Abstract
Vårt tidligere arbeid identifisert en mellombindingssete for taxaner i microtubule nanopore. Målet med denne studien var å teste derivater av paclitaxel utformet for å binde til dette mellomliggende området forskjellig avhengig av isotypen av β-tubulin. Siden p-tubulin isotypes har vev-avhengige uttrykk-spesifikt, er svært rik på aggressive svulster og mye mindre vanlig i normale den SIII isotypen vev-dette er ventet å føre til tubulin målrettede legemidler som er mer effektive og har mindre bivirkninger. Syv derivater av paclitaxel ble utformet og fire av disse var mottagelig for syntese i tilstrekkelig renhet og utbytte for videre testing i brystkreft modell cellelinjer. Ingen av derivatene studert var overlegne i forhold til tiden anvendte taxaner imidlertid datasimuleringer gitt innsikt i aktivitet av derivatene. Våre resultater tyder på at ingen binding til det mellomliggende bindingssetet eller den endelige bindingsstedet er tilstrekkelig til å forklare virksomheten til de avledede taxaner studert. Disse funnene understreker behovet for å iterativt forbedre utformingen av taxaner basert på deres aktivitet i modellsystemer. Kunnskap på evnen av konstruerte narkotika for å binde seg til mål og skape aktivitet på en forutsigbar måte er et skritt i retning av å tilpasse behandlinger
Citation. St. George M, Ayoub AT, Banerjee A, Churchill CDM, Winter P, Klobukowski M, et al. (2015) Prosjektering og testing av nye Taxaner å sondere svært komplekse mekanismer som Taxaner Bind til mikrotubuli og Årsak Cytotoksisitet til kreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0129168. doi: 10,1371 /journal.pone.0129168
Academic Redaktør: Shian-Ying Sung, Taipei Medical University, TAIWAN
mottatt: 04.02.2015; Godkjent: 05.05.2015; Publisert: 08.06.2015
Copyright: © 2015 St. George et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Finansiert av den kanadiske Breast Cancer Foundation stipend tildelt JAT, antall: RES0010014. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de taxaner, inkludert paclitaxel og docetaxel, Target tubulin, den subenheten protein av mikrotubuli, og binder seg til et godt karakterisert området på β-tubulin [1]. Mekanismer for binding og handling, men er meget komplisert. I motsetning til andre anti-tubulin narkotika, de taxaner spesifikt mot den intakte microtubule og deres bindingssetet er i mikrotubulidynamikk lumen [2]. Tidligere arbeid av Freedman et al. [2] kartlagt nanopores langs mikrotubuli overflaten gjennom hvilken taxaner må passere for å nå bindingssetet. En bestemt område i nanopore ble identifisert som en mellom taxan bindingssete. En annen sak er at det er flere isotypes av β-tubulin og at disse varierer både i sin affinitet for taxaner og deres subcellulære roller og steder [3]. Paclitaxel synes å utøve sin største virkning på βII isotypen [4], som også er den viktigste β-tubulin isotype i nevroner [3], eventuelt regnskap for nevropati forbundet med taxaner. Den SIII isotype, noe som er meget rikt på aggressive tumorer og mye mindre vanlig i normale vev, ville synes å være et godt alternativ target [5,6]. Vårt mål var å rasjonelt designe og teste ny taxanderivater som ville binde til den mellomliggende bindingssetet med differensial affinitet avhengig av β-tubulin isotype uttrykt i cellene.
