Abstract
Utviklingen av resistens mot kjemoterapi er en viktig årsak til kreft-dødsfall . Belyse mekanismene for resistens bør dermed føre til nye terapeutiske strategier. Fibroblast vekstfaktor (FGF) -2 signale induserer montering av en multi-proteinkompleks som gir tumorceller med den molekylære maskineri som er nødvendig for medikamentresistens. Dette kompleks, som omfatter protein kinase C (PKC) ε, v-raf murin sarkom viral onkogen homolog B1 (B-RAF) og p70 S6-kinase β (S6K2), forbedrer den selektive oversettelsen av anti-apoptotiske proteiner som B-celle- leukemi /lymfom-2 (BCL-2) og inhibitorer av apoptose protein (IAP) familiemedlemmer og disse er i stand til å beskytte flere kreftcelletyper fra kjemoterapi-indusert celledød. Janus kinaser (Jaks) er mest kjent for sine kritiske roller i formidling cytokin signalering og immunresponser. Her viser vi at Jåks har romanen funksjoner som støtter deres vurdering som nye mål i terapi for å redusere legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi at det Janus kinase TYK2 er fosforylert på nedstrømssiden av FGF-2-signalisering og som kreves for den fullstendige fosforylering av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2. Videre er TYK2 nødvendig for induksjon av viktige anti-apoptotiske proteiner, slik som BCL-2 og myeloid leukemi celle-sekvens (MCL) en, og for å fremme celleoverlevelse på FGF-2. Dempe JAK1, JAK2 eller TYK2 bruker RNA interferens (RNAi) hemmer FGF2-mediert spredning og resultater i sensibilisering av kreftceller til kjemoterapi-indusert drapet. Disse effektene er uavhengig av aktivering av signal svinger og aktivator av transkripsjon (STAT) 1, STAT3 og STAT5A /B, de vanlige målene for JAK signalering. I stedet TYK2 forbinder med de andre kinaser tidligere innblandet i FGF-2-mediert legemiddelresistens. I lys av disse funnene hypoteser vi at TYK2 og andre Jåks er viktige modulatorer av FGF 2-drevne celle overlevelse, og at hemmere av disse kinaser vil sannsynligvis forbedre effektiviteten av andre kreftterapier
Citation. Carmo CR, Lyons-Lewis J, Seckl MJ, Costa-Pereira AP (2011) A Novel Krav om Janus kinaser som formidlere av Drug Resistance indusert av fibroblastvekstfaktor-2 i humane kreftceller. PLoS ONE 6 (5): e19861. doi: 10,1371 /journal.pone.0019861
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 08.02.2011; Godkjent: 05.04.2011; Publisert: May 20, 2011
Copyright: © 2011 Carmo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Cancer Treatment og Research Trust finansiert dette arbeidet. MJS og JLL er også støttet av en avdeling for helse finansiert Experimental Cancer Medicine Centre Grant, og APC-P og MJS ved Cancer Research UK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utvikling av resistens av tumorceller er ansvarlig for de fattige total overlevelse sett med de fleste krefttyper [1]. Blant mengde medikament resistensmekanismer ligger fibroblast vekstfaktor (FGF) -2 signalering. FGF-2 kan gi celler med pro-overlevelse og mitogene signaler, og gi bredspektret resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter [2], [3], [4]. De-regulert FGF-2-signalering har vært forbundet med en rekke forskjellige maligniteter og forhøyede nivåer av dette molekylet i pasientens serum ble etablert som en selvstendig dårlig prognostisk faktor for lymfom, lungekreft og sarcoma pasienter [5], [6], [7 ]. Spesielt ble FGF-2 vist seg å fremme medikamentresistens av småcellet lungekreft (SCLC) celler ved dannelse av en multi-proteinkompleks som består av protein kinase C (PKC) ε, v-raf murin sarkom viral onkogen homolog B1 (B -RAF) og p70 S6 kinase β (S6K2). Dette var avhengig av ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2 aktivitet [3], [8], [9]. Dannelsen av dette komplekset førte til translasjonell oppregulering av viktige anti-apoptotiske proteiner, som deretter overdratt resistens mot apoptose og tillates cellene å overleve når utfordret med cytotoksiske legemidler.
