Abstract
Våre tidligere studier har vist at genetisk sletting av
Muc2
genet fører til kolorektal kreft hos mus. Den aktuelle studien viste videre at på et tidlig stadium ( 3 måneder)
Muc2
knockout mus spontant utviklet kronisk betennelse i tykktarmen og endetarmen, tilsvarende patologiske funksjoner som menneske kolitt; og ved slutten av trinn ( 3 måneder) musene viste kolorektal kreft, inkludert et unikt fenotypen til rektal prolapsed (rektal alvorlig betennelse og adenokarsinom). Dermed kan en alder av 3 måneder være sentrale punkt overgangen fra kronisk betennelse til kreft. For å bestemme mekanismene i forbindelse med malign transformasjon, gjennomførte vi miRNA fylking på colonic epitelceller fra 3 mnd
Muc2
– /- og
+ /+ mus. MikroRNA profilering viste differensial uttrykk for miRNAs (dvs. lavere eller høyere uttrykk enrichments) i
Muc2
– /- mus. 15 av dem ble validert ved kvantitativ PCR. Basert på relevans for cytokin og kreft, 4 mirnas (MIR-138, MIR-145, MIR-146a, og MIR-150) var validere og ble funnet signifikant nedregulert i menneskelig kolitt og kolorektal kreft vev. Nettverket av målene for disse mirnas ble karakterisert, og interestedly, miRNA-assosierte cytokiner ble betydelig økt i
Muc2
– /- mus. Dette er den første til å vise viktigheten av avvikende ekspresjon av mirnas i dynamisk omdanning av kronisk kolitt til kolitt-assosiert kreft. Disse funnene belyse avsløre mekanismene for kronisk kolitt malign transformasjon
Citation. Bao Y, Guo Y, Li Z, Fang W, Yang Y, Li X, et al. (2014) mikroRNA Profilering i
Muc2
Knockout Mus av kolitt-Associated Cancer Modell avslører epigenetisk Endringer under kronisk kolitt malign transformasjon. PLoS ONE 9 (6): e99132. doi: 10,1371 /journal.pone.0099132
Redaktør: Sergei Grivennikov, Fox Chase Cancer Center, USA
mottatt: 25 februar 2014; Godkjent: 11 mai 2014; Publisert: 18 juni 2014
Copyright: © 2014 Bao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskuddet fra Natural Science Foundation National of China (tilskuddet # 91229115 og 81272251), tilskudd til Innovative team of Science and Technology fra Department of Education, Henan-provinsen, Kina, og Doctor forskningsfond (# 100820 og 505011) og oppstartsfond fra Xinxiang Medical University, Kina. Arbeidet ble også støttet delvis av National College Student innovative prosjekter i Kina (# 201310472005 til XL, 201 310 472 012 til BX, og 201 310 472 016 til ZL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftsykdommen og de andre viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [1]. I likhet med andre ondartede sykdommer, genetiske faktorer bidrar mye til CRC dannelse, men bare omtrent 20% av tilfellene CRC genetisk kan tilskrives kjent historie [2] – [4]. Faktisk er de fleste av sporadisk CRC sterkt knyttet til miljøfaktorer, der de ofte mutasjoner i adenomatøs polypose coli (APC) tumor suppressor genet fører til ødeleggelse av Apc /GSK3P /Axin kompleks og aktivering av Wnt /β-catenin veien [ ,,,0],2], [5], [6] Aberrant aktivering av Wnt /β-catenin banen ikke bare fremmer proliferasjon av intestinale epitelceller, men induserer også deres rest som de beveger seg mot slutten av krypten og forhindre shedding eller apoptose av transformerte celler. Den kanoniske «genetisk vei til kolorektal kreft» har vært godt studier. De nye mekanismer for tykktarmskreft dannelsen av miljøfaktorer er assosiert med kronisk betennelse, kalt kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC) [7] – [10] Med endringene av dietter og livsstil i Kina, CRC forekomsten renteøkninger raskere enn andre kreftformer i de senere år [11], og ganske mengde av CRC tilfeller er knyttet til kronisk inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Det er akseptabelt at CAC blir etterfulgt av klinisk påvisbar IBD [8], [12], som for eksempel Crohns sykdom (CD), eller ulcerøs kolitt (UC). Epidemiologi og kliniske studier har antydet at UC øker CAC risikoen med opptil 18-20%, mens CD med opp til 8% etter 30 år med aktiv sykdom [13] – [15]. I musemodeller, enkelt injeksjon av kreftfremkallende azoxymethane (AOM) fører til flere colonic svulster, bare når kombinert med kronisk kolitt indusert av dekstran natriumsulfat (DSS), mens når betennelsen er borte det tar flere injeksjoner av AOM og lengre tid for tumordannelse [16], [17]. Disse kliniske og eksperimentelle observasjonene tydelig presisere CAC som klassisk betennelse-drevet kreft. Men i motsetning til APC /Wnt /β-catenin svei, den underliggende mekanismene kolitt-assosiert kreft, og spesielt av kolitt ondartet transformasjon, er i stor grad uklart, majorly grunn av mangel på en egnet modell for dynamisk undersøkelse.
