroblaster ble anvendt etter den tredje passasje (innen 50 passasjer), dyrket i høy-glucose DMEM inneholdende 10% FBS, og holdt i en fuktet inkubator (5% CO
2) ved 37 ° C. Cellemediet ble byttet ut annenhver dag.
For genereringen av TBGCs, fibroblastene (FBS) og BGC-823-celler ble cocultured ved et forhold på 10:01 i ytterligere 10 dager etter at de dyrkede cellene nådd samløpet. Kuppel dannelse ble observert i ko-kultur-system. Celleblandingen ble deretter passert ved trypsinering med fersk fibroblaster (1 x 10
6 celler /ml). I løpet av andre og påfølgende passasjer, tilsynelatende undergang dannelse og suspendert runde formede celler dukket opp som viste ulike morfologiske egenskaper og langvarig tilknytning etter passering. Etter den femte passering av de blandede suspenderte celler og tette normale fibroblaster, uniform, korte, spindel-lignende celler betegnes «TBGCs» ble produsert og viste ikke morfologisk hjemfall til BGC-823 celler til . 10-15 passasjer
Proliferation Assay
Eksponensielt voksende celler ble sådd ut i 96-brønners plater for ytterligere 6 dagers inkubering ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Celleproliferasjon ble målt i quintuplicate hver dag ved å pipettere 20 ul CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, USA) i hver brønn som inneholdt 100 pl høy-glucose DMEM, deretter ble cellene inkubert i ytterligere 2 timer før bestemmelse av relativ absorbans ved 490 nm ved anvendelse av en mikrotiterplateleser.
Drug hemningsmetoden
Fem duplikasjoner av eksponentielt voksende celler ble sådd i en 96-brønners plater og inkubert i 24 timer. Etter 24 timer ble mediet erstattet med forskjellige konsentrasjoner av legemidler (0-80 uM) og dyrket i ytterligere 24 timer. Drug toksisitet ble evaluert ved å måle antall levedyktige celler ved hjelp av spredning analysen beskrevet ovenfor.
Skrape-analysen
Cellene ble sådd ut på 24-brønners plater (5 x 10
4 celler /godt) og dyrket til samløpet. Pipettespissene ble anvendt for å danne riper. PBS ble brukt til å fjerne celleavfall, og deretter byttet ut med FBS-fritt medium. Bilder ble oppnådd i 3 påfølgende dager. Bredden av bunnen ble målt ved anvendelse ImageJ 1,47 programvare for Windows (https://rsb.info.nih.gov/ij/) og plottet som scratch avstand per dag.
migrering og invasjon Assay
Cell motilitet analysering ble utført ved anvendelse av transwell innsatser (8 um porestørrelse) (Corning, USA). Celler-GFP (grønt fluorescerende protein) (1 x 10
5/500 mL) ble suspendert i FBS fritt medium og plassert over innstikk i tre eksemplarer, med 800 ul kulturmedium lastet under. Etter inkubering over natten, ble skivene vasket 3 x med PBS og tørkes med en fuktet bomullspinne ovenfor hvor fiksert med 4% PFA nedenfor og observert ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (Olympus, Japan). Den samme fremgangsmåte ble brukt til å utføre analysen invasjon, men innsatsene som ble forhåndsbelagt med Matrigel (BD, USA) ble anvendt. Begge analysene ble kvantifisert som antall celler tellet i 5 tilfeldige områder (200 x forstørrelse).
Apoptose-analysen
apoptotiske celler ble målt ved bruk av Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit (Keygen, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler var enten ubehandlet eller behandlet med legemidler i 24 timer, og deretter høstet, vasket to ganger med PBS, resuspendert i bindingsbuffer inneholdende 5 pl FITC-Annexin V og 5 ul PE, og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Analysene ble utført ved hjelp av flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).
Kvantitativ Real-time PCR
Nuclear ekstrakter ble utarbeidet etter den RNeasy mini-kit i henhold til produsentens instruksjoner. Renset RNA prøver (1 mikrogram) i DEPC vann ble revers-transkribert ved hjelp av PrimeScript II første Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Kina). RT-PCR og forsterking ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II kit (Takara).