fleste cytokiner og vekstfaktorer mange signal
via
Janus kinaser (Jaks) og signaldetektorer og aktivatorer av transkripsjon (statistikk) [10], [11]. Konstitutiv STAT fosforylering er karakteristisk for et bredt spekter av humane kreftcellelinjer og primære tumorer [12]. Overaktivering av Jaks har også vært implisert i tumordannelse [13]. Det faktum at Jåks og statistikk er aktivert av flere mitogener har oppmuntret forskere til å utvikle strategier for å målrette dem i kreftbehandling. Det er begrenset, noe forvirrende, bevis for JAK /STAT signale nedstrøms FGF-2 og dens relevans er uklart [14], [15], [16]. Vi og andre [17] har observert de-regulert JAK /STAT-ekspresjon i en rekke lunge karsinom og sarkom cellelinjer. Dette og det faktum at pasienter med forhøyet FGF-2 i serum har dårligere resultater i klinikken førte oss til hypoteser som Jaks og /eller statistikk spilt en rolle i FGF-2 signal-mediert legemiddelresistens sti (er). Her viser vi at det Janus-kinaser JAK1, JAK2 og TYK2, men ikke deres viktigste nedstrøms effektorer STAT1, STAT3 eller STAT5A /B, er nødvendig for FGF-2-mediert chemoprotection i U2OS osteosarcom-celler. Dette i sin tur åpner nye terapeutiske muligheter for kreft som fremdeles er vanskelig å kontrollere.
Resultater
FGF-2 beskytter osteosarkom U2OS celler fra cisplatin-mediert celledød gjennom en mekanisme som innebærer PKCε , B-RAF og S6K2 protein komplekser
Siden FGF-2 ble vist å beskytte SCLC celler fra cellegift-indusert celledød [4], vi først søkt å utvide denne observasjonen til de ulike kreftcelletype osteosarkom U2OS celler. Disse ble behandlet med det klinisk relevante medikamentet cisplatin i nærvær og fravær av FGF-2 (fig. 1). Konsentrasjonen av vekstfaktor som ble anvendt ble bestemt ved anvendelse av ERK1 /2 fosforylering som en avlesning (fig. S1). Celledød ble vurdert ved hjelp av WST-1 celle-levedyktighet assay, som ga identiske resultater med dem som oppnås ved celletelling med trypan blått (resultater ikke vist). Over natten behandling med 60 uM cisplatin drepte 50% av cellene, men preinkubering med FGF-2 i 4 timer hindret dette, noe som tyder på at FGF-2-beskyttede U2OS celler mot cisplatin (Fig. 1A). Den WST-1-analysen ikke diskriminerer mellom apoptose og nekrose. Videre kan rednings fra cisplatin kan tilskrives proliferasjon, som også ble indusert av FGF-2, i stedet for rent til inhibering av celledød. Vi har derfor overvåkes i parallell induksjon av apoptose ved hjelp av spalting av kaspase-substrater, så som poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og lamin B som avlesinger (Fig. 1B og data ikke vist). I tillegg ble cellesyklusanalyse ved strømningscytometri benyttes for å kvantifisere tap av DNA-innhold, som kan brukes som en annen avlesning for apoptose (Fig. 1C). Over natten behandling med cisplatin-indusert apoptose i U2OS celler, som ble manifestert av utseendet av en 85 kDa PARP-spaltning fragment (fig. 1B) og en økning av sub-G1 cellepopulasjon (Fig. 1C). Disse hendelsene ble hindret av forbehandling av celler med FGF-2, som også redusert basal celledød påvist i ubehandlede prøver. Grafene representerer gjennomsnittsverdiene oppnådd i tre uavhengige forsøk. Som observert for SCLC-celler [8], kan reduksjon av celledød av FGF-2 forebygges ved inhibering av mitogenaktivert proteinkinase-kinase (MEK) /ERK-aktivitet sammen med en selektiv inhibitor (fig. S2), mens inhibering av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) og target of rapamycin kompleks (TORC) en signal hadde ingen innvirkning (data ikke vist). Således FGF-2 utøves et anti-apoptotisk virkning i U2OS celler som var formidlet av ERK1 /2 og hindret de cytotoksiske virkninger av cisplatin. Viktigere, etter seponering av legemidlet, forble levedyktig i kultur i flere uker FGF-2-reddet celler (data ikke vist). Dette ytterligere underbygger at FGF-2 kan effektivt fremme overlevelse av kreft celler eksponert for cytostatika.
