Abstract
Bakgrunn
ribosomalt RNA (rRNA) er en sentral regulator av cellevekst og kan kontrollere kreftutvikling. En cis kodende rRNA (nc-rRNA) oppstrøms fra
45S rRNA
transkripsjon start stedet har nylig vært innblandet i kontrollen av
rRNA
transkripsjon i mus fibroblaster. Vi undersøkte om en lignende nc-rRNA kan uttrykkes i humane kreft epitelceller, og knyttet til eventuelle genomiske egenskaper.
metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av kvantitativ rRNA måling, vi demonstrert at en nc -rRNA er transkribert i menneskelige lunge epitel og lungekreft celler, fra ca -1000 nukleotider oppstrøms for
rRNA
transkripsjon start hotellet (1) og strekker seg i det minste til 203. Dette nc-rRNA var signifikant mer rikelig i de fleste lungekreft cellelinjer, i forhold til en ikke-omformet lunge epitelcellelinje. Sin overflod korrelerte negativt med totale 45S rRNA i 12 av 13 cellelinjer (P = 0,014). Under sekvensanalyse -388 til 306, observerte vi forskjellige, hyppige intercopy enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i
rRNA
, med en frekvens større enn forutsett ved en tilfeldighet på 12 steder. En SNP ved 139 (U /C) i 5 «ledersekvensen varierte mellom cellelinjer og korrelerte negativt med nivået av den nc-rRNA (P = 0,014). Modellering av den sekundære struktur av rRNA 5»-ledersekvensen indikerte en liten økning i strukturell stabilitet på grunn av den 139 U /C SNP og en mindre forskyvning i lokale forekomster konfigurasjon.
Konklusjoner /Betydningen
resultatene viser forekomsten av en følelse nc-rRNA i humane lunge epitel-celler og kreftceller, og indikerer en rolle i reguleringen av
rRNA
gen, som kan bli påvirket av en 139 SNP i fem «ledersekvensen av primær rRNA transkripsjon
Citation. Shiao YH, Lupaşcu ST, Gu YD, Kasprzak W, Hwang CJ, Fields JR, et al. (2009) En intergeniske ikke-kodende rRNA korrelert med Expression av
rRNA Hotell og frekvens av en
rRNA
enkeltnukleotidpolymorfi i lungekreft celler. PLoS ONE 4 (10): E7505. doi: 10,1371 /journal.pone.0007505
Redaktør: Anita Brandstaetter, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 22 juli 2009; Godkjent: 30 september 2009; Publisert: 19 oktober 2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne publikasjonen er finansiert delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, i henhold til kontrakt nummer HHSN261200800001E. Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjer ved Institutt for helse-og omsorgs, heller ikke nevner av varemerker, kommersielle produkter, eller organisasjoner innebærer godkjennelse av den amerikanske regjeringen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Syntese av ribosomer krever en høy andel av cellulære ressurser og følgelig er svært regulert. Biogenesis av 45S ribosomalt RNA (rRNA) er hastighetsbegrensende for ribosom syntese og er nært kontrollert på flere nivåer. En økning i ribosomer er et felles trekk ved aktivt prolifererende celler, inkludert kreft celler, kan være induserbar ved onkogen aktivering eller inaktivering av tumor-suppressorer, og kan til og med være kreft-forårsakende [1], [2].
en ny type av rRNA regulator er nylig blitt oppdaget i musefibroblaster: en følelse ikke-kodende RNA (nc-rRNA) som stammer fra den intergeniske spacer regionen mellom
rRNA
tandem gjentatte genes.It ble vist å fungere som en negativ regulator av rRNA uttrykk [3], [4]. Mulig forekomst og betydningen av dette nc-rRNA i humane celler, i celler av epitelial opprinnelse, og i kreftceller har ikke blitt undersøkt. Vi undersøkt hvorvidt dette nc-rRNA kan bli funnet i humane lunge epitelceller og i humane lungekreftceller. Vi har også bemerket forekomsten av enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i
rRNA
gen blant cellelinjene, i sekvenser oppstrøms og nedstrøms av
rRNA
transkripsjon start stedet, og studert deres relasjoner til nc-rRNA nivåer og til potensielle folding av rRNA.