intestinale epitel er beskyttet av et lag av mucin utskilt av slimceller mot mekaniske og kjemiske skader, potente årsaker til betennelse, og de mest tallrike utskilte tarmslimstoff blir kodet av
Muc2
-genet [18]. Tidligere studier har vist at redusert antall slimceller og redusert
Muc2
uttrykk er ofte observert i ulcerøs kolitt og kolorektal kreft [19]. Betydningen av
MUC2
i intestinal homeostase gjenspeiles ved endringer av celleproliferasjon, migrasjon og apoptose i musen tarmen ved genetisk sletting av
Muc2
genet [20], og viktigst,
Muc2
-deficiency mus (
Muc2
– /- mus) spontant utvikle små og store intestinal og rektal, svulster [20]. Mekanistiske undersøkelser har vist at tumorigenesis er assosiert med aktivering av kronisk betennelse, og er ikke forbundet med Wnt /β-catenin signalering [20]. Imidlertid betennelse økt intestinal tumorgenese i APC mutante mus ved å innføre
Muc2
mangel til musene [21], og tap av cyklinavhengig kinase inhibitor p21WAF1 forbedret tarmtumordannelse i
Muc2
– /- mus [22], Vår nåværende studie viste videre at
Muc2
mangel mus spontant utvikle kronisk kolitt i deres tidlig alder ( 3 møll), hvis histopatologi var lik ulcerøs kolitt hos pasienter. Etter 3 måneder,
Muc2
– /- mus utvikler colonic og endetarmssvulster. Derfor kan en alder av 3 måneder være nøkkelen punktet hvor kronisk kolitt utvikler seg til tykktarmskreft, dvs. kolitt ondartet transformasjon, og
Muc2
mus kan være en av de best konstruerte modeller av kolitt-assosiert kreft til dynastically studere mekanismen for malign transformasjon av kronisk kolitt
for å avsløre de molekylære mekanismene for kolitt ondartet transformasjon, vi isolert colonic epitelceller fra
Muc2
-. /- mus og gjennomført miRNA profilering. Vi fant differensial uttrykk for miRNAs på sentrale punkt malign transformasjon. Noen mirnas ble karakterisert ved menneskelig kolitt og kolorektal kreft vev. Interessant, downregulated mirnas var i samsvar med endringer i mus, og knyttet til økning av cytokiner, noe som tyder på at epigenetiske forandringer kan spille viktige roller under kolitt malign transformasjon.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse:
dyr omsorg og bruk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Xinxiang Medical University og University of Illinois i Chicago, og humane prøver innsamling og bruk ble godkjent av Institutional Review Board of Xinxiang Medical Universitet. Alle pasienter ga informert samtykke i skriftlig
Muc2
Mouse Model og patologi Karakterisering.