Celler ble inkubert i serum-frie medier over natten. Etter 4 timer før behandling med FGF-2 (10 ng /ml), ble cellene behandlet med cisplatin (60 uM) over natten. A. Cellelevedyktigheten ble målt ved bruk av WST-1-assay. Verdier tilsvarer tetrazoliumsalt WST-en spaltet i fargede formazanforbindelsen forbindelser etter mitokondrielle dehydrogenase. Gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo er presentert som gangers induksjon i forhold til ubehandlede kontroller. B. Proteinene ble separert på en 7,5% SDS-PAGE-gel og western-blotting-analyse utført på totale cellelysater (levende og døde celler) ved anvendelse av antistoffer mot PARP. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. En representant western blot og gjennomsnitt ± SEM av densitometriske verdier (spaltet PARP) fra tre uavhengige eksperimenter er vist. C. Celler ble permeabilisert og DNA farget med propidiumjodid (PI). Cellecyklus-profiler ble bestemt ved flow-cytometri og dataene minelagt ved hjelp av FlowJo. Gjennomsnitt ± SEM av sub-G1 hendelser fra tre uavhengige forsøk er uttrykt som fold-endring av sub-G1 populasjoner over ubehandlet kontroll.
I SCLC celler, innebærer FGF-2-medierte legemiddelresistensveier dannelse av et proteinkompleks som omfatter PKCε, B-RAF og S6K2 [4]. Vi neste spurt om FGF-2 kan indusere lignende protein interaksjoner i U2OS celler. Celler inkubert i nærvær eller fravær av FGF-2 for tidspunktene angitt ble lysert og immunoutfelt S6K2 før western blotting for PKCε, B-RAF eller S6K2 (fig. 2A). B-RAF og PKCε forbundet med S6K2 i hvilende celler, en effekt som var signifikant økt med FGF-2-behandling i 10 minutter (Fig. 2A). Interaksjonene var forbigående og ikke lenger signifikant etter 30 min post-FGF-2 behandling. For å underbygge forestillingen om at de tre proteinene interaksjon, vi neste immunopresipitert enten PKCε (Fig. 2B) eller B-RAF (Fig. 2C) fra cellelysatene. Vi deretter utført western blotting å sondere for disse proteinene og S6K2. Mens B-RAF og PKCε basal samhandling økt 10 min etter FGF-2 stimulering og deretter fortsatte, var vi ikke i stand til å oppdage S6K2 i disse immunutfelninger (Fig. 2B, 2C og data ikke vist). Dette kan forklares ved lavere ekspresjonsnivåer av S6K2 sammenlignet med PKCε og B-RAF i celler, U2OS variasjon i støkiometri av de sammenslutninger eller dannelsen av flere, forskjellige, proteinkomplekser. Samlet data tyder på at FGF-2 fremmer molekylære interaksjoner mellom PKCε, B-RAF og S6K2. Parallelt med alle immunoutfellinger, ble nivåene av de tre proteinene også analysert i hele celleekstrakter (fig. S3). Interessant nok var en liten (1/5 til 1/7 ganger), men meget reproduserbar og statistisk signifikant økning av S6K2 detektert 10 min etter tilsetningen av FGF-2, mens nivåene av PKCε, b-RAF, ERK1 /2 og β-aktin (sistnevnte to brukt som laste kontroller) var upåvirket (fig. S3 og også S5). Om økningen i S6K2 signal er rent på grunn av en økning i fosforylering eller stabilisering av proteinet gjenstår å bli bestemt. Fosforylering av ERK1 /2 ble også overvåket for å sikre funksjonaliteten til FGF-2 (fig. S3). For ytterligere å verifisere at U2OS celler opptrådt som SCLC i respons til FGF-2 pro-overlevelse signale vi også bestemt om en økning i anti-apoptotiske proteiner kunne påvises [8]. Som forutsagt, FGF-2 økte B-celle leukemi /lymfom-2 (BCL-2), BCL-2-lignende 1 protein (BCL-x
L) og X-bundet inhibitor av apoptose protein (XIAP) ekspresjonsnivåer men, i tillegg har vi også observert induksjon av en annen viktig anti-apoptotiske protein, nemlig myeloid leukemi celle-sekvens (MCL) 1, i U2OS-celler (fig. 2D og data ikke vist).