En 20 mL reaksjonssystem som inneholder 1 mL fortynnet cDNA prøvene, 10 mL SYBR Premiks Ex Taq II (2 x), 0,4 mL ROX Reference Dye (50 ×), 7 mL sterilt dobbelt destillert H
2o, og en ul forover og bakover primere (se Materialer og metoder S1) var forberedt og evaluert ved hjelp av smeltekurve analyse og sammenlignings terskelen syklus (Ct) metode. De følgende sykkelbetingelser ble benyttet: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 58 ° C i 1 minutt. GAPDH ble anvendt som kontroll-genet.
Western Blot analyse
Proteiner ble ekstrahert fra eksponentielt voksende celler og primære vev. Ekstraktene ble kokt i ladningsbuffer, løst på 10% Tris-HCl SDS-polyakrylamidgeler, og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, USA) ved bruk av standardmetoder. Membranene ble blokkert ved bruk av 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST) i 30 minutter ved romtemperatur. Membranene ble vasket med TBST og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot E-cadherin (1:5000), vimentin (1:5000), β-catenin (1:5000), N-cadherin (1:1000), og β-aktin (1:1000). Etter vasking 3 x med TBST ble sekundært geite-anti-kanin (1:1000) tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt, ble immunkomplekser visualisert ved hjelp av kjemiluminescens ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore). Proteinkonsentrasjonen ble normalisert til p-aktin.
Histologisk og Immunohistokjemiske Analyser
Prøvene ble hurtig frosset i flytende nitrogen, lagret ved -80 ° C, fiksert i 4% PFA, og seksjonert for å en tykkelse på 10 um (Leica, Tyskland).
for hematoxylin og eosin (HE) farging, ble deparaffinized glir farget med hematoksylin i 15 minutter, vasket 3 x med PBS, syre alkohol i 5 sekunder, deretter eosin i 5 minutter (BOOSTER, Kina).
for immunhistokjemisk farging, ble lysbildene rehydrert og varme-indusert epitop gjenfinning ble utført i citratbuffer ved hjelp av en trykkoker (20 minutter ved 80 pKA), blokkert med tre % H
2o
2 i 15 minutter, og deretter normalt geiteserum ble anvendt (30 minutter ved romtemperatur). Lysbilder ble inkubert i følgende primære antistoffer: anti-E-cadherin (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-catenin (1:250), og anti-pan-CK (1:250 ). Prøvene ble inkubert over natten ved 4 ° C, skylt to ganger med PBS, og inkubert med det sekundære antistoff i 2 timer ved 37 ° C. DAB Plus kromogen kit (BOOSTER) ble brukt til å oppdage alle antigener. Skinnene ble kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert med dekkglass ved hjelp av nøytral Balata. Begge analysene ble separat utført av patologer og klinikere som var blind for utvalgsgrupper. Tvister ble løst ved konsensus.
immunfluorescens og Konfokalmikroskopi
Celler ble sådd ut på kammer lysbilder, og de frosne seksjonene ble fiksert med 4% PFA og permeabilized med 0,5% Triton X-100. Platene ble blokkert med normalt geiteserum i en time ved 37 ° C, skylt og inkubert over natten med primære antistoffer ved 4 ° C, deretter overført og inkubert med geite-anti-mus og anti-kanin-TIRTC antistoffer i 1 time ved 37 ° C i mørket. Lysbilder ble vasket ved hjelp av glyserin og montert med dekkglass. Kjerner ble kontra med DAPI. Fluorescens ble påvist ved hjelp av en konfokal laser-scanning mikroskop (Olympus). De deparaffinized frysesnitt ble farget med DAPI og analysert ved hjelp av en immunofluorescent mikroskop.