Resultater
enkeltnukleotidpolymorfi i
rRNA
nær transkripsjon start stedet
i mennesker, noen 400
rRNA
genkopier er ordnet i sett på tandem repetisjoner på 5 kromosomer [5]. Anordningen av 18S, 5.8S og 28S
rRNA
gener er vist skjematisk i fig. 1. Deres produkter er behandlet fra en 45S-rRNA-forløper, som begynner med et 5′-ytre transkribert sekvens; de første 414 nukleotider av denne utgjør en ledersekvens, og er den første del som skal fjernes [6]. Kjernen promoteren er lokalisert ved omtrent -45 til 18 i forhold til transkripsjonsstartsetet. Det er også regulatoriske forsterkerelementer i intergeniske avstandsstykker [anmeldt i 7] Hotell
NTS: ikke-transkribert spacer, også kjent som intergeniske regionen,. ETS: ekstern transkribert spacer; ITS: interne transkribert spacer. rRNA transkripsjon begynner ved 5 «enden av ETS, med de første 414 nukleotidene som omfatter ledersekvensen. Den ikke-kodende (NC) r-RNA-transkript er initiert oppstrøms for ETS.
Seks human lunge adenokarsinom-cellelinjer og en ikke-omformet udødeliggjort linje fra humant perifert lungeepitelet ble studert på det genomiske nivå. For hver cellelinje, ble 35-65 kloner av amplifiserte produkter for regionen -388 til 306 (i forhold til en transkripsjon start stedet) innhentet og sekvensert. I sammenligninger med sekvenser for en
rRNA
fra kromosom 22 (GenBank AL592188), blant de syv cellelinjer var det minst en SNP på 329 av de 694 områdene (47,4%). Detaljerte data er gitt i Utfyllende Tabell S1. Minst én SNP ble funnet i 68% til 90% av klonene fra de forskjellige cellelinjer (tabell 1). Prosentene var ikke signifikant forskjellig mellom linjene. Blant de SNP-positive kloner, gjennomsnittlig antall SNPs var 02.01 til 03.01, med ingen betydning forskjeller mellom cellelinjene. Prosentene av kloner stratifisert etter antall SNPs heller ikke variere betydelig over cellelinjer (tabell 1).
Vi avgjort om enkelte områder var mer sannsynlig å presentere en SNP enn forventet ved en tilfeldighet, for alle sju cellelinjer i sammenheng. Sannsynligheter hentet fra Poissonfordelingen indikert at forekomsten av SNPs i 6 eller flere kloner på et gitt sted var svært usannsynlig (P 0,0001) ved en tilfeldighet. Det var 12 slike områder (totalt antall av kloner i parentes): -234 (9) -233 (10) -181 (6) -104 (6) -96 (28) -72 (6), 52 (7), 139 (51), 144 (6), 207 (9), 225 (7), og 290 (6). Forekomster av disse hotspot SNPs i cellelinjene er vist i tabell 1. Av disse er flere er spesielt bemerkelsesverdig. Tre forskjellige SNP’er ble funnet på stedet -233 (T /A, T /C, eller delesjon, Supplementary tabell 1), med i det minste én SNP i hver cellelinje. Linje A549 hadde merkbart mer SNP’er ved -96 (22 SNP’er) og 139 (28 SNP’er), sammenlignet med de andre cellelinjer (tabell 1). SNP 139 i særdeleshet presentert høy frekvens på flere linjer.