celler ble serum- sultet som før og etter stimulering med FGF-2 (10 ng /ml), proteinene ekstrahert ved hjelp av ko-immunoprecipitation lyseringsbuffer. Cellelysater ble underkastet immunoutfelling med (A.) S6K2, (B.) PKCε eller (c) B-RAF-antistoffer og proteiner påvist ved western blotting som angitt. D. Western blot analyse ble utført ved hjelp av totale cellelysater og antistoffer mot MCL1 og BCL-2. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Representative vestlige blotter og gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk er vist i grafer. «-. Min
nedregulering av JAK1, JAK2 eller TYK2, men ikke STAT1, STAT3 eller STAT5 hemmer FGF-2-mediert legemiddelresistens i U2OS celler
Mange kreftcellelinjer brukt i forskning har de-regulert JAK /STAT signalering. Dette gjenspeiler
in vivo
situasjon som det samme er observert i humane tumorprøver. Til tross for sine tradisjonelle roller i immunresponser Jåks og statistikk blir stadig mer anerkjent som viktige molekyler i kreft biologi. Våre foregående data viste at FGF-2 indusert interaksjoner mellom B-RAF, PKCε og S6K2, økt uttrykk av viktige anti-apoptotiske molekyler og beskyttede U2OS celler fra cisplatin-indusert apoptose. Vi neste spurt om ubiquitously uttrykt JAK familiemedlemmer og /eller deres substrat statistikk var en del av denne signalveien. For å løse dette spørsmålet, ble RNA interferens (RNAi) indusert ved hjelp av short inter (SI) oligonukleotider mot JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3 og STAT5A /B. Gjennom denne studien har vi brukt siRNA bassenger hver bestående av fire siRNA oligonukleotider rettet mot ulike regioner av samme målet molekyler. Alle siRNA bassenger ble validert ved dekonvolvering og western-blotting ved anvendelse av antistoffer dannet mot de kjente mål, så vel som nært beslektede molekyler, som tidligere beskrevet i vårt laboratorium [18]. Dempe effektiviteten og spesifisiteten av sammenslåtte sirnas er vist i figur S4. U2OS celler transfektert med siRNA ble behandlet med eller uten FGF-2 i 4 timer og deretter utsatt for cisplatin (fig. 3 og 4). Omtrent 50% av U2OS celler som hadde forstummet JAK1 (siJAK), JAK2 (siJAK2) eller TYK2 (siTYK2) behandlet med cisplatin gikk apoptose, og dette kan ikke forebygges ved å forhåndsbehandle disse cellene med FGF-2 (Fig. 3). Apoptose ble bestemt ved hjelp av WST-1-analyse (data ikke vist), eller ved hjelp av PARP spalting (Fig. 3A) og DNA-fragmentering (fig. 3B) som avlesninger. I sterk motsetning til dette ble den øket PARP-spaltning og sub-G1 cellepopulasjon indusert ved cisplatin forhindret av FGF-2 i kontrollceller transfektert med et ikke-spesifikt siRNA (NS) og i ikke-transfekterte celler. Således har hver av de analyserte Jaks var nødvendig for effektiv FGF-2-mediert chemoprotection fra cisplatin-indusert apoptose.
Cellene ble transfektert med 75 nM av siRNA mot JAK1, JAK2 eller TYK2. Utransfekterte celler og celler transfektert med ikke-spesifikk siRNA (NS) ble anvendt som kontroller. Etter 48 timer ble cellene på nytt platet (2 x 10
5-celler /brønn) og inkubert i serum-fritt medium over natten. Etter 4 timer før behandling med FGF-2 (10 ng /ml), ble cellene behandlet med cisplatin (60 uM) over natten. A. Mean ± SEM av densitometriske verdier (spaltet PARP) fra tre forsøk er vist. B. Celle syklus profiler av tre uavhengige eksperimenter er grafisk representert som middelverdi ± SEM av sub-populasjoner G1. Den øverste panelene eksemplifisere data og tilsvarer å kontrollere celler.
Celler ble transfektert med 75 nM av siRNA mot STAT1, STAT3 eller STAT5A /B. Utransfekterte celler og celler transfektert med ikke-spesifikk siRNA (NS) ble anvendt som kontroller (jfr fig. 3). Celler ble behandlet som i figur 3. A. Gjennomsnitt ± SEM av densitometriske verdier (spaltes PARP) fra tre eksperimenter er vist. B. Cell sykkelprofilene for tre uavhengige eksperimenter er grafisk representert som gjennomsnitt ± SEM av sub-G1 populasjoner.