Animal Model
Åtti fire uker gamle BALB /c-mus ble kjøpt fra Animal Research Center i Shanghai og vedlikeholdes på forsøksdyr midten av Zhejiang Academy of Medical Science. Ifølge retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr i Rådet of Science and Technology i Kina, ble alle dyr som holdes under aseptiske sterile forhold og administreres autoklaveres mat og vann i samsvar med prinsippene for Laboratory Animal Care of Zhejiang University. Førti-fire mus ble brukt i det subkutane modell, og ble delt jevnt i kontroll- og eksperimentgrupper. De BGC-GFPs ble brukt som kontroll der TBGC-GFPs var bruksområder som eksperimentet. Tumorcellene ble høstet i løpet av vekstfasen, og suspendert i FBS-fritt medium (1 x 10
6 celler /ml). Celler ble pipettert til enkeltcellesuspensjoner, og hver 500 ul løsning ble inokulert subkutant på begge sider av brystet. Musene ble avlivet hver 2 uker til 10 uker, og patologiske undersøkelser ble utført. Alle musene ble veid hver 3. dag. Alle operasjoner ble utført under 1% natrium pentobarbital, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Trettiseks mus ble brukt i vene injeksjon gruppe for vurdering av kreft distribusjon (18 mus i BGC-GFP kontrollgruppe og 18 mus i TBGC-GFP eksperimentgruppen). 500 pl cellesuspensjon (5 x 10
5 celler) ble injisert i halevenen til nakne mus. Musene ble avlivet ved 2
nd,
th 5, 8
th og 10
th uker for patologisk undersøkelse.
Statistical Analysis
Eksperimentelle data ble samlet og inngått regneark. Normalitet testene ble utført før å sammenligne data. Sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av Student
t
test. Enveis variansanalyse ble brukt til å sammenligne 3 grupper, og Tukey metode ble brukt for
post hoc
sammenligninger av grupper. I denne studien
p
0,05 er ansett som statistisk signifikant. SPSS 20.0 for Windows (IBM SPSS Statistics, https://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) ble anvendt for å utføre alle statistiske analyser. R (ggplot2) (https://www.r-project.org/; https://www.r-project.org/) ble brukt til å generere alle grafiske presentasjoner
Resultater
1. Morfologiske endringer i BGC-823 celler mimick stromale celler
Fibroblaster (FBS) og BGC-823 celler ble cocultured i forholdet 10:01 i ytterligere 10 dager etter at dyrkede celler nådd samløpet. Celleblandingen ble deretter passert ved trypsinering med fersk fibroblaster (1 x 10
6 celler /ml) (figur 1,1). Dome Formasjonen i BGC-823 celler ble observert etter første passering. I løpet av den andre og påfølgende passasjer, opphengt rund-formede celler viste seg i dyrkede system: noen samlet i klaser eller klumper og ble løst knyttet til overflaten av fibroblaster. De parallelle-kultivert BGC-823 celler viste bare noen få rund-formede celler i bunnen når kulturen ble overbefolket. De blandet suspendert celler utstilt ulike morfologiske egenskaper og langvarig tilknytning etter passering. Disse cellene viste enten en brostein-lignende utseende som ligner på BGC-823 celler eller korte spindel-lignende funksjoner. Uniform, korte, spindellignende celler ble fremstilt ved passering av de blandede suspenderte celler og tette normale fibroblaster. I motsetning til dette passasje av supernatanten av de BGC-823-celler bare påvises rester etter 24 timers dyrking, i hvilken små mengder av celler som overlevde til å danne brostein-lignende kloner som ligner foreldre BGC-823-celler (figur 1.3A-H).
Figur 1.1. Skjematisk av den eksperimentelle protokollen. Figur 1.2. Origin av supernatanten celler. (A) GFP-merket BGC-823 celler (grønn). (B) BGC-823 celler som ble cocultured med fibroblaster (rød). (C) BGC-823 cellene vokste til klumper og demonstrerte runde former i suspensjon. (D) TBGCs ble indusert av coculturing. Forstørrelse 100 ×. Figur 1.3. Transformasjon fra BGC-823 celler til TBGCs henhold et fasekontrastmikroskop. (A-D) BGC-823 celler i en tett kultursystem kan dannes klynger og skur av celler i suspensjonen. (E-H) Passasje av suspenderte tumorceller. Figur 1.4. Immunofluorescent farging av pan-CK (rød), E-cadherin (rød), vimentin (rød) og N-cadherin (rød). BGC-823 celler (over) og TBGCs (under) ble merket med GFP (grønt). Kjernen var farget med DAPI (blå). Figur 1.5. Heat tomt på genuttrykk profiler analysert ved hjelp av fluorescens kvantitativ RT-PCR. Dybden av farge angir relative genekspresjon. Figur 1.6. Western blot av proteiner. Figur 1.7. Bar plott av protein ekspresjon bestemt ved anvendelse av Western blot-analyse. Barer betegne de relative uttrykk nivåer målt ved hjelp av IOD. Vertikale linjer betegne standard forskjeller. ** P. 0,01