Taxaner er blant de mest aktive antitumormidler i behandlingen av forskjellige typer kreft, spesielt brystkreft, eggstokk og lungekreft [7,8]. Motstand mot taxaner er et problem for vellykket kjemoterapi og potensielt kan oppstå fra minst tre forskjellige mekanismer. For det første er den klassiske mekanisme som oppstår ved virkningen av P-glykoprotein (P-gp, kodet for av
MDR1
genet), som i det vesentlige pumper stoffer ut av kreftceller [9]. Strukturelt ulike taxaner kunne i prinsippet ha ulike tilbøyeligheter til virkningen av P-gp. For det andre foreligger β-tubulin, målet på taxaner, som tallrike isotyper som avviker i aminosyresekvens og kodet av forskjellige gener [3]. En av taxaner, paclitaxel, har sin sterkeste effekt på βII isotypen [4]. Siden βII er overuttrykt i mange tumorer [10] dette er ikke overraskende, er imidlertid βII også en viktig komponent i nervesystemet [5], noe som kan forklare den nevrotoksisitet av taxaner. Den SIII isotype ville være et bedre mål siden det skjer i stor grad i nerveceller, men på langt lavere nivåer enn βII, mens dens uttrykk er svært vanlig i aggressive og metastatisk kreft [6]. For det tredje, bindingen av taxaner til mikrotubuli er svært komplekse, og medikamentet har til å passere fra det ytre miljøet til bindingssetet i lumen (indre) av mikrotubuli [11] for å tilveiebringe den katalytiske sekvens av hendelser som fører til polymerisering eller depolymerization. Dette betyr at taksanet har første til å binde til et mellomliggende område på overflaten av mikrotubuli, og deretter gjøre sin vei inn. Dette mellom nettstedet skiller seg også blant de isotyper. Stoffet som er beskrevet her ble utviklet og testet både
in vitro Hotell og
i silico
i et forsøk på å løse alle de tre ovennevnte spørsmålene.
De kjemiske strukturer av paclitaxel og docetaxel er vist i figur 1. Den andre generasjons semi-syntetisk stoff docetaxel forskjellig på to stillinger fra paclitaxel. Substitusjonen av acetatet ester ved C-10-posisjon med en hydroksylgruppe gjør docetaxel mer vannløselige og biotilgjengelig enn paklitaxel [12,13], og som et resultat av docetaxel er favorisert av de to forbindelser for bruk i kliniske anvendelser. Mange tredje generasjons medikamenter blir utviklet for å forbedre foreldre forbindelser, med mål om å forbedre vannløselighet, tumor permeabilitet, og mobilnettet oppbevaring, og dermed resulterer i bedre resultater og lengre overlevelsestid for pasientene [14].
Taxaner spesifikt målrette β-tubulin subenhet av α /β-tubulin heterodimer [15,16]. Plasseringen av bindingssetet er funnet på lumen av den hule mikrotubuli struktur. Gitt at mikrotubuli er sammensatt av repeterende globular proteiner, blir mellomrommene (nanopores) lokalisert langs lengden av mikrotubuli mellom tilstøtende protofilaments [2]. Det er gjennom disse nanopores som taxaner har vist seg å flytte og få tilgang til bindingssetet på lumen [11,17]. Når det er bundet til den endelige bindingssetet en konformasjonell forandring finner sted, karakterisert ved at et motiv av β-tubulin kjent som M-sløyfen er stabilisert, hindrer demontering av mikrotubuli [16]. Taxaner binde i et 1: 1 forhold med heterodimerer langs lengden av mikrotubuli [18]. Selv om taxaner kan potensielt være bundet til hver heterodimer i en microtubule struktur, er bare en taxan molekyl som kreves for å stabilisere hundrevis av tubulin heterodimerer [18,19].
Både α-tubulin og β-tubulin er funnet i flere isotyper uttrykt av ulike gener [20]. Det er minst åtte humane p-tubulin isotyper, og ekspresjonen av disse isotyper er blitt observert til å være forskjellig i normalt vev og tumorprøver [21]. Klasse III β-tubulin (SIII) spesielt har blitt observert å være overuttrykt i mange former for kreft, spesielt multiresistent cancer [6], mens βI er konstitutivt uttrykt, og βII er sterkt uttrykt i hjernevev [21]. Ut fra hensynet til strukturen av mikrotubuler, den mellomliggende bindingssetet i nanopore, og sekvensen variasjoner mellom p-tubulin isotyper, hypotese vi at taksaner konstruert for å samvirke differensielt med tubulins vil utøve biologiske aktiviteter påvirkes av steriske faktorer og /eller affinitetene konstruerte delene til bindingsseter, relative overflod av tubulin isoformer, hindringer fra lipidbilagene (relative løselighet) og gratis energier av forening eller dissosiasjon [2]. De spesifikke målene adressert i denne studien er:
For å undersøke hydrogenbindinger mellom C-7 hydroksyl av taxaner med Ser275 i
α
jeg og
β
II, deres relative interaksjoner med den nanopore, og den resulterende spredning av taxaner til bindingsstedet.