Som rapportert tidligere [20] – [22],
Muc2
+/- mus ble backcrossed å generere
Muc2
– /- og
Muc2
+ /+ mus, og 10 mus per gruppe ble fôret med standard gnager chow diett i 3 måneder eller 6 måneder. Ved endepunktene, ble musene avlivet, hele mage-tarmkanalen ble åpnet og vasket med kald PBS og fiksert i 10% bufret formalin. Vev ble dyppet i parafin, seksjonert og farget for histopatologi karakterisering
Muc2
Mouse Kolon epitel celler Collection, mRNA analyse, og miRNA Profilering.
Bruk av publisert protokoll av oss [23] – [25], mus colonic epitelceller ble samlet inn fra tre-måneders alderen
Muc2
+ /+ og
Muc2
– /- mus, henholdsvis. Fire mus fra hver gruppe ble anvendt. De totale RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) for cytokin mRNA analyse og miRNA rekke analyse. Kvaliteten og kvantiteten av RNA ble bestemt ved bruk Bioanalyzer og gel-elektroforese. Cytokin-mRNA-nivåer ble analysert ved hjelp av Q-RT-PCR. Primere som brukes for mus cytokinanalyse ble oppført i tabell S1.
miRNA utvalg ble utført i Genomisk Facility av University of Chicago (Chicago, Illinois). Affymetrix Genechip miRNA Arrays versjon 3.0 ble brukt for miRNA-profil. Kort fortalt ble 200 ng av total-RNA som er merket ved hjelp av FlashTag Biotin HSR Labeling Kit ifølge produsentens protokoll (Affymatrix), og omtrent 130 ul av Affymatrix hybridisering cocktail buffer (FS450-002) ble anvendt i ca. 18 timer i henhold til den protokoll (Affymatrix) . Matrisen ble deretter skannet med Affymatrix Genechip Scanner 3000. Den rå data ble behandlet med Expression Console 1.2.0.20, dataverdi ble definert ved hjelp Logg Expression Signal – RMA-DABG. De mirnas med en fold endring 2.0 eller 0,5 og en t-test verdi 0,01 ble valgt som forskjellig uttrykt miRNAs. Den detaljerte eksperimentell design, detaljert protokoll og dataanalyse kan nås på Gene Expression Omnibus (GEO) (Access # GSE56577)
Mus miRNA Validering bruker kvantitativ revers transkripsjon Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR).
Basert på grader av endret miRNA nivåer fra miRNA rekke profil, seks av de mest oppregulert og ni av de mest downregulated mirnas ble validert ved hjelp QRT-PCR. De revers transkripsjon (RT) primere og termin primere og prober som brukes til miRNA validering ble oppført i tabell S2. Den universelle Taqman sonde og universell revers primer for QRT-PCR ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies (IDT) (tabell S2).
Total RNA fra mus colonic epitel ble polyadenylert med Poly (A) Polymerase Daling Kit (Epicentre ). I korthet ble 10 ul av reaksjons inkludert 1 pg RNA, 1 pl 10x reaksjonsbuffer, 1 pl 10 mM ATP og 1 enhet av Poly (A) polymerase ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter, etterfulgt av enzyminaktivering ved 65 ° C i 5 minutter og deretter satt på is. Etter polyadenylering, ble revers transkripsjon utført i en 10 pl reaksjon inneholdende 1 pl av polyadenylerings-reaksjonsproduktet, en ul av 0,5 uM RT primer, 0,5 pl 10 mM dNTP, 1 ul av AMV 10x reaksjonsbuffer, og 50 enheter av AMV høy ytelse revers transkriptase (Promega, Madison, WI). Reaksjonen ble inkubert ved 42 ° C i 60 min, og deretter avsluttet ved oppvarming ved 70 ° C i 10 min. RT-produkter ble amplifisert og detektert ved hjelp av en S-Poly (T) -metoden, som rapportert av oss [26]. En 20 ul PCR reaksjon inneholder 2 mL av RT produkter (4 ganger fortynning), 10 mL av 2x GoTaq® Hot Start-Fargeløs Master Mix (Promega, Madison, WI), 0,2 mikrometer frem primer, 0,2 mikrometer universell revers primer, og 0,25 iM universell Taqman sonde. PCR-reaksjonen ble utført ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10 s og 60 ° C i 30 sek. QRT-PCR resultatene ble analysert som rapportert av oss [27] – [29]. Den snoRNA202 ble brukt som intern kontroll
humane prøver Collection.