Vi undersøkte statistisk om det var sekvens strekker hvor frekvensen av SNP var høyere eller lavere enn forutsagt ved en tilfeldighet. Den kjører test viste ingen slike strekninger for cellelinjer A549, H23, H1792, H2030, H2122, og HPL1D og for alle linjene i sammenheng. Men etter linjen H441 vurdert separat, fravær av SNP for regionene -232 til -180, og -94 til -26, var ikke forventet ved en tilfeldighet alene (P = 0,0072). Flere cellelinjer viste seg å oppvise en høy frekvens av SNP i området -239 til -228. Hele området ble delt inn i to lag, en potensiell SNP hotspot stratum -239 til -228, og den komplementære stratum består av de resterende områder. Poisson regresjon (med en utlignet parameter som tilsvarer antall nettsteder) ble brukt til å sammenligne priser på SNPs i disse to gruppene. SNP hastigheten var 3,7 ganger større i potensialet SNP hotspot stratum enn andre steder, P = 0,0010. Satsen øker var spesielt fremtredende for H1792, HPL1D, og H23 linjer:. 3.9, 7.3, og 9.0 ganger større henholdsvis (alle P values≤0.0002)
For de fleste cellelinjer var det flere tilfeller av mer enn en klon som presenterer det samme SNP (s), i de fleste tilfeller 2 eller 3 kloner. Det kan ikke avgjøres med sikkerhet om disse representerer separate alleler, eller flere polymerase kjedereaksjon (PCR) produkter fra samme allel. Det var en til tre slike dobbelte par i hver cellelinje, i tillegg til syv kloner i A549 inneholdende både -96 og +139 SNP’er (tabell 1). SNP -96 ble funnet bare i kloner med 139 SNP i A549 celler. I tillegg var det mange tilfeller av kloner med ett til tre identiske SNPs, pluss en til mange flere SNPs unike for hver klone. Disse klonene åpenbart representerer ulike alleler. I hver cellelinje var det 9 til 15 SNP nettsteder som er involvert i slike kombinasjoner, med unntak av H441 cellene der eneste stedet 139 ble funnet i syv slike variant kloner. Bortsett fra foreningen av SNP -96 med SNP 139 i
rRNA
kloner fra A549 celler, flere forskjellige SNPs syntes å skje tilfeldig i kloner fra denne og de andre cellelinjer.
i lys av frekvensen av SNP 139 og forskjellene mellom de cellelinjer, undersøkte vi forekomsten av en ytterligere teknikk. RNA ble isolert fra de syv cellelinjer oppført i tabell 1, samt ytterligere syv lunge adenokarsinom-cellelinjer (tabell 2). Sekvensen rundt posisjon 139 ble amplifisert ved PCR etter revers transkripsjon (RT) og frekvensen av de to allelene bestemmes kvantitativt ved pyrosekvensering. De ekstra fordelene ved denne tilnærmingen inkludert evaluering av uttrykk av allelene som rRNA og vurdering av hele befolkningen av molekyler, mens genomisk kloning undersøkt bare et tilfeldig utvalg. Resultatene (tabell 2) viste god overensstemmelse mellom de to metodene. Korrelasjonen mellom frekvensen på 139 SNP i genomisk
rRNA plakater (fastslått ved kloning) vs som i rRNA (bestemt ved RT-PCR og pyrosekvensering) er signifikant (P = 0,0073), noe som tyder på at begge allelene var like uttrykte. Der hvor det var forskjeller i frekvens, f.eks A549-celler, kan dette være et resultat av mindre nøyaktighet i beregningen av den frekvens ved kloningen analysen.
En ikke-kodende RNA transkribert fra
rRNA
oppstrøms for transkripsjonsstart nettstedet
en nc-rRNA fra
rRNA
intergeniske spacer ble nylig beskrevet for musefibroblastere [3], [4], men omfanget av den opprinnelige karakterutskriften ble ikke helt definert. Ved å bruke primere for området -244 til 203 i forhold til den menneskelige
rRNA
transkripsjons-startsetet, demonstrerte vi at en nc-rRNA for denne regionen ble transkribert av humane epitelceller også, inkludert både de ikke-transformerte celler og HPL1D lunge adenokarsinom A549-celler (fig. 2, region I). Den avskrift av nc-rRNA ble bekreftet ved sekvensering. For å bestemme oppstrøms start stedet for nc-rRNA ble flere primere benyttet, starter på -1772. Sekvenserings-bekreftede produkter ble oppnådd med primerne A-E (-1003 til -1), mens primerne F, G og H, som dekker flere oppstrøms-sekvenser, viste ingen produkter (fig. 2). Derfor transkripsjon av nc-rRNA påbegynt mellom -1225 og -1003.