Vi neste undersøkt om Jaks kan fungere gjennom sin kanoniske nedstrøms mål STAT1, STAT3 eller STAT5. Imidlertid, tie hver av disse molekylene individuelt hadde ingen virkning på FGF-2-indusert medikamentresistens. Faktisk PARP spalting (fig. 4A) og sub-G1 hendelser (Fig. 4B) som utløses av cisplatin forble signifikant redusert i celler forbehandlet med FGF-2, uavhengig av innholdet av STAT1, STAT3 eller STAT5A /B.
FGF-2 induserer TYK2 men ikke STAT fosforylering
STAT1, STAT3 og STAT5A /B er naturlige substrater for de Jaks, men våre foregående data tyder på at de ikke kan være nødvendig for FGF-2-indusert pro-overlevelse signalering. Hvis dette var faktisk sant, da man ville forvente FGF-2 for å være ute av stand til å aktivere statistikk, en prosess som involverer tyrosin fosforylering på spesifikke rester som phosphospecific antistoffer er tilgjengelige [19]. Derfor neste undersøkte vi om statistikk ble endret nedstrøms FGF-2 ved å analysere tyrosinfosforylering av STAT1 (Tyr
701), STAT3 (Tyr
705) og STAT5A /B (Tyr
694) av western blotting . Etter avtale med våre tidligere funn (Fig. 4), FGF-2 ikke klarte å indusere aktivering av STAT1, STAT3 eller STAT5 i U2OS celler (Fig. 5A). Ikke desto mindre, som forventet, er disse proteinene kan bli fosforylert av interferon (IFN) -. Γ, interleukin (IL) -6, eller onkostatin M (OSM), som ble anvendt som positive kontroller (Fig. 5A)
EN. FGF-2 induserte ikke STAT1, STAT3, eller STAT5 fosforylering. U2OS celler ble serum-sultet over natten og deretter stimulert med FGF-2 i de angitte tidsrom. Celler behandlet med IFN-γ (500 IU /ml), IL-6 (200 ng /ml) /sIL-6R (250 ng /ml) og OSM (50 ng /ml) ble anvendt som positive kontroller for aktivering av STAT1, STAT3 og STAT5 hhv. Proteiner ble analysert som før du bruker antistoffer mot fosforylert STAT1 (Tyr
701), fosforylert STAT3 (Tyr
705), fosforylert STAT5 (Tyr
694) og antistoffer som gjenkjenner både fosforylerte og ufosforylerte proteiner. B. FGF-2-indusert fosforylering av TYK2 i U2OS celler. Celler ble inkubert i serum-fritt medium og deretter behandlet med FGF-2 (10 ng /ml) i de angitte tidsrom. TYK2 ble immunopresipitert og western blotting analyse ble utført ved hjelp av antistoffer mot fosforylerte tyrosinene og total TYK2. TYK2 ble anvendt som en kontroll lasting. C. Total cellelysater som brukes til å immunoutfelle TYK2 og fra celler transfektert med siTYK2 ble separert på en 7,5% SDS-PAGE-gel og analysert ved western blot. Membraner ble analysert for TYK2, pErk1 /2-Thr
202/185 /Tyr
204/187 og total ERK1 /2. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. «-. Min
En potensiell forklaring på disse funnene inkluderer muligheten for at FGF-2 klarer rett og slett for å aktivere Jaks, en prosess som også involverer tyrosinfosforylering. For å avgjøre om Jaks kan bli aktivert av FGF-2, bestemte vi oss for å fokusere på TYK2, en av de mindre studert Jåks som er mye uttrykt i mange celletyper. U2OS celler ble behandlet med FGF-2 for forskjellige tidsperioder og TYK2 ble immunopresipitert. TYK2 tyrosinfosforylering ble bestemt ved bruk av antistoffer mot fosforylerte tyrosinene (4G10 og PY20, 01:01 mix) og TYK2 protein uttrykk med et anti-TYK2 antistoff. FGF-2 induserte en transient 2-ganger økning i TYK2 tyrosinfosforylering, som nådde en topp ved 5 min og tilbake i nærheten av basalnivåer etter 30 minutter (Fig. 5B). Ingen fosfor-TYK2 eller TYK2 ble sett i kontrollprøver (immunoutfellinger med perler bare, eller med en irrelevant antistoff). Parallelt ble helcellelysater anvendt for immunopresipitering og lysater fra siTYK2-transfekterte celler (antistoffkontroll) analysert (fig. 5C). De data som således antyder at TYK2 er fosforylert, og eventuelt aktivert, på nedstrømssiden av FGF-2. Disse resultatene sammen med de som er presentert i figur 3 er helt i overensstemmelse med en rolle for TYK2 nedstrøms av FGF-2 som ikke er avhengig av den samtidige fosforylering /aktivering av STAT1, STAT3 og STAT5. Det gjenstår å bli etablert hvis JAK1 og JAK2 er også fosforylert nedstrøms FGF-2.