Senere forsøk ble gjennomført for å finne kilden til de suspenderte cellene i cocultured system. BGC-823 celler og fibroblaster ble transfektert med GFP-puro kassett og RFP-puro kassett, henholdsvis, og heter henholdsvis BGC-GFP og FB-RFP,. Etter coculturing vokste BGC-GFP inn multilayers og dannet en kuppel-lignende struktur. I mellomtiden ble de runde-formet eller sfæroide celler som ble suspendert i media overført til kulturplater og merket med grønn fluorescens, noe som viser at langsiktig coculturing med fibroblaster induserer BGC transformasjon. Runde og sfæroide celler som ble suspendert i mediet ble også observert ved anvendelse av grønn fluorescens og kan passeres uten tilsetning av fibroblaster (figur 1.2A-D). Etter flere påfølgende runder med coculturing, forvandlet BGC-823 celler (TBGCs) ble oppnådd som dukket opp mer ensartet, kort, og spindel-aktig. Disse cellene ble deretter passert uten tilsetning av fibroblaster. Interessant, disse cellene var mer tilbøyelige til å danne sfæroide strukturer enn de cellene som vokste til konfluens og ikke viser morfologisk hjemfall til BGC-823 celler inntil . 10-15 passasjer
En tidligere studie rapporterte at fibroblaster hemme veksten av andre celler når cocultured
in vitro
av mekanismen av kontaktinhibering [4]. I våre forsøk har imidlertid normale fibroblaster kontakte ikke-hemmer proliferasjonen av BGC-823-celler. I stedet FB-RFPs gradvis omkom med BGC-GFP spredning når dyrkingen ble utvidet til 10 dager. Derfor ble rad FB tilskudd er nødvendig for å passasje og opprettholde stabil produksjon av TBGCs. Vi observerte også at når en liten mengde av TBGCs ble tilsatt til den konfluente fibroblast ark, tumorcellene som vokste utenfor ble presset bort av fibroblaster. I sentrum av tumoren koloni ble cellene runde-formet, med bare løse vedlegg til basen (figur 1.3A-H).
2. Epitelial-mesenchymale Overgang fra BGC-823 Cell å TBGC
Real-time PCR ble brukt til å analysere mRNA uttrykk. Resultatene viser at E-cadherin uttrykk ble bemerkelsesverdig downregulated sammen med oppregulering av vimentin i TBGCs. I mellomtiden, uttrykk for vri, snegle, slug, og N-cadherin ble alle oppregulert (figur 1.5). Immunfluorescens farging og Western blot bekrefte E-cadherin tap og økt uttrykk av vimentin, N-cadherin og β-catenin (figur 1.4), og bekrefter dermed at langsiktig epitelial-mesenchymale overgang (EMT) oppstår i TBGCs. E-cadherin er et velprøvd kjennetegn på EMT og opprettholder celle-celle vedlegg i epitel. E-cadherin tap kan føre til svulst shedding flere celler av fra tumormassen.
3. Spredning, Invasion, og mobilitet av TBGCs
TBGC spredning ble analysert ved hjelp av MTS analysen. TBGCs demonstrert en akselerert spredning rate (
p
0,01) (figur 2.1). Flowcytometri (se Materialer og Metoder S1) viser at 13% av TBGCs ble beholdt i S-fasen, i motsetning til bare 7% av BGC-823-celler (Figur S1.3). Den skrape analysen viser at TBGC motilitet økt sammenlignet med fars BGC-823 celler (Figur 2.2-2.3A-H). TBGC anastomose kreves 3 dager etter oppstart av riper, mens 4 dager var nødvendig for BGC-823 celler (
p
0,05). (Figur 2.2)
Figur 2.1. linjeplott av spredning analysen. Vertikale linjer betegne standard forskjeller. ** P 0,01. Figur 2.2. Linjeplott av skrape analysen. Vertikale linjer betegne standard forskjeller. ** P 0,01. Figur 2.3. Kloring analyse av BGC-823 celler (over) og TBGCs (under) under et fasekontrastmikroskop. (A-D, E-H) Tiden fra første 72 timer. Figur 2.4. Boksplott av de invasive og migrasjon analyser. Forskjeller mellom BGC-823 celler og TGBCs er signifikant (p 0,01). Figur 2.5. De 2 øverste bildene viser resultatene av invasiv modifisert transwell analysen med Matrigel. Representative bilder av transwell invasjons analyser for (A) BGC og (B) TBGC. Celler invaderende undersiden av transwell innsatsen er vist. De nederste 2 bildene er representative bilder av transwell migrasjon analyser for (C) BGC og (D) TBGC. Celler migrerer til undersiden av transwell innsatsen vises.