for å undersøke hydrogenbindinger mellom konservert Ser278 i tubulin isotypes (
β
jeg,
β
II og
β
III) med varierende sidekjeder konstruert ved C-10 av taxaner, deres relative interaksjoner med nanopore og den resulterende spredning av taxaner til bindingsstedet.
den underliggende forutsetningen for den første målet er basert på beregnings modellering, som fant at i SIII tubulin, som har alanin i stedet for serin i posisjon 275, er ute av stand til å danne en hydrogenbinding med den C-7-hydroksyl i paclitaxel, som i sin tur svekker interaksjonen av paclitaxel med nanopore hemmer diffusjon av paclitaxel til den mellomliggende bindingssete, og resulterer i en effektiv tap av paclitaxel aktivitet i mikrotubuli som inneholder SIII tubulin [2].
testingen av den første objektiv krever syntesen av paclitaxel-derivater med C-7-hydroksylgruppen erstattes med en ikke-polar funksjonell gruppe (Tx-A og TX-B, figur 1) eller fluor (Tx-C, figur 1). Vi forventet å se redusert fremme polymerisasjon av paclitaxel for mikrotubuli består av SIII isotype. Når enten Tx-A eller Tx-B er testet derimot, forventer vi å se at markedsføringen av polymerisasjon er mindre berørt av β-tubulin isotype; med andre ord bør effektene av Tx-A eller Tx-B være ufølsomme (eller i det minste mindre følsom) til den β-tubulin isotype. Tx-C bør ha en mellomliggende aktivitet, på grunn av den lavere energien forbundet med hydrogenbinding til fluoratomet (3 kcal /mol i forhold til 5 kcal /mol). Vi var i stand til å syntetisere forbindelser Tx-A og Tx-C, og disse ble testet med
in vitro
Polymerisasjon analyser eller med cellelinje modeller for cytotoksisk aktivitet.
Forutsetningen for andre Målet er at et gap på mellom 4 og 9 å må spredte å få tilgang Ser278, og dermed en sidekjede enhet kunne hjelpe bro dette gapet. Hydrogenbinding mellom paclitaxel og Ser278 er spådd å bevirke stabilisering av taksan interaksjonen ved nanopore, noe som resulterer i raskere bevegelse av stoffet til bindingssetet inne i microtubule, forsterket mikrotubulus polymeriseringen, og økt cytotoksisitet. Testingen av den andre målet krever syntese av flere modifikasjoner ved C-10 stillingen av paclitaxel. Vi har utformet taxaner som har forskjellige kjedelengder på C-10-stilling enten ved hjelp av en guanidinium (forbindelser Tx-E og Tx-G, figur 1) eller et karboksylat (forbindelser Tx-D og Tx-F, figur 1) funksjonell gruppe. Disse forbindelser er forventet å være mer aktive enn paklitaxel. Vi var i stand til å syntetisere forbindelser Tx-D og Tx-F, og disse ble testet med
in vitro
Polymerisasjon analyser eller med cellelinje modeller for cytotoksisk aktivitet.
Materialer og metoder
Kjemisk syntese
Vi i utgangspunktet kjøpt forbindelser Tx-A, TX-C, TX-D og Tx-F (blant de
i silico
utformet forbindelser Tx-A gjennom Tx-G , fig 1) på grunn av deres relativt enkle syntese i tilstrekkelig utbytte og renhet i forhold til å teste de foreslåtte formål. Identiteten av forbindelsene ble bestemt ved kjernemagnetisk resonans (NMR), og renheten ved tynnsjiktkromatografi (TLC); Forbindelsene Tx-A, TX-C Tx-D og Tx-F var 88%, 94%, 94% og 96% ren, henholdsvis, med utbytter på 6%, 10%, 3,6% og 3,3%, respektivt. Alle forbindelsene ble tilpasset syntetisert gjennom kontrakt tjenesteleverandør Helios Biotech Ltd., Edmonton, Alberta, Canada.