TYK2 binder seg til PKCε og B-RAF på FGF-2 behandling og er nødvendig for full fosforylering av ERK1 /2 og MCL1 induksjon
De foregående data bedt oss å avgjøre om TYK2 samhandlet med B-RAF, PKCε og S6K2. Det var ikke trivielt å oppdage TYK2 i S6K2, B-RAF og PKCε protein kompleks (er) antakelig på grunn av lave nivåer for dette proteinet i U2OS celler. TYK2 ble derfor immunopresipitert etter behandling med FGF-2 og immunopresipitatene ble analysert ved western blotting med antistoffer mot B-RAF, PKCε og S6K2 stedet. Ved FGF-2 stimulering TYK2 kort i forbindelse med B-RAF og PKCε (Fig. 6A). Den forbigående art av disse foreningene kan også forklare hvorfor det var også vanskelig å oppdage S6K2 i disse immunkomplekser. Kontroll lysater er vist i figur S5.
A. FGF-2 indusert samspill av TYK2 med PKCε og B-RAF i U2OS celler. Celler ble behandlet som tidligere beskrevet og proteiner isolert ved anvendelse av co-immunoprecipitation buffer. TYK2 ble immunopresipitert fra helcellelysater og immunopresipitatene ble analysert ved hjelp av Western blot. Membraner ble analysert for PKCε, B-RAF og TYK2, sistnevnte brukes her som en lasting kontroll. B. og C. TYK2 stanse i U2OS celler førte til redusert ERK1 /2 fosforylering og hemmet oppregulering av MCL1 i respons til FGF-2. -Celler ble transfektert med siTYK2 som før. Utransfekterte celler og celler transfektert med et ikke-spesifikt siRNA (NS) ble anvendt som kontroller. Etter 48 timer ble cellene behandlet som beskrevet tidligere, og deretter stimulert med FGF-2 for (B) 10 minutter og (C) i 4 timer. B. Proteiner ble analysert ved anvendelse av antistoffer mot p-ERK1 /2 (Thr
202/185 /Tyr
204/187) og total ERK1 /2. Verdier tilsvarer fosfor-ERK1 og -ERK2 nivåer. C. Western blotting-analyse ble utført ved anvendelse av de totale cellelysatene og anti-MCL1 antistoff. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting og for normalisering. Gjennomsnitt ± SEM av densitometriske verdier av tre uavhengige forsøk er vist.
FGF-2-mediert chemoprotection nødvendig ERK1 /2 aktivitet (fig. S2). For å fastslå om dette var avhengig TYK2, ble U2OS-celler transfektert med siTYK2 og ble deretter behandlet med FGF-2 og ERK1 /2 fosforylering vurdert ved Western blot (Fig. 6B). Sammenlignet med ikke-transfekterte celler, RNAi mot TYK2 betydelig redusert ERK1 /2 fosforylering (med 40% for ERK1 og 25% for ERK2), et fenomen som ikke ble observert i celler transfektert med uspesifikk siRNA. Dette fikk oss til å undersøke neste om oppregulering av anti-apoptotiske proteiner ved FGF-2 ble svekket på TYK2 lyddemping. RNAi ble utført som før og, som et eksempel, ekspresjon av MCL1 overvåket ved Western blot (Fig. 6C). Utransfekterte celler og celler transfektert med enten en ikke-spesifikk siRNA eller siERK1 /2 ble anvendt som kontroller. I ikke-transfekterte celler eller celler transfektert med et ikke-spesifikt kontroll, FGF-2 fører til en betydelig økning i MCL1 proteinnivåer. Som spådd, siRNA mot ERK1 /2 hemmet oppregulering av MCL1 protein. Viktigere, gjorde MCL1 uttrykk ikke øke som følge av FGF-2 i celler med redusert nivå av TYK2, noe som tyder på at dette JAK er nødvendig for oppregulering av MCL1.