Seksten paires på menneske kolorektal kreft vev, kolitt vev, og deres tilstøtende normal kolon slimhinne, ble samlet inn fra november 2012 til oktober 2013, fra First Affiliated Hospital og Affiliated Xinxiang Central Hospital, Xinxiang Medical University. Del av prøvene ble sneppes inn i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C for RNA-ekstraksjon og for QRT-PCR-analyse. Alle pasienter ga informert samtykke i skriftlig. Prøven innsamling og bruk ble godkjent av Institutional Review Board of Xinxiang Medical University.
RNA ekstraksjon og QRT-PCR for mRNA-analyse for humane prøver var lik som beskrevet ovenfor for analysen i muse colonic epitelceller. De primere og prober som brukes for miRNA analyse ble oppført Tabell S2. . SNORD 44 ble brukt som intern kontroll
miRNA Targets Identifikasjon, biologiske funksjoner Kategorisering og Nettverksanalyse:
For å identifisere målene for de mirnas, brukte vi online programvare – David (http: //david.abcc.ncifcrf.gov/) og en anslått liste over bevarte miRNA målgener hentet fra targetscan (https://www.targetscan.org/), Starbase (https://starbase.sysu.edu.cn/) , Tarbase (https://microrna.gr/tarbase/), og miRbase (https://mirbase.org/index.shtml). De biologiske funksjoner av mirnas ble kategorisert av Gene Oncology (GO). Potente mål nettverk og signalering ble foreslått å bruke KEGG (https://www.kegg.jp) og Ensembl (https://www.ensembl.org) web-verktøy.
Resultater
Histopatologi av
Muc2
musemodell for kolitt-assosiert kreft:
Tidligere arbeid har vist at målrettet genet knockout av
Muc2
genet forårsaket tumordannelse i hele fordøyelseskanalen, inkludert tolvfingertarmen, tykktarmen og endetarmen [20], og
Muc2
– /- mus er mottakelige for DSS-indusert inflammatorisk tarm sykdommer [30]. I denne studien fant vi at på 3 måneder eller tidligere,
Muc2
– /- mus spontant utviklet kronisk betennelse i tykktarmen og endetarmen, følger med noen svulster i disse områdene (figur 1). Som vist i figur 1A, kolon mukosa manglet av slimceller og oppviste egenskapene til ulcerøs kolitt, slik som overfladisk erosjon og intensive infiltrasjoner av inflammatoriske celler i hele mucosa, submucosa og muskellaget i tykktarmen, som var den samme som observert hos human ulcerøs kolitt. Den kroniske kolitt ble ledsaget av et adenom. I en alder av 6 måneder,
Muc2
– /- mus utviklet svulster i tykktarm og endetarm, som rapportert [20], men alvorlig betennelse ble likevel observert i intra-svulster og ekstra-svulster (Figur 1B). En unik fenotype var at
Muc2
– /- mus utviklet endetarms prolapses (figur 1C) som aldri har vært rapportert tidligere. Histopathologically, prolaps var adenokarsinom med alvorlig betennelse på rectums (figur 1D), viser overfladisk erosjon, betennelsesceller infiltrasjon og kreftcelle invasjon. I tillegg ble graden av inflammatorisk celleinfiltrasjon i forbindelse med alvorlighetsgraden av rektal prolase, men var ikke assosiert med kreftcelleinvasjon og differensiering i endetarmen (data ikke vist).