Cell Kultur
Brystkreft cellelinjer SK-BR-3 [22], MDA-MB -231 [23], og T-47D [24] ble vennlig levert av Dr. Ing Swie goping (University of Alberta, Canada). Disse er representative brystkreftcellelinjer som gjenspeiler den molekylære heterogenitet observert i tumorer i et klinisk miljø. Den valgte cellelinjer hjelpemiddel i generalizability av funn og bidra til å utelukke en direkte påvirkning av genotype-fenotype av en cellelinje på bindingen og cytotoksiske potensialet av paclitaxel og dets analoger. Videre er de valgte brystkreftcellelinjer er tidligere blitt rapportert å utvise varierende grader av paclitaxel motstand [25], og vår interesse var å gjenskape disse funnene og å avhøre hvis indre motstand hemmer de struktur-aktivitetsforhold i taxan-analoger som er beskrevet i studie mål. Brystkreftsvulster er karakterisert med hensyn til sin ekspresjon av forskjellige celleoverflatereseptorer som HER2 (human epidermal vekstfaktor-reseptor 2), østrogenreseptor (ER) og progesteronreseptoren (PR), som er involvert i cellesignalisering og cellulær proliferasjon.
SK-BR-3 cellelinje er HER2
+, eR
– og PR
-.
MDA-MB-231 cellelinje ikke uttrykke eller har svært lav uttrykk for reseptorene (HER, eR eller PR) og kalles trippel negativ. Pasienter med trippel negativ reseptor status gjennomgå behandlinger med cytotoksiske behandlinger som paclitaxel eller docetaxel
T-47D cellelinje er ER
+ men HER2
. -. Svulster som ER
+ og HER2
– (om PR
+ eller PR
-) kalles luminal A svulster
Prognosen er best for luminal A. og verst for trippel negative; HER2
+ tumorer (Her2
+ og ER
-) har en middels prognose [26]
Et annet sett av ikke-brystkreftcellelinjer ble også brukt til å vurdere det generelle. funn med hensyn til paclitaxel og dets analoger, bortsett fra at disse cellelinjer er godt karakterisert for P-glykoprotein (P-gp) ekspresjon, og er klassifisert som enten stoffet sensitive eller resistente fenotyper. MES-SA (P-gp negativ, villtype) [27] og MES-SA /DX5 (P-gp positive, narkotika resistent) [28] uterussarkom cellelinjer, og K-562 (P-gp negative, villtype ) [29] og K-562 /R7 (P-gp positive, resistent) [30] kronisk myelogen leukemi cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Charles Dumontet (Universitetet i Lyon, Frankrike). Dette panelet ble valgt til å bestemme om de endringene som er gjort i taxan strukturer hatt en effekt på underlaget spesifisitet for multiresistens efflukspumpen, P-gp. MES-SA og MES-SA /DX5 er heftende celler, mens K-562 og K-562 /R7 er suspensjonsceller. Det har tidligere blitt rapportert at MES-SA /DX5 og K-562 /R7 cellelinjer overuttrykke P-gp protein og viser kryssresistens overfor en rekke kjemoterapeutiske forbindelser [28,31].
Alle celle linjene~~POS=HEADCOMP ble opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C, 5% CO
2 og i en fuktig miljø. Adherente celler ble opprettholdt i media inntil ~ 90% sammenflytende. Cellene ble trypsinisert i en oppløsning av Trypsin-EDTA (Gibco, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) ved en sluttkonsentrasjon på 0,25%.
mikrotubuli-polymerisering Assay
bovin hjerne tubulin fremstillingen og rensing av αβII og αβIII dimerer (α-tubulin var en blanding av isotyper, bare β-tubulin ble renset til βII og henholdsvis SIII,) ble utført som tidligere beskrevet [32]. Mikrotubul polymeriseringsbetingelser analyser ble utført som tidligere beskrevet [33]. Aliquoter (200 ul) av isotypically ren bovin hjerne tubulin (1,4 mg /ml) i tubulin-buffer (100 mM MES-Na, 1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgCl
2, 1 mM GTP, pH 6,4) ble inkubert i nærvær av legemidler (1-16 um) ved 37 ° C i 15 min i en modell DU spektrofotometer (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, iN, USA) og turbiditeten av prøvene ble overvåket ved 350 nm hvert 8 s. Rådata ble ervervet og behandlet ved hjelp av KINLOTUS programvare. Rådata ble senere baseline-korrigert og turbiditetsverdiene ble plottet mot tiden.