Diskusjoner
Det er mange molekylære mekanismer som cellene kan bli resistent mot cytotoksiske legemidler og dermed ulike typer narkotika motstand må løses for å undertrykke kreftceller. FGF-2 er blitt identifisert som en negativ prognostisk faktor for mange kreftpasienter [5], [6], [7] og Seckl og Pardo har vist sin relevans for legemiddelresistens [3], [4], [8], [ ,,,0],9], [20].
utgangen av JAK /STAT signalveier konsekvenser langt utover cytokin riket. Det er allment akseptert at JAK /STAT-signalering er meget kontekstavhengig [18], [21], [22], [23], [24], at den er modulær i naturen, og at det innebærer både krysstale og kryss -recruitment av andre reaksjonsveier [11], [25]. Statistikk er vanligvis ikke funnet mutert, men blir ofte sett konstitutivt aktiveres i kreftceller [12], [19]. I kontrast er Jaks ofte mutert og derved de-regulert, særlig i hematologiske maligniteter [26], [27]. Så vidt vi vet, Jåks har aldri vært direkte innblandet i narkotika motstand. Det er imidlertid anerkjent at mange kreftformer er ledsaget av inflammasjon, som medieres av cytokiner og følgelig JAK og STAT aktivitet [28]. De-regulert inflammasjon, i sin tur, har vært implisert i mange aspekter av kreftutvikling og progresjon, inkludert medikament-resistens [12]. Interessant, kan Jåks ha motstridende cellulære responser og, som nevnt ovenfor, avhenger dette av avtrekkeren og på den cellulære forbindelse [13], [29]. Proliferative responser kan være direkte formidlet av statistikken, eller av andre molekyler som ras viral onkogen homolog (RAS), ERK, v-src sarkom viral onkogen homolog (SRC) og PI3K [anmeldt i [30]]. Reguleringen av cytokin svar av Jåks er STAT-avhengige, men JAK-avhengige STAT-uavhengig cellulære responser er også rapportert. Faktisk JAK1 og JAK2 modulere uttrykk for BCL-2 familiemedlemmer, molekyler avgjørende for cellenes liv og død beslutninger, uavhengig av STAT aktivitet [31], [32]. Studier ved hjelp TYK2-mangelcellelinjer antydet at TYK2 var avgjørende for svarene til IFN-α /β og noen cytokiner. I kontrast knockout mus, til tross for at mer utsatt for virusinfeksjoner, hadde sine cytokin svarene i stor grad intakt [33]. Studier av en pasient med en naturlig forekommende TYK2 mangel er imidlertid foreslått at TYK2 var nødvendig for fullstendig cytokin-signalisering [gjennomgått i [13]]. De nøyaktige roller TYK2, til og med i løpet av cytokin-responser, gjenstår således ikke helt klarlagt.
Her har vi vist at det i U2OS celler TYK2 er hurtig fosforylert på nedstrømssiden av FGF-2 (fig. 5B), er påkrevet for full aktivering av ERK1 /2 (fig. 6B), og for induksjon av MCL1 (fig. 6C). Videre TYK2, JAK1 og JAK2 er nødvendig for FGF-2-formidlet beskyttelse mot cisplatin (fig. 1 og 3). Denne effekten ser ut til å være uavhengig av statistikken, som stanse all STAT1, STAT3 eller STAT5A /B ikke blokkere overlevelse effekter mediert av FGF-2 (Fig. 1 og 4). Hver STAT ble stille selvstendig og det er mulig at samtidig knockdown av alle tre statistikk, eller faktisk av andre STAT familiemedlemmer, kan ha innvirkning på FGF-2 legemiddelresistens. Det faktum at ingen fosforylering av statistikk kan oppdages etter FGF-2 behandling tyder imidlertid på annen måte (Fig. 5A). Det er fortsatt ikke kjent hvordan TYK2 fosforyleres nedstrøms FGF-2. TYK2 kan være direkte rekruttert til FGF-reseptoren, eller den kan være fosforylert ytterligere nedstrøms av en annen kinase slik som SRC [30]. Mangelen på STAT fosforylering på nedstrømssiden av FGF-2 og mangel på effekt på FGF-2-medikamentresistens (fig. 4 og 5A) antyder også at cytokiner ikke er involvert i medikamentresistens trasé som utløses av denne vekstfaktor. Rollen til TYK2 i FGF-2-mediert medikamentresistens kan være enzymatisk og /eller strukturelle (fig. 5B og 6A). Faktisk en strukturell rolle for TYK2 er blitt tilskrevet TYK2 i IFN-a /p-reaksjoner hvor dets tilstedeværelse ikke var bare nødvendig for signalering, men også for den celleoverflate-ekspresjon av IFNAR1-kjeden [34]. Videre arbeid er derfor nødvendig for å bestemme hvorvidt TYK2 kinase-aktivitet og /eller struktur er nødvendig for å formidle den FGF-2-indusert pro-overlevelse og medikamentresistens fenotype.