Resultatene fra Matrigel invasjonen analysene viser at TBGCs er mer aggressive enn BGC-823 celler. Totalt 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltrert Matrigel i forhold til 188.33 ± 58,62 BGC-823 celler i kontrollgruppen (
p
0,01) (figur 2.4, figur 2.5A, B). Imidlertid TBGCs viser en signifikant reduksjon i migrerte celler: to ganger mindre enn BGC-823-celler i henhold til den transwellmigrasjonsanalyse (
p
0,01) (figur 2.4, fig 2,5C som var blitt D). Den suspenderte natur TBGCs kan forklare denne reduksjonen, etterlevelse prisen var bare 68,33 ± 10,41% i TBGCs på Matrigel mens 99,77% ± 6,25% i BGC-823 celler, viste treg vedlegg til Matrigel overflaten i TBGCs (tabell S1) .
for å bedre etterligne
in vivo
tumor atferd, kollagen type i gel ble brukt til å fastslå forholdet mellom fibroblaster og invasiv kapasitet BGC-823 celler og TBGCs. Kollagen type I gel var forberedt på transwell inserts med fibroblaster (se Materialer og metoder S1). Fibroblast-lastet geler ble dyrket i 7 dager, og deretter GFP-merket cancer-celler ble sådd ut på gelen og dyrket i de neste 7 dagene. Inspeksjon av de høstede geler avslørte at tumorcellene hadde trengt inn i de kollagen-geler. Når gelene ble lastet med fibroblaster, TBGCs oppviste mer forbedret invasive kapasitet enn BGC-823-celler, som indikert med antall celler som infiltrerte gelene (figur S1.2).
4. TBGCs utstilt Cisplatin Resistance
Deretter vurderes vi følsomheten til TBGCs til standard magekreft kjemoterapeutika. Levedyktige BGC-823-celler og TBGCs ble bestemt etter 24 timers eksponering for cisplatin (0, 20, 40, 60, 80 uM) ved å måle inkorporering av MTS. Resultatene viser at TBGCs utviste bemerkelsesverdig motstand mot cisplatin, mens noen BGC-823-celler overlevde når den cisplatin-konsentrasjonen ble forhøyet til 40 um (
p
0,001) (figur 3,1). Levedyktige TBGCs kan til og med bli detektert når den cisplatin-konsentrasjonen ble forhøyet til 200 uM (data ikke vist). Vi utførte celle-apoptose analyser ved hjelp av flowcytometri for å validere cisplatin motstand. Resultatene viser at overlevelsen av TBGCs var ca 42,40%, sammenlignet med 13,80% for BGC-823 celler etter behandling med 40 mikrometer cisplatin i 24 timer (figur 3.3 til 3.4). Men når de ble behandlet med 5-FU, var det ingen signifikante forskjeller i tumor hemming mellom TBGCs og BGC-823 celler i henhold til MTS analysen (figur 3.2). Begge kreftceller demonstrert chemoresistance til 5-FU (figur 3.2).
Figur 3.1. Tjuefire timer linjeplott av cisplatin-hemming test. ** P 0,01. Figur 3.2. Tjuefire timer linjeplott av 5-FU hemming test. Figur 3.3. Strømningscytometri ble brukt til å vurdere apoptose i BGC og TBGC celler etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av cisplatin (20, 40 uM) i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V-FITC (markør for apoptose) og propidiumjodid (PI) (merket av døde celler). Figur 3.4. Bar tomt på cisplatin-indusert apoptose i BGC-823 celler og TBGCs. Stolpediagram som viser prosentdelen av apoptotiske celler i henhold til flowcytometri. ** P. 0,01 vs celler i dimetylsulfoksid (DMSO) kontrollbrønner
5. TBGCs Utstillings
In vivo
Lymph Node Tilbøyelighet
For å bestemme
in vivo
distribusjon av TBGCs, 5 × 10
5 BGC-823 celler eller TBGCs ble injisert i halevenen til BALB /c mus. To uker etter injeksjon, varians i hjelpe og cervikale lymfeknuter metastase ble iakttatt i begge grupper, som indikert ved vurdering av et fluoriserende sporstoff (figur 4.3A-F). GFP-positive celler ble funnet i hjelpe og inguinal lymfeknute i begge gruppene (figur 4.3A, B, D, E). Imidlertid GFP-positive celler ble bare vist i lungene til mus i BGC gruppe (figur 4.3C, F).