MTS analysen
Celleviabilitet i nærvær av stoffet ble bestemt ved bruk av CellTiter 96 AQ
ueous Non radioaktiv Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA) ved nivåer som er proporsjonale med deres veksthastighet (som varierer fra 5 til 10 tusen celler pr brønn) ved et volum på 100 ul og tillates å følge den plate over natten. Den følgende dag ble cellene behandlet med en rekkevidde på 100 ul av 2x medikamentkonsentrasjoner for en endelig medikamentkonsentrasjon 1x per brønn. Hver medikament-konsentrasjon ble administrert til seks forskjellige brønner, for å vurdere teknisk reproduserbarhet av analysen. Denne behandlingen ble opprettholdt uendret i en 72 timers periode. Etter 72 timers behandling, ble 30 ul av MTS-reagens tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C i et tidsrom på 30 minutter til 4 timer, avhengig av fargeutvikling, en sats som var variabel fra cellelinje til cellelinje. Relativ cellelevedyktigheten ble bestemt ved å måle absorbansen av hver brønn ved 490 nm og omdannet til en prosent av total levedyktighet sammenlignet med en ubehandlet kontroll. Eksperimentelle resultater er et gjennomsnitt på minst n = 3 forsøk.
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) analyse ble utført for western blotting. 10% polyakrylamidgeler (fra en stamløsning av 40% 29: 1 akrylamid /bis-løsning, 0,375 M Tris, 0,1% (v /v) SDS, 0,1% (volum /volum) ammonium-persulfat, 0,1% (v /v) TEMED (N, N, N «, N»-tetrametyletylendiamin), vann til volum) ble anvendt for alle Western blot eksperimenter. Polyakrylamid (7,5%) geler ble anvendt for Western blot-analyse av P-gp-protein (170 kDa) for den nødvendige oppløsningen av proteinbånd i dette størrelsesområdet. Totalt proteinlysatene (25 mikrogram) ble lastet inn i 10 eller 15 vel polyakrylamidgeler bruker 1x Laemmli-prøvebuffer (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Gelene ble kjørt ved 200 V i ~ 1 time i 1x Tris /glycin /SDS-buffer løp (ICN Biomedicals Inc., Irvine, CA, USA) før den blir fjernet og farget med Coomassie-blått eller overført til nitrocellulosemembran for Western blot-analyse. Coomassie-fargede geler ble avfarget ved hjelp av en oppløsning av 50% H
2o, 40% metanol og 10% iseddik. Avfarget geler ble skannet på en CanoScan LiDE 600F (Canon Inc., Tokyo, Japan) og visualisert ved hjelp av Adobe Photoshop 6.0-programvare (Adobe Systems, San Jose, CA, USA).