Som for SCLC-celler [4], behandlings av U2OS celler med FGF-2 induserer dannelsen av proteinkomplekser som involverer B-RAF, PKCε og S6K2 (fig. 2A-2C). Konseptuelt kan FGF-2 fører til dannelse av tre forskjellige dimerer (B-RAF /PKCε, B-RAF /S6K2; S6K2 /PKCε) og /eller dannelse av en trimer (B-RAF /PKCε /S6K2). Den nøyaktige støkiometri av proteinkompleksene indusert av FGF-2 gjenstår å bli bestemt. Samspillet mellom disse tre proteinene forekommer i løpet av 10 minutter av FGF-2-behandling, og er forbigående, avtar betydelig etter 30 min. Selv om den nøyaktige rolle av komplekset er fortsatt blir avslørt, er det fristende å spekulere i at dens funksjon kan være å tilveiebringe en signal plattform hvor disse kinaser kan sette sammen og gjennomgå spesifikke fosforylering hendelser som kreves for ytterligere nedstrøms biologiske responser som til slutt fører til celle overlevelse. Interessant, S6K2 nivåer raskt øke etter FGF-2 behandling som indikerer at, i tillegg til å indusere S6K2 fosforylering, kan FGF-2 også stabilisere S6K2 (fig. S3 og S5). Så langt vi kjenner til, er dette et nytt funn som tilsier en mer detaljert undersøkelse. TYK2 immunoutfelling følgende FGF-2-behandlings co-immunopresipitater PKCε og B-RAF, som videre antyder en viktig rolle for TYK2 i FGF-2-mediert medikamentresistens (Fig. 6A). Følgelig stanse enten TYK2, JAK1 eller JAK2 hjelp RNAi blokkert FGF-2 resistens mot cisplatin (Fig. 3). Det vil være spesielt relevant for å bestemme om dannelsen av proteinkomplekser som involverer PKCε, B-RAF og S6K2 avhenger TYK2 siden TYK2 fosforylering er relativt rask og kan påvises 5 min etter FGF-2-behandling. I tillegg har vi identifisert MCL1 som TYK2 regulert molekyl. Faktisk, under disse forsøksbetingelser, økt ekspresjon av MCL1 følgende FGF-2 avhengig av intakte TYK2 (Fig. 6C). Dette er sannsynligvis et viktig funn som, i likhet med BCL-2, betyr MCL1 ikke induserer spredning, men heller fremmer kreft celle levedyktighet ved å blokkere apoptose [35]. I tillegg er det en av de genene uthevet i en studie av Meyerson og medarbeidere som er designet for å identifisere genomiske områder ofte endres i kreft hos mennesker [36].
Sammen våre data tyder på at TYK2, JAK1 og JAK2 er nye mål som kan være nyttige for å omgå legemiddelresistens mediert av FGF-2, en vekstfaktor ofte utskilt av cancerceller, eller deres støttevev, og forhøyet hos kreftpasienter. De nøyaktige molekylære mekanismene som er involvert er derfor for tiden under etterforskning i vårt laboratorium.
Materialer og metoder
Cell kultur
U2OS celler fra ATCC ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium ( DMEM) supplert med 10% (v /v) føtalt kalveserum (FCS) (FirstLink), 2 mM L-glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (BioWhittaker) i en fuktig atmosfære av 10% CO
2 ved 37 ° C, som tidligere beskrevet [18]. FGF-2 var fra Calbiochem.
Antistoffer
Anti-TYK2 (C-20), STAT3 (N-terminal), STAT5A (L-20), STAT5B (G-2) ERK1 (underdomene XI), ble B-RAF (H145) og BCL-2 (100) kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. STAT1 (N-terminale) og PY20-antistoffer ble oppnådd fra BD Transduction Laboratories. Antistoffer mot fosforylert STAT1 (pSTAT1-Tyr
701), fosforylert STAT3 (pSTAT3-Tyr
705), fosforylert STAT5 (pSTAT5-Tyr
694), fosforylert ERK1 /2 (pErk1 /2-Thr
202/185 /Tyr
204/187) og PARP ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Anti-MCL1 var fra BD Pharmingen. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