Produktene ble også bekreftet ved DNA-sekvensering. Representative resultater er vist i cellelinjer HPL (udødeliggjort ikke-transformerte celler fra humant perifert lungeepitelet) og A549, en human lunge adenokarsinom-cellelinje. Resultater for kontroller utelate RT enzymet er vist i de nedre panelene. Posisjonene forsterket av spesifikke primere er illustrert nederst på figuren, med en som transkripsjonsstartsetet for rRNA. NC-rRNA ble oppdaget mellom -1003 og 203, men ikke mellom -1772 og -1225.
De mengder av dette nc-rRNA varierte i lungecellelinjer, med ni adenokarsinom cellelinjer utviser betydelig mer enn de ikke-omformet linjen HPL1D. En linje, A549, hadde signifikant mindre nc-rRNA, og nivåene var ikke signifikant forskjellig i tre linjer (figur 3A.)
* P. 0,05, ** P 0,01, signifikant forskjellig fra ikke- transform HPL celler. For 45s rRNA, tilsynelatende øker var av borderline betydning for H2122 (p = 0,062) og for H441 (P = 0,0595).
Siden i muse fibroblast celler
rRNA
intergeniske spacer ncRNA negativt regulerende effekt på rRNA [3], [4], kvantifisert vi samlet rRNA med real-time PCR etter RT. I forhold til HPL1D, syv cancerlinjer uttrykte betydelig mer rRNA, to vesentlig mindre, og fire var ikke signifikant forskjellig (fig. 3B). For tolv av de tretten lunge kreft cellelinjer, var det en betydelig negativ rang korrelasjon mellom nivåer av ncRNA og total rRNA transkripsjon (fig. 4). Uteliggeren cellelinje, H23, hadde de høyeste nivåene av total rRNA. En foreløpig konklusjon, for fremtidig leting, er at nc-rRNA og rRNA er funksjonelt koblet i de fleste av disse lungekreftceller. Ved analogi til deres forhold i musefibroblaster [3], [4], NC-rRNA kan være en negativ regulator av rRNA. I H23 avvikende, kan andre faktorer har større betydning i rRNA regulering.
Når avvikende linje H23 ble utelatt, den Spearman rang korrelasjonskoeffisient rho = -0,74, p = 0,0135 ved Spearman rank test.
Side 139 SNP korrelert omvendt med nc-rRNA
neste spurte om SNP 139, som skjedde i de fleste cellelinjer og variert betydelig blant dem, hadde et forhold til NC- rRNA og total rRNA uttrykk. Frekvensen av T til C genomisk SNP ved posisjon 139 i den opprinnelige panel av seks kreftcellelinjer hadde en betydelig negativ korrelasjon med rang nc-rRNA (Fig. 5A). Denne forening ble undersøkt i nærmere detalj ved bruk av hele panelet av cellelinjer og bestemmelse av SNP allel frekvenser i det uttrykte rRNA ved pyrosekvensering (se tabell 2). Med rRNA data for alle cellelinjer, var det igjen en betydelig negativ rang korrelasjon mellom SNP 139 frekvens og nc-rRNA-nivåer (fig. 5B).
A. Korrelasjon av den genomiske SNP bestemmes ved kloning i 6 humane lungekreft-cellelinjer, A549, H441, H23, H1792, H2030 og H2122 (se tabell 2) (Spear rang korrelasjonskoeffisient, rho = -0,89, p = 0,0409, av Spearman rank test). B. Korrelasjon av SNP som variant
rRNA
avskrift i 13 kreft linjer (Spearman rank korrelasjonskoeffisient, rho = -0,71, p = 0,0137, ved Spearman rank test).