Western Blot analyse
Etter gelelektroforese og overføring av proteinene til nitrocellulosemembraner, ble membranene blokkert med 5% Tris-bufret saltvann (TBS), pluss melk og Tween (TBSMT) (154 mM Tris-HCl, 1,37 M NaCl, 0,1% (v /v ) Tween 20, 5% (w /v)) løsning melk i 1 time. Proteiner på membraner ble utsatt over natten for å primært antistoff-TBSMT løsning. På den følgende dag, ble membranene vasket i Tris-bufret saltoppløsning, i tillegg Tween (TBST) (154 mM Tris-HCl, 1,37 M NaCl, 0,1% (v /v) Tween 20, pH 7,6), 6 sykluser med 5 min vask /inkubasjon for hver syklus i TBST for å fjerne ubundet antistoff. Membranene ble ytterligere utsatt for sekundært antistoff i TBST i 30 min. Etter sekundært antistoff inkubasjon ble membranene vasket i TBST i 12 sykluser med 5 min vask /inkubasjon i hver syklus i TBST for å fjerne eventuelt ubundet sekundært antistoff. Proteiner ble oppdaget etter en 5 min eksponering til enten ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Little Chalfont, England) eller Lumi-Light Western blotting substrat (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) og den eksponerte filmen ble utviklet ved hjelp av en KODAK m35A X-OMAT prosessor (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA). Proteiner som detekteres ved hjelp av primære mus anti-humane antistoffer var: SIII (ab14545; Abcam, Cambridge, England) anvendt ved en fortynning på 1 i 1000, P-gp (ab3366; Abcam, Cambridge, England) anvendt ved en fortynning på 1 i 2000 , og geite anti-human aktin (sc-1616, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) ble brukt ved en fortynning på 1 i 4000. Sekundære antistoffer ble geit-anti-mus (115-035-003, Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA), ved en fortynning på 1 i 10 000 og kanin-anti-geit (305-035-045, Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) ble brukt ved en fortynning på 1 i 40.000. De opprinnelige filmene ble skannet, og bildene ble importert til PowerPoint. Båndene befinner seg ved det forventede størrelsesområdet ble klippet ut av filmene. Størrelse og kontrast for hver figur ble justert slik at alle tall matchet i størrelse og deretter gruppert sammen. Kontrasten av hele gruppen ble justert slik at band kan bli bedre visualisert og fargen var konsekvent.
Statistical Analysis
GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ble brukt til å opprette tall og utføre statistisk analyse av resultatene. Standard t-test ble brukt til å sammenligne de cytotoksiske resultatene for hver av de analoger forhold til paclitaxel indusert cytotoksiske profiler; som også for alle celleanalyseresultater med og uten andre variabler (f.eks verapamil). En måte ANOVA (analyse av varians) ble anvendt for å vise den statistiske signifikans mellom lav, middels og høy medikamentresistens i cellelinjer behandlet med paclitaxel og derivater.
Computational Simuleringer
Binding til taksan bindende nettstedet.
koordinatene til tubulin-taxan reseptor-ligand-komplekset ble hentet fra PDB krystallstruktur 1JFF [34], som representerer paclitaxel co-krystallisert med tubulin. Koordinatene til denne krystallstrukturen ble anvendt for å bygge komplekser av de andre taxanderivater. Strukturene ble bygget ved hjelp av Avogadro 1.0.3 programvare [35]. Ni komplekser ble bygget, inkludert Tx-A gjennom Tx-G, så vel som paclitaxel og docetaxel som kontroller. Reseptoren ble fremstilt ved fjerning av den alfa-subenheten av 1JFF, da det ikke direkte bidrar til bindingen av taxaner. Den manglende første metioninrest ble tilsatt, og den C-terminale ende ble lukket med en N-metyl-rest. Den kofaktor guanosin-difosfat (GDP) ble også inkludert i strukturen og dens parametre ble oppnådd fra Meagher et al. [36] ionisering tilstander av proteinrester ble tildelt bruker PROPKA server [37-39]. Ligandene ble parametriseres i henhold til den generelle AMBER kraftfelt (klepp) [40] og delvis kostnader ble tildelt med AM1-BCC metoden [41] med