A, kolitt og en adenom i muse kolon i en alder av 3 måneder. Grå piler pekte alvorlig infiltrasjon av betennelsesceller, hvite pilen pekte en adenom. B, colonic adenokarsinom med inflammatorisk celleinfiltrasjon i en alder av 6 måneder. C, rektal prolapsed på 6 måneder. . D, Histopatologi av rektal prolaps, viser kreftcelle invasjon og alvorlig betennelse i endetarmen (6 måneders alder)
miRNA profilering avslørt Differential Uttrykk av miRNA i
Muc2
– /-
Mus
Nyere studier har antydet de viktige rollene mirnas i kreftutvikling. For å undersøke om avvikende uttrykk for miRNAs er involvert i kolitt ondartet transformasjon, isolert vi colonic epitelceller fra tre måneder gamle mus (4
Muc2
– /- mus og 4
Muc2
+ /+ mus) og gjennomført miRNA profilering. Det er kjent at samspillet mellom stromale og epiteliale celler spiller viktig rolle i å drive kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC).
Muc2
ble overuttrykt i colonic epitelceller, og genetisk mangel av dette gen er tilstrekkelig til å forårsake kolitt og kolorektal kreft, utøver viktigheten av å
Muc2
i utviklingen av kolitt og CAC. For å bestemme roller abnormt uttrykt mirnas resulterte fra
Muc2
fravær i å initiere kolitt og tilrettelegging tykktarmskreft transformasjon, brukte vi colonic epitelceller i stedet for stromale celler eller hele tykktarmen vev for miRNA array. MiRNA profilering analyse viste differensial nivåer av miRNAs, blant dem 20 mirnas signifikant nedregulert og 71 mirnas ble signifikant oppregulert (tabell 1) i
Muc2
– /- mus, sammenlignet med
Muc2
+ /+ mus (endring fold 2 eller 0,5; T 0,01, p-verdi 0,05, q-verdi 0,05). Som vist i Tabell S3 og S4 tabell, de fleste av mirnas har blitt rapportert til å regulere sine mål og spiller avgjørende roller i kreft initiering, progresjon og metastase, i forskjellige vev og celler. Mens, biologiske funksjoner av noen mirnas er ikke klart, og garanterer videre etterforskning
Mus mirnas Validering av QRT-PCR.
For å evaluere nøyaktigheten av den profilerte mirnas endring i mus colonic epitelceller, valgte vi 15 mest relevante mirnas for godkjenning ved QRT-PCR. De 6 oppregulert mirnas (MMU-MIR-5132-5p, MMU-MIR-3104-5p, MMU-MIR-669c-5p, MMU-MIR-705, MMU-MIR-760-3p, MMU-MIR-1962) og de 9 downregulated mirnas (nm-MIR-146a, nm-MIR-138, MMU-MIR-5123, MMU-MIR-196b, MMU-MIR-5099, nm-MIR-150, MMU-MIR-145, MMU-MIR -27a, MMU-MIR-23a) valgt for validering ble også basert på deres mål gener spådd, hvis funksjoner er vel relevant for betennelse og kreft. Som vist i figur 2, endringer av miRNA analysert ved QRT-PCR var i overensstemmelse med endringene av profilerte miRNA rekke analyse.
Fire mus ved alder av 3 måneder fra hver genotype gruppe ble avlivet og colonic epitelceller ble isolert for RNA-ekstraksjon og QRT-PCR-analyse. Kolonnene sto for Mean +/- SD.