sekundær strukturmodeller av rRNA-arter
Stabil sekundær struktur har blitt rapportert tidligere for 5′-ledersekvensen av rRNA [8], [9]. Vi vurderte om 139 SNP kan endre den sekundære struktur, og derfor den potensielle funksjonalitet, av rRNA eller transkripsjon av den nc-rRNA. Vi modellert co-transcriptional folding av ledersekvensen, 1-414, ved hjelp MPGAfold, inkludert enten U eller C på stedet 139. Det var 5 store stilk strukturer, som vi har betegnet som vist i fig. 6. Denne overordnede strukturen var stabil og konservert, noe som gir den samme base-paring mønster i 70 til 100% av kjøringer, som illustrert ved den blå eller magenta fargekoding i fig. 6. 139 området ligger i en lang stilk struktur, betegnet LL-motivet, som består av sekvenser inkludert 46-152 (som strekker seg så langt som 38-166 i noen modelleringsresultater). Egenskapene til det LL motiv med U- eller C ved stedet 139 er sammenlignet i tabell 3. SNP formen 139 var konsekvent, hvis noe, mer stabil, med et -2,7 kcal /mol fordel både i beste fri energi og dominerende fri energi i LL folder. To vanlige lokale varianter av LL motiv eksisterer, en hvori 139 stedet opptrer i en 5-nukleotid-stammen ved siden av en bule, og en annen hvor et uparet 140 U ved siden av 139 sløyfer ut (fig. 6), for en 3-sløyfe-2 stilk konfigurasjon. Som MPGAfold populasjonsnivå økes, vil hyppigheten av de bedre passform endelige strukturer som inneholder den 3-sløyfe-2-stammen innenfor LL motivet også økt, på bekostning av den mindre plass 5-basepar stammen (Tabell 3). Denne trenden ble kjent for både villtype 139 U og SNP 139 C, men sistnevnte beholdt en høyere prosentandel av 5-nukleotid konformasjon. De frie energier av begge conformations av 139 C var litt mer gunstig enn for de +139 U conformations. Dette kan godt være relatert til sammenkobling av 139 C til G ved 63.
Stilkene er fargekodet (skala vist) basert på deres frekvens i den endelige strukturen blant 20 runs på befolknings nivå på 128 K. uparet baser er svart. Den grunnleggende strukturen til venstre var sterkt konservert og var som vist i alle men 4/40 av det endelige forutsigelser. De stiplede bokser på høyre viste alternative konformasjoner av LL motiv rundt 139 språk, som er forskjellig for de 5 nukleotider på 60-64 og 138-142. For vill-type, 139 U (nederst stiplet boks), konformasjonen av disse nukleotidene som er involvert i hovedsak et 3-nukleotid-stammen og en repeterende ut ved U 140 (mørkeblå i diagrammet). Dette LL motivet varianten ble funnet i 80% (16/20) av de endelige strukturer, med E = -246,1 kcal /mol i alle unntatt en av disse. De LL motiv strukturer med de 5 nukleotider i oransje, alle som en del av stammen, var i mindretall, 20% (4/20) av alle løsninger (se tabell 3). Den fullstendige struktur illustrert var identisk for alle unntatt en av disse, med E = -245,9 kcal /mol. I motsetning til den SNP 139 C (topp stiplet boks) de to konformasjoner ble presentert i lignende mengdeforhold, 45% som 3-nukleotid-stammen (grønn), E = -248,8 kcal /mol, og 55% som den 5- nucleotide stammen (lys blå), E = -248,4 kcal /mol.
Vi har også modellert co-transcriptional folding av andre lengder av 5′-ledersekvensen (ikke vist). Blant disse var det 1-173 lengde, for å inkludere nucleolin bindingssetet, den første kjente stedet for spesifikke protein samhandling i 5′-leder. Sekvensen 1-700 ble undersøkt for å omfatte et område nedstrøms for 414 kjent for å påvirke leder spalting [6] og med et U3 bindingssete [10]. SNP på 139 derimot ikke signifikant folding av disse delene av rRNA. Til slutt brukte vi et annet program, Mfold, for å undersøke brutto strukturelle kjennetegn ved den store 5′-ekstern transkribert spacer (1-3655) og observert sterk bevaring av LL motiv og ingen langdistanse samhandling med nukleotider utenfor LL sub-domene som følge av nærvær eller fravær av 139 SNP (ikke vist). Mfold Resultatene viste også potensialet for dannelsen av de samme LL motivvarianter vist i fig. 6 av villtype og +139 SNP sekvenser.