forværelse
modul av AMBER 12 [42]. Kompleksene ble deretter bygget ved hjelp av
tleap
modul av AMBER 12 der proteinet ble parametriseres med AMBERff12SB kraftfelt [43,44]. Komplekset ble oppløst i en avkortet oktaedrisk boks som strekker seg 12 Å i hver retning. Komplekset ble deretter nøytralisert ved tilsetning av 16 natriumioner. Ytterligere 22 natrium- og kloridioner ble tilsatt for å oppnå en saltkonsentrasjon på 100 mM. Hvert kompleks ble deretter minimeres med tunge begrensninger (500 kcal /(mol a)) på protein og uten SHAKE på hydrogenatomer for 1000 bratteste nedstigningen kjører etterfulgt av 1000 konjugert gradient går. Et annet minimering med 3000 bratteste nedstigningen går etterfulgt av 3000 konjugert gradient går ble utført uten noen begrensninger. Oppvarming til en temperatur på 300 K under konstant volum med SHAKE og begrensninger på proteinet ble utført ved hjelp av en Langevin termostat for 20 ps. Tetthet likevekt ved konstant trykk for 200 ps ble deretter utført ved hjelp av SHAKE på hydrogenatomer og under gradvis minkende begrensninger på tunge atomer. Dette ble etterfulgt av en produksjonsfase på 10 ns ved 300 K under konstant trykk, hvor koordinatene ble registrert hver 2 ps. Alle simuleringene ble gjort under periodiske grensebetingelser ved hjelp av partikkel mesh Ewald metode for behandling av langtrekkende elektrostatikk. Tetthet, temperatur, total energi og RMSD ble sjekket for likevekt. De siste 2 ns av produksjon kjøre var post-behandlet for å binde frie energiberegning ved hjelp av molekylmekanikk /Poisson-Boltzmann Surface Area (MM /PBSA) [45] eller Molekylmekanikk /Generalisert Født Surface Area (MM /GBSA) tilnærminger [46]. Vi hentet 200 jevnt fordelt snapshots fra de siste 2 ns av produksjonen kjøre og brukte dem for MM /PBSA og MM /GBSA beregninger. Vi utførte også vanlig modus analyse for hver komplekse bruker 100 jevnt fordelte snapshots som ble hentet fra de siste 2 ns av produksjon kjøre. Siden normal modus analyse er meget tidkrevende, anvendte vi en framgangsmåte der proteinet er avkortet. Nærmere bestemt, alle rester lenger enn 12 Å fra liganden var avkortet, og analysen ble utført bare på de resterende system. Denne metoden har vist seg effektiv og tilstrekkelig nøyaktig ved Genheden et al [46]
I vår tilnærming, binde frie energi er beregnet i henhold til formelen:. (1) hvor er den gjennomsnittlige molekyl mekanisk energi inkludert bidrag fra bindingen, vinkel, dihedral, van der Waals og elektro vilkår. er oppløsnings frie energien beregnes ved å løse den Poisson-Boltzmann (eller generalisert Born) ligningen for å oppnå den polare oppløsnings fri energi og ved å estimere ikke-polare oppløsnings fri energi ved hjelp av et overflateareal sikt. –
TS
MM
er entropien sikt beregnes ved hjelp av normal modus analyse. Når den gjennomsnittlige frie energi er beregnet for liganden, reseptoren, og komplekst, er bindingsenergien erholdt ved hjelp av følgende ligning:. (2)
Binding til den mellomliggende nanopore Side
A microtubule nanopore modellen ble konstruert ved å kombinere elektronmikroskopi data for en microtubule (1XRP) [47] med røntgendata for en αβ-tubulin heterodimer (1JFF) [34]. Begynnelsen fra protein- og nukleotid-komponenter av 1JFF krystall, manglende rester (spesielt a: 1,35-60 og P: 1) ble tatt fra 1TUB [1] og lagt over 1JFF. Deretter ble protonering tilstand av ioniserbare rester i 1JFF bestemt ved å anvende PROPKA og hydrogenatomer tilsatt for å oppnå en fullstendig αβ-tubulin heterodimer. Til slutt ble denne dimer anvendt for å konstruere en del av en mikrotubuli ved hjelp av elektronmikroskopi av data fra 1XRP. Modellen som ble anvendt var for type 1 pore [2], og kun de fire tubulin monomerene i tilknytning til pore ble beholdt.