Aberrant Expression of miRNAs i Human kolitt, tykktarms Tumor og tilknytning normal slimhinne
For å avgjøre om de abnorme uttrykt mirnas har klinisk betydning, vi valgte 4 mirnas for analyse i menneskelige kolorektal kreft og kolitt vev. Som vist i figur 3, i generelle uttrykket nivået av MIR-138, MIR-145, MIR-146a og MIR-150 ble nedregulert med ca 3,37, 3,39, 2,56 og 4,99 ganger i kolorektal kreft enn de som er i den matchende tilstøtende normalt slimhinnen (
p
0,0001). Blant dem, viste alle de 16 kolorektal kreft downregulated MIR-138 og MIR-150 nivåer (Tall 3A og 3D), og 15 av de 16 kolorektal kreft viste lavere MIR-145 og MIR-146a uttrykk nivåer enn normalt kontroll (Tall 3B og 3C). Bare én pasient (prøve 6) viste oppregulering av MIR-145, men oppregulering var ikke signifikant (figur 3B, p 0,05). Interessant, nedregulering av disse mirnas ble også observert i humane pasienter med kronisk kolitt vev (figurene 4, p 0,0001, sammenlignet med den normale slimhinne). Selv om observasjonene ble hentet fra små størrelser prøver, trender av betydelig nedregulering av miRNAs (MIR-138, 145, 146a og MIR-150) sterkt antydet deres kliniske betydningen av kobling til kronisk kolitt og kolitt-assosiert tykktarmskreft, indirekte indikerer deres potensielle biologiske funksjoner å involvere i kolitt malign transformasjon. Faktisk er funksjonene til disse mirnas på svulst undertrykkelse er under etterforskning ved hjelp av manipulert cellekultur system
in vitro Hotell og tumorbærende nakne mus
in vivo
.
En , MIR-138 var signifikant nedregulert i kolorektal kreft. B, MIR-145 var signifikant nedregulert i kolorektal kreft. C, MIR-146a var signifikant nedregulert i kolorektal kreft. D, MIR-150 var signifikant nedregulert i kolorektal kreft. Hver kolonne sto for en pasient, totalt 16 pasienter. Den Samlet sto for gjennomsnittet av de mirnas hos alle pasientene. (***
p
0,0001, sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne).
A, MIR-138 var signifikant nedregulert i kolitt. B, MIR-145 var signifikant nedregulert i kolitt. C, MIR-146a var signifikant nedregulert i kolitt. D, MIR-150 var signifikant nedregulert i kolitt. Hver kolonne sto for en pasient, totalt 6 pasienter. Den Samlet sto for gjennomsnittet av de mirnas hos alle pasientene. (***
p
0,0001, sammenlignet med tilstøtende normal slimhinne)
miRNA Target Network Karakterisering:.
Siden de endrede mirnas hatt stor betydning i
Muc2
– /- mus og menneske kolitt malign transformasjon, og den valgte miRNA viste nedregulering i kolitt og kolorektal kreft, neste belyst vi om det var noen felles mål for disse miRNAs. Dessverre ble det ingen felles inflammation- og kreft-assosiert mål for alle de 4 mirnas (MIR-138, 145, 146a og MIR-150) identifisert ved hjelp av miRNA mål prediksjon verktøy. Men vi fant noen vanlige mål av alle tre eller to av de 4 miRNAs. Som vist i figur 5 og tabell 2, var det 21, 13 og 25 felles mål mellom MIR-138 og MIR-145, MIR-146a og MIR-150 henholdsvis; det var 16 og 15 felles mellom MIR-145 og MIR-146a og MIR-150, henholdsvis; og det var 7 felles mål mellom MIR-146a og MIR-150. Vær oppmerksom på at CCT3 og PAPPA var de felles mål for MIR-138, MIR-146a og MIR-150, og ZHX2 var det felles mål for MIR-138, MIR-145 og MIR-150. Interessant, de fleste av disse målene er onkogener. GO sikt annotering viste at alle målene er involvert i cellulær fysiologisk prosess og metabolisme, og regulering av cellulær prosess og regulering av fysiologiske prosess er de mest betydelig anriket GO betingelser. Således kan en hvilken som helst feilregulering av disse mirnas og deres mål være tilstrekkelig til å bevirke initiering av inflammasjon og kronisk inflammasjon ondartet transformasjon, studier på noen felles mål for to eller flere mirnas i karsinogenese er mer betydningsfull enn noen mål i et enkelt miRNA.