I tillegg har vi undersøkt nc-rRNA, som strekker seg fra ca -1000 til minst + 300.Its nøyaktige omfanget fra transkripsjon start stedet nedstrøms kunne ikke målbart på grunn av overlapping med den vanlige rRNA karakterutskriften. I alle MPGAfold går modellering nc-rRNA -1000-414, ble LL motiv bevart og var ikke involvert i samhandling med sekvenser oppstrøms for transkripsjonsstart (ikke vist).
Diskusjoner
Vi rapporterer her at menneskelige epitelceller, inkludert lungekreft celler, som mus fibroblaster, uttrykker en ikke-kodende RNA fra intergeniske regionen i
rRNA
genet, og at en negativ regulerende rolle er muligens underforstått , siden det var en negativ sammenheng mellom nivåene i nc-rRNA og total rRNA i de fleste av de menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer undersøkt.
Videre observerte vi en interessant sammenheng mellom en nc-rRNA SNP og nc -rRNA nivåer. Sekvensene av de multiple kopier av
rRNA
gener er konservert blant individer av en art og i individer, et fenomen spekulert å representere den samordnede evolusjon drives ved flere mekanismer, inkludert intrachromosomal rekombinasjon og interchromosomal gen omdannelse [5], [ ,,,0],11]. Enkelte variasjoner har vært nevnt, spesielt i mindre evolusjonært konserverte regioner og i 28S-komponenten av genet [12], [13]. Disse endringene stort sett involvert gevinst eller tap av gjentatte segmenter, selv om enkelt nucleotide forskjeller har også blitt bemerket [14] – [16]. Ingen funksjonell betydning har ennå blitt tildelt disse forskjellene i atom
rRNA
. Men flere mordyret-arvet punktmutasjoner i mitokondrienes
rRNA
disponere barn til ototoksisitet av antibiotika aminoglykosider, ved en ufullstendig forstått mekanisme som involverer mitokondriemembran permeabilitet og apoptose [17] -. [19]
i vår studie ble nc-rRNA funnet å strekke seg inn i 5’ETS leder regionen, forbi området 139, og forskjeller i hyppigheten av 139 C blant cellelinjer korrelerte negativt med nivåer av nc-rRNA. På grunnlag av disse betraktningene, postulere vi at 139 C SNP har en negativ regulatorisk effekt på enten transkripsjon frekvensen av den nc-rRNA, eller på dens stabilitet, og at ncRNA i sin tur regulerer rRNA negativt.
I muse fibroblast celler studert av Mayer et al. [3], [4], den ncRNA uttrykt fra den intergeniske region av
rRNA-genet
forårsaket en reduksjon i rRNA transkripsjon som et resultat av interaksjon med nukleolært ombygging komplekset og endret DNA og histon metylering. Nærmere bestemt, ble sekvensen -127 til -39 implisert [4]. Sekvenser nedstrøms transkripsjonsstartsetet ble ikke studert; vidt disse kan operere med en tilsvarende mekanisme vil kreve videre studier. Ikke-kodende RNA har vært implisert i kontrollen av gen-ekspresjon ved forskjellige mekanismer [gjennomgått i 20] – [22]. I minst to tilfeller, har det blitt rapportert at regulerings lange ikke-kodende RNA, initiert oppstrøms, strekker seg over transkripsjons-initieringssetet, som observert i våre resultater. Disse lang nc-RNA er inkludert en interfererende transkripsjon fungere som en negativ repressor av det humane dihydrofolatreduktase-genet [23], og en trans-promoter transkripsjon aktivering av fruktose-1,6-bisfosfatase-genet i gjær fisjon [24].