Bindingen modusen for paclitaxel til den mellomliggende bindingssetet ble tatt fra Freedman et al. [2] og lagt over den nanopore struktur som er beskrevet ovenfor, noe som resulterer i den nanopore-paclitaxel modell som brukes i denne undersøkelsen (figur 2) som et utgangs struktur for å definere mellomliggende bindingssetet i tilkoblings beregninger. Merk at interdimer kontaktene ikke er i likevekt i denne modellen. Bindingen modus av paclitaxel i den mellomliggende bindingssetet rapportert av Freedman et al. skiller seg fra den som er rapportert av Maccari et al. [48], som ligger nærmere til a
3-tubulin. Det er sannsynlig at begge områdene er stabile stater langs den samme internveien.
nanopore er sett fra microtubule utvendig. Den blå sirkelen indikerer mellombindingssetet
Dokking beregninger ble utført med Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group, Montreal, Canada).. MOE ble valgt for docking på grunn av sin indusert-fit docking-protokollen og muligheten til enkelt å modellere ligander med ulike avgifter og ionisering stater. De fire heterodimerer som utgjør den type som en pore ble brukt for å definere reseptoren, og fem taxaner (paclitaxel, Tx-A, Tx-C, Tx-D og Tx-F) ble forankret til området identifisert ved Freedman et al. [2]. På grunn av den lave pKa av karboksylsyregruppene funksjonelle grupper i Tx-D og Tx-F, ble disse to taxaner modellert som anionisk (deprotonert) å best representere deres struktur ved en fysiologisk pH. Scoring ble opprinnelig beregnet med London dG scoring funksjon, beholder 30 konformere (med dubletter fjernet). Deretter avgrensning ble utført ved hjelp av Force metoden og ytterligere rescoring bruker GBVI /WSA dG scoring funksjon. Fire forskjellige tilkoblingsprotokoller ble brukt med varierende størrelser av bindingssetet og med enten en fleksibel eller stiv reseptor.
Diskusjon
Resultater og tubulinpolymerisering Bruke Paclitaxel og Synthesized Derivater
tubulinpolymerisering analyser ble utført ved bruk av paclitaxel-derivater for å måle
in vitro
polymerisasjon aktivitet sammenlignet med paclitaxel. Disse eksperimentene brukte affinitetsrensede βII og SIII tubulin isotyper fra en bovin hjerne kilde; den α-tubulin var en blanding av isotyper; disse former for tubulin er referert til som henholdsvis αβII og αβIII,.
Polymerisasjonsforsøkene Kurver ble etablert ved bruk av paclitaxel og fire av dets derivater med enten αβII og αβIII. Polymerisasjonsbetingelsene Kurvene på legemiddelkonsentrasjon på 10 uM er vist i figur 3A medikamentkonsentrasjon på 10 uM ble den konsentrasjon ved hvilken forskjellene mellom virkningene av alle stoffene var mest tydelig synlige; Men de samme trendene ble observert ved alle konsentrasjonsnivåer som ble testet (1-16 mm).
Isotypically ren bovin hjerne tubulin (αβII eller αβIII) på 1,4 mg /ml ble inkubert i nærvær av narkotika og absorbans ved 350 nm ble målt hvert 8. sekund i minst 11 minutter. Konsentrasjonen av hvert medikament var 10 pM. PTX er paclitaxel.
Resultatene viser at paclitaxel tilsvarer den høyeste frekvensen av microtubule montering. Dette etterfølges av Tx-A, deretter ved Tx-C. Tx-D og Tx-F hadde lignende verdier, med de tregeste priser av microtubule montering. Ingen av derivatene testet gått paclitaxel når det gjelder graden av tubulinpolymerisering. Det var en økning i sammenstillingen hastighet for paclitaxel med etterfulgt av Tx-A, deretter ved Tx-C. Tx-D og Tx-F hadde lignende verdier, med de tregeste priser av microtubule montering
Resultatene var ikke i samsvar med tidligere spådommer [2] og den underliggende premiss beskrevet for første mål. Paclitaxel ble ikke observert å ha redusert polymerisasjon med SIII tubulin (observasjonen var den motsatte av den forventning), og dessuten Tx-A og TX-C ikke ha forventet oppførsel. Verken ble resultatene i samsvar med den underliggende premiss er beskrevet for det andre målet: Tx-D og Tx-F var ikke mer aktive enn paclitaxel. Derfor gjør dette eksperimentet støtter ikke betydningen av rester 275 eller 278, eller den forventede rollen som mellombindingssetet i microtubule nanopore.
Cytotoksisitet av Paclitaxel analoger mot brystkreft cellelinjer.