Cytokiner i
Muc2
– /-
Mouse Kolon Epitelceller var oppregulert:
for å validere nøyaktigheten av analysen av miRNA og deres tilknytning til cytokin mRNA, er senere ofte sett i kolitt-assosiert kreft, fastslår vi at endringer av cytokin i mus kolon. Som vist i figur 6, sammenlignet med
Muc2
+ /+ mus,
Muc2
– /- mus viste betydelig oppregulering av cytokiner (for eksempel IL-6, Cox2, TNF-a og IL-1β, etc) i colonic epitelceller fra normal vises tykktarmsslimhinnen (p. 0,01)
i forhold til
Muc2
+ /+ mus,
Muc2
– /- mus viste signifikant oppregulering av cytokiner (** p 0,01, sammenlignet med
Muc2
+ /+ mus). Fire mus ved alder av 3 måneder fra hver genotype gruppe ble avlivet og colonic epithelial celler ble isolert for RNA-ekstraksjon og QRT-PCR-analyse. Kolonnene sto for Mean +/- SD.
Diskusjoner
Den aktuelle studien preget en kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC) modell av
Muc2
– /- mus, og gir direkte bevis for at kronisk betennelse i tykktarm og endetarm kan malignantly forvandlet, og avslørende potente mekanismer, som var at avvikende miRNA uttrykket i colonic epitelceller var involvert i, og kan spille viktige roller i løpet av malign transformasjon av kronisk kolitt ved å forstyrre målgener.
Mange evidensbaserte studier har vist at kronisk kolitt er en av de viktigste årsakene til tykktarmskreft, men de underliggende mekanismene er ikke klart, en av de viktigste årsakene er mangel på spontan kolitt og kolitt-assosiert tykktarmskreft modell. Foreløpig en rekke genmanipulerte dyremodeller er tilgjengelige og er svært nyttig for bedre forståelse av de molekylære mekanismene bak patogenesen av CAC [31], men patologiske trekk ved disse modellene er ikke dynamisk karakterisert. Denne studien karakteriserte
Muc2
musemodell.
Muc2
– /- mus spontant utvikle kronisk betennelse i tykktarmen og endetarmen på et tidlig stadium ( 3 måneder), og etter 3 måneder, kronisk betennelse fremgangen til tykktarmskreft. Viktigst, de patologiske trekk ved kronisk betennelse i tykktarmen og endetarmen var lik som menneskelig ulcerøs kolitt, og de abnorme uttrykt mirnas involvert i
Muc2
– /- mus ble observert kolitt malign transformasjon i menneskehetens kolitt og kolorektal kreft vev. En annen unik funksjon var endetarms prolapses – endetarmskreft med alvorlig betennelse. Derfor
Muc2
– /- mus kan være det passende gnager-modell med CAC, og kan brukes som en av de beste verktøy for å belyse årsaken til CAC og de underliggende molekylære mekanismer.
Muc2
– /-. Mus kan også brukes som en musemodell for chemoprevention og terapi for kolitt-assosiert tykktarmskreft
mirnas har 19-22 nukleotider, er en roman klasse av små ikke-kodende RNA som undertrykker oversettelse og stabilitet messenger RNA (mRNA) ved å binde seg til målet mRNA «3»-uoversatt regioner (3′-UTR) [32], mirnas har viktige biologiske og pathophysical funksjonene involverer i utvikling, celleproliferasjon, differensiering, apoptose, betennelse og stressrespons [33] – [35]. Økende bevis har antydet at mirnas blir nedregulert eller oppregulert i kreftformer, som virker som tumor-suppressorer eller onkogener [33], [35], [36], hvor mirnas spiller avgjørende roller i tumorgenese, differensiering, progresjon (f.eks migrasjon, invasjon, angiogenese og metastase) [35] – [37], først og fremst ved å interferere med ekspresjonen av målgener. Ved hjelp av en miRNA array, har vi profilert differensial uttrykk for miRNAs i colonic epitelceller fra
Muc2
– /- mus, og disse mirnas enten oppregulert som onkogener eller nedregulert som tumor suppressors ved å målrette genene på kategorier av metabolisme, cellesyklus, differensiering, celledød, replikering DNA, homeostase, signaltransduksjon, respons på stimulering, og betennelser, etc. Blant de markert endret mirnas, de downregulated mirnas, MIR-138, 145, 146a og 150 ble validert i både mus og menneskelig vev, spesielt i menneskelig kolitt og kolorektal kreft vev, noe som tyder undertrykke roller MIR-138, 145, 146a og 150 i kolitt ondartet overgang via samspill med cytokiner og betennelsesfaktorer.