Figur 4.1. Kumulativ risiko for lymfeknuter metastase i forskjellige grupper som fikk injeksjoner halevenen. Figur 4.2. HE farging (10 uker) av organer i gruppen som fikk vene injeksjoner. Positivitet ble observert i tarmen hos begge gruppene og i lungene til de BGC grupper. Ingen åpen lever- eller nyremetastaser ble funnet. Figur 4.3. Fluorescent sporing av tumorceller i uke 2 i gruppene som fikk halen vein injeksjoner. Tumorceller ble merket med grønn fluorescens som antydet med de gule pilspisser. Kjernen var farget med DAPI (blå). Forstørrelse 100 ×. Figur 4.4. Immunohistokjemisk farging av E-cadherin og β-catenin i lymfeknutene i gruppene som fikk injeksjoner halevenen på hvert tidspunkt. Forstørrelse 200 ×. Figur 4.5. Bar plott av de relative ekspresjonsnivå av E-cadherin og β-catenin i lymfeknutene i gruppene som fikk injeksjoner halevenen på hvert tidspunkt. ** P 0,01; * P. 0,05
I uke fem, i tillegg til omfattende invasjonen i lymfeknutene, orgel infiltrasjon ble også observert. Mer lymfeknute invasjon ble observert i den gruppen TBGC enn BGC kontrollgruppen ved hvert tidspunkt (figur 4.1, Video S1). Disse lymfeknuter var fast bestemt på å være pan-CK positive (figur S2.1). Vi har også observert annerledes TBGC og BGC fordeling i de organer. TBGCs var begrenset til gastroenteriske vev, mens BGCs avgjort i lungene og tarmene (Figur 4.2A-H). I uke 5 ble intestinal metastase først observert i 3/4 mus som ble injisert med TBGCs, mens bare 25% mus viste synlige tarmmetastaser følgende BGC injeksjon (figur S2.3).
Som svulster utvikles, gjennomsnittlig antall tarm TBGC metastaser økt (5,6 ± 3,911
vs
3,5 ± 1,914 BGCs i uke 8, 6,33 ± 1,52
vs
5,6 ± 1,342 ved uke 10) (figur S4.2) . Interessant, tre av fem mus i TBGC gruppen påvist megascopic svulster i Gastrum etter 10 uker, noe som ikke ble observert i BGC gruppen. Megascopic lungemetastaser ble funnet i 3 av 4-BGC mus ved uke 8. Det ble imidlertid ikke synlig TBGC lungemetastaser observert ved uke 10 (figur 4.2A-H). Mikroskopisk undersøkelse avslørte infiltrasjon av TBGCs inn i livmorhalsen og aksillære lymfeknuter så tidlig som en uke etter halevenen injeksjon, mens BGCs krevde mer tid (3 uker) for å legge inn disse lymfeknuter (figur 4.1). Fem uker etter celleinjeksjon, ble lunge infiltrering observert i BGC-gruppen. Men ingen TBGCs ble påvist i organer inntil 10 uker etter injeksjon (figur 4.2B, F, figur S2.3).
Immunhistokjemisk farging indikerte gradvis økning av E-cadherin i lymfeknutene i TBGC gruppe , mens E-cadherin uttrykk svakt redusert i BGC gruppe (
p
0,01) (figur 4.4A-P). Forskjellene var signifikante ved 8 og 10 uker, når E-cadherin ekspresjon var mye høyere i TBGC gruppen sammenlignet med BGC-gruppen (figur 4.5). Uttrykket av β-catenin også økt med tid i TBGC gruppen, som nådde en topp på 8 uker og deretter litt redusert (figur 4.5). ** P 0,01; ** P 0,01.