Det har vært en publikasjon som peker til en funksjonell forskjell mellom SNPs i menneskelig
rRNA product: [25]. I menneskelige HaCaT keratinocytter i kultur, ble SNPs lokalisert i regionen rundt transkripsjon start stedet for
rRNA
. I kromatin immunoutfellingsstudier analyser, frekvenser av SNPs var signifikant forskjellig i
rRNA
genområder immunoutfelt med Upstream Binding Factor (UBF) eller med Poli, vs som kombinert med transkripsjonsfaktor basonuclin. I regionen -101 til -52, samlet SNP frekvens var ganske lav i
rRNA
genet assosiert med UBF eller Poli og betydelig høyere i basonuclin-assosiert
rRNA
. Denne regionen omfatter -96 SNP i vår studie, som skjedde i en høy prosentandel av A549 kloner. Mangel på SNPs i UBF-assosiert sekvensen er bemerkelsesverdig i lys av den promiskuitet av binding av UBF hele
rRNA
genet og dets regulatoriske regioner [26]. Det kan være av interesse å finne ut om økt basonuclin /UBF bindende forholdet skjer i A549-cellelinjen. Basonuclin er uttrykt i epitel samt kjønnsceller [27] og er sterkt økt i basalcellekarsinom av huden [28].
Ytterligere bevis for funksjonelle forskjeller mellom
rRNA
genvarianter kommer fra en studie i mus [29]. Syv varianter ble identifisert på grunnlag av rflp og inkluderte to SNP’er i promoterregionen. Variant SNP’er i 5′-ETS ble anvendt for å undersøke ekspresjon i bestemte voksen musevev ved kvantitativ PCR. Tre varianter ble universelt uttrykk (inkludert ett på ulike nivåer blant vev), to ble ikke påvist i noen vev, og to ble funnet bare i visse vev. Disse resultatene var konsistente med tidligere cytologiske analyser av sølvfarging av nukleolære organiser regioner for ulike kromosomer i humane celler: fibroblaster og leukocytter variert med hensyn til hvilke kromosom klynger av
rRNA
gener var mest aktive [30], og det var forskjeller mellom klynger i respons til den stimulerende effekten av serum [31].
nc-rRNA, uttrykt fra intergeniske regionen i museceller og i samspill med nukleolært ombygging kompleks, har nylig blitt kalt pRNA ( promoter RNA), og ble spådd av datamodellering for å ha en stabil hårnål sekundærstruktur, som var sammenlign sekvens fra den menneskelige
rRNA
promoter [4]. Når Mayer et al. [4] muterte tandem GC par i pRNA (ved basepar tilsvarende områder -59 til -61 og -118 til -120 i primærsekvensen som brukes av oss), observerte de en stor effekt på sekundærstruktur, eliminering av en stamme -loop konfigurasjon, og oppheving av spesifikk binding til Tip5 proteinet i nukleolært remodeling komplekset. Vi sjekket om en tilsvarende endring i sekundærstruktur kan følge med 139 SNP. Datamodellering av rRNA strukturer indikerte at nettstedet 139 er lokalisert i et stabilt, energisk favoriserte stammen strukturen vi kalt LL motiv. Co-transkripsjonell modellering indikerte at 139 U til C SNP hadde en relativt liten, men muligens signifikant effekt på lokal struktur, med den C-substitusjon gir større stabilitet (generelt lavere fri energi) og øket frekvens av en 5-nt stammen i stedet for en 3-nt stammen. Hvorvidt dette conformational forskjellen kan påvirke funksjonelle interaksjoner av LL motiv vil kreve videre studier
En annen mulig forklaring på de spesielle effektene av området 139 SNP kan finnes i DNA sammenheng. Dette området ligger i et konservert kjerne steroid respons element, TGTTCT, for klasse i hormonreseptorer, inkludert de for glukokortikoider, androgener, mineralkortikoider og progesteron. Endring av T til C på stedet 139, den tredje posisjon i dette elementet, vil sannsynligvis eliminere hormonreseptor binding: utskifting av denne T med A avskaffet svar på alle klasse jeg hormonreseptorer [32]. Også muligens relevant er tilstedeværelsen bare nedstrøms 139, ved 159-167, av en bindende element for nucleolin, en stor vekst regulatoriske, RNA-bindende protein [33], [34].