Tidligere studier har vist tumor suppressor roller MIR-138 i kreft biologi. MIR-138 hemmet kreftcellevekst og tumordannelse i ikke-småcellet lungekreft og nasofaryngeal kreft ved å målrette 3-phosphoinositide-avhengig protein kinase-1 (PDK1) og CCND1 [38] – [40]. I tykk- og eggstokkreft, MIR-138 trykt kreftcellemigrasjon og metastasering gjennom forstyrret TWIST2, SOX4 og HIF1-a [39], [41]. De fleste nyere studier har rapportert at downregulated MIR-138 vedvarende inflammatoriske faktor NF-kB-aktivering og fremmet spiserørskreft progresjon [42], og som MIR-138 respons på proinflammatoriske cytokiner er avhengig av stabilisering av HIF1-α i primære, humane mikrovaskulære endotelceller [43]. MIR-145 er også en tumor suppressor genet. miR145 kunne målrette SOX9 /ADAM17 akse og hemme tumor initiere celler og IL-6-medierte parakrine effekter i hode og nakke kreft [44]. Videre induserer mikroRNA-145 apoptose med induksjon av tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) ekspresjon, målrettede onkogene socs7 og regulert interferon-β induksjon gjennom STAT3 nukleær translokasjon i blærecancerceller [45]. Nyere studier har rapportert at TRAIL undertrykker kjemokin (CXC motiv) reseptor 4 (CXCR4) -mediert human brystcancer cellemigrering ved opp-regulering MIR-146a ekspresjon via NF-kB signalering [46], og som MIR-146 regulerer epigenetisk regulator UHRF1 og modulerer magekreft invasjon og metastasering [47], viser de viktige rollene MIR-146 i hemme kreft metastase ved å forstyrre chemokin og epigenetisk regulator. Som i Mir-150, har ganske mange rapporter vist sin svulst hemmende funksjon [48] – [51]. Mens at MIR-150 samhandler med cytokiner i lymfocytt differensiering og i betennelsen har blitt studert. For eksempel, i cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), IL-2R og inflammatoriske signaler virke gjennom dicer og mirnas å styre den cytolytiske program og CTL differensiering, hvori MIR-139 og MIR-150 blir nedregulert ved betennelse i CTL, og speil 150 regulerer ekspresjon av IL-2-reseptor α-kjede (CD25) [52]. I tillegg er IFN-γ produksjon betydelig økt i de MIR-150 knockout mus [53]. Tilbake til våre funn, som var, cytokiner ble betydelig økt (figur 6) og MIR-138, 145, 146a og MIR-150 ble betydelig redusert i
Muc2
– /- mus tykktarm og menneskelig kolitt og tykktarmskreft, som omfatter med de publiserte observasjoner, sterkt støtte vår hypotese om at de cytokin-forbundet mirnas, MIR-138, 145, 146a og MIR-150, spiller viktige roller i kronisk kolitt malign transformasjon gjennom forstyrrer cytokiner og betennelsesfaktorer. Imidlertid lignende som endringer av cytokiner som følge av kolitt hos mus tykktarm, endringer av mirnas kan også være en konsekvens av kronisk kolitt og CAC i humane tykktarmsvev. Det kan være mulig, men de foreløpige dataene fra våre pågående funksjonelle studier ved hjelp av manipulerte cellekultursystemer og in vivo naken mus modell har vist individ eller synergistical potensialet i disse miRNA (Bao og Yang, upubliserte data), som bekrefter krefthemmende funksjoner av disse miRNAs . I tillegg er potente ressursene til endrede mirnas i humant kolitt og CRC vev er ikke klar, og trenger videre undersøkelser, de restults generert fra som kan klargjøre arbeidsfunksjonene bevirke eller effekten av disse mirnas i utviklingen av kolitt og tykktarmskreft.