I tillegg til 139 T /C SNP, oppdaget vi 11 andre steder hvor SNPs ble funnet oftere enn forventet ved en tilfeldighet. Ingen av disse forekom ofte nok for korrelasjoner med cellulære egenskapene som skal forsøkt. Disse SNPs kan ha funksjonell betydning, eller kan bare være på steder som er spesielt tolerant av endret rekkefølge. Sekvensene i regionen av human
rRNA-
gen som regulerer transkripsjon inkluderer den essensielle kjernen promoteren, ca -45 til 18, som er avgjørende for transkripsjon, og en oppstrøms kontrollelement som starter ved omtrent -200, inklusive kritisk T
o elementet ved -165 til -175 [35], [36]. Ingen SNP’er forekom i noen av våre lungecellelinjer fra -13 til -4; endringer i dette område kan ikke være funksjonelt tolereres. Vi bemerket SNP hotspots i oppstrøms kontroll element, ved -181, -104, -96 og -72. Punkt -104 er en del av et bindingssete, TCGCGC, for medlemmene av E2F transkripsjonsfaktor familien. Komplekse effekter på
rRNA
transkripsjon, både positive og negative, har blitt tilskrevet E2F1, E2F4, og E2F6, når undersøkt i transfekterte humane lunge adenokarsinom H358-celler [37], [38]. Det er mulig at erstatning av -104 T med C reduserer undertrykkende virkninger eller forsterker induksjon virkningen av ett eller flere familiemedlemmer E2F.
polymorfismer ved -96, alt erstatte en T til en C, elimineres en CpG stedet, der metylering kan oppstå. Endringene i -72, alt erstatte en C for en T, opprettet en CpG nettsted. I en fersk studie med humane HeLa kreftceller, 27 CpG områder i oppstrøms kontrollelementet og kjerne formidler av
rRNA
var generelt svært denaturert, men i DNA immunoutfelt med antistoff mot Poli disse områdene hadde redusert eller fraværende metylering [39]. Dette inkluderte nettstedet -96 og en på -75. Muligens tap av -96 CpG kunne øke konstituerende binding av poli. Dette vil være av særlig viktighet i A549-celler, hvor nesten halvparten av klonene viste denne endringen. En sammenlignende studie av menneskelige leverkreft vs normal matchende leveren, som finnes i kreft, betydelig hypometylering av alle de
rRNA
oppstrøms CpG områder mellom -137 og -59, inkludert -96 [40]. Også i en DNase fotavtrykk assay området -96 ble plassert mellom to områder som beskyttes av UBF, og viste forbedrede DNA-spalting [41].
Det er også blitt bemerket at humane og muse ytre og indre transkriberte avstandsstykker ha en høyere prosentandel av AA og GA dinukleotider, og en lavere andel av AT, CA, og TA dinukleotider, enn forventet ved en tilfeldighet [8]. Disse kan ha spesielle roller og kan forventes å bli konservert. Fem av hotspot SNPs i vår studie resulterte i gevinst eller tap av en av disse fem dinukleotidpolyfosfater parene. Av særlig mulig betydning er sju A /G SNPs på 52, som konverterer en GA og en AT til nøytral GG og GT; og ni G /A SNPs på 207, alt i cellelinje H23, noe som resulterer i etableringen av en GA dinucleotide.
I sammendraget, en nc-rRNA, som omfatter
rRNA
genet transkripsjons-startsetet, ble uttrykt i humane lunge adenokarsinom-celler og var negativt korrelert med hyppigheten av en T /C SNP ved stedet 139 i ledersekvensen til 5′-ETS. For de fleste cellelinjer, ble NC-rRNA også negativt korrelert med det totale 45s rRNA. Nylig kjemikalier målretting transkripsjonsfaktorer for
rRNA
har vist lovende for behandling av kreft [42], [43]. Videre mulig redusert uttrykk av rRNA i hjernen, på grunn av hypermethylation, var knyttet til risikoen for selvmord [44]. I det siste har det blitt foreslått at økt rRNA grunn trisomy av kromosom 21 bidrar til Downs syndrom [45]. Dermed variasjon i rRNA har relevans for flere menneskelige helseproblemer.
