Abstract
anstand nucleophosmin (NPM1) er over-uttrykt i epiteliale rommet prostatakreft sammenlignet med tilstøtende sunn epitel og kan representere en av de viktigste aktørene som støtter neoplastiske fenotype av prostata adenokarcinomceller. Likevel, de mekanismene som ligger til grunn NPM1 mediert fenotype forblir unnvikende i prostata. For bedre å forstå NPM1 funksjoner i prostatakreftceller, forsøkte vi å karakterisere dens innvirkning på prostatakreft celler atferd og tyde mekanismer som det kan virke. Her viser vi at NPM1 favoriserer prostata svulst celle migrasjon, invasjon og kolonidannende. Videre knockdown av NPM1 fører til en reduksjon i veksten av LNCaP-tumorer avledet podet i nakne mus
in vivo
. Slike onkogen-lignende egenskaper er funnet i forbindelse med en positiv regulering av NPM1 på ERK1 /2 (Ekstracellulær signal-regulerte kinaser 1/2) kinase fosforylering som respons på EGF (Epidermal Growth Factor) stimulus, noe som er kritisk for prostatakreft progresjon etter innstilling av en autonom produksjon av vekstfaktoren. NPM1 kan da være et mål å slå av spesielt ERK1 /2 pathway aktivisering for å redusere eller hemme kreftcellevekst og migrasjon
Citation. Loubeau G, Boudra R, Maquaire S, Lours-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et al. (2014) NPM1 lyddemping Reduserer Tumor Vekst og MAPK Signale i prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10,1371 /journal.pone.0096293
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 9. oktober 2013, Godkjent: 06.04.2014; Publisert: 05.05.2014
Copyright: © 2014 Loubeau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) og av regionen Auvergne. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av prostatakreft er assosiert med endringer av viktige gener som styrer celle homeostase, deres deregulering og /eller forsterkning fører til økt celledeling og invasive kapasiteter. Vi har tidligere identifisert
NPM1 plakater (nucleophosmin 1) som en av de gener hvis ekspresjon er betydelig økt i prostatatumorceller sammenlignet med ikke-tumor tilstøtende vev [1], noe som indikerer at NPM1 kan fungere som en forsterker av prostata kreft progresjon. NPM1 er et stort multifunksjonelt fosfoprotein akkumulert på høyt nivå i kornet regionen i kjerne og er i stand til skyss mellom kjerne, nukleoplasma og cytoplasma [2]. På grunn av sin nukleolært lokalisering, dens iboende RNase aktivitet og sin tilknytning til modning pre-ribosomale ribonucleoproteins har NPM1 vært først foreslått å regulere ribosomalt RNA transkripsjon og behandling. Men NPM1 har blitt mer nylig demonstrert for å vise anstand aktiviteter. Det binder seg til histoner, favoriserer DNA-histon montering, formidler nucleosome dannelse og slapper kromatin [3] og dermed kontrollere genuttrykk. NPM1 samvirker også med et bredt spekter av foreldrekontroll proteiner til å indusere deres riktige folding i aktiv tilstand. Blant disse proteinene, det er cellevekstregulerende midler som oncoproteinet MDM2 (Mouse Double Minute to homolog). Videre NPM1 binder seg til og hemmer tumor p53 og Rb (Retinoblastoma) [4] fremhever at NPM1 kan ha en rolle i onkogene prosesser. Noen av de NPM1 spesifikke interaksjoner med cellesyklus regulatorer har allerede er klarlagt, men dens rolle i oppførselen av faste tumorceller, så vel som dens integrasjon i cellen signalosome er ennå ikke bestemt. Her tar vi spørsmålet om NPM1 kan forsterke spredning, migrasjon og invasjon kapasiteter på prostata kreft celler. I denne studien rapporterer vi at nivået av NPM1 i prostatakreftceller spesifikt regulerer EGF uttrykk og MAPK (Mitogen Aktivert Protein kinaser) signalveien. Vi viser også at høye nivåer av NPM1 positivt påvirke celledeling og cellemigrasjon, og dermed delta i kontrollen av tumorvekst.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyr ble opprettholdt i et kontrollert miljø og dyr omsorg ble gjennomført i samsvar med de nasjonale standardreglene (C 63 014,19). Alle forsøkene ble godkjent etiske komité, Frankrike (protokoll CE09-08) Auvergne Regional.
Cell kultur og stabil transfeksjon
LNCaP (Lymph Node Carcinoma Prostata) celler ble dyrket i fenol rødt Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, Frankrike) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) og inkuberes i standardbetingelser (37 ° C, 5% CO
2).
Celler ble smittet i henhold til produsentens instruksjoner med lentiviral partikler som inneholder enten tre mål spesifikke konstruksjoner (shNPM1) eller urelaterte sekvenser (shScr, srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland). Etter infeksjon, puromycine (1 mikrogram /ml) ble tilsatt til kulturmediet for å velge stabilt transduced celler og utføre monoklonalt utvalg.
Sårtilheling migrasjon analysen
Kontroll LNCaP celler (shScr ) og NPM1 banket ned LNCaP-celler (shNPM1) ble sådd ut i 24-brønner plater og dyrket til konfluens i 24 timer. Den monolagskultur ble deretter skrape-såret med en steril mikropipette spissen for å danne et gap med konstant bredde. Cellular rusk ble vasket med fosfatbuffret saltvann 1 × (PBS) (Life Technologies). Celler ble deretter dyrket i RPMI 1640-10% FBS ble erstattet 12 timer etter at såret, og deretter hver 24. time. LNCaP cellemigrasjon ble fotografert inn i såret regionen på 24, 48 og 72 timer etter skraping (100 × forstørrelse) og gjenværende sår områder ble deretter kvantifisert med ImageJ fri programvare.
Boyden Chamber invasjonen assay
for cellemigrering assay, 3 x 10
5 shScr og shNPM1 LNCaP-celler dyrket i serumfritt RPMI 1640 ble podet inn i det øvre brønn i en transwellkammersystem. Medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering i 24 til 48 timer ble de ikke-migrerte celler som fjernes med den øvre brønnen. Cellene som migrerte til den nedre innsatsen overflate ble deretter fiksert med metanol og farget med en 5% Giemsa-løsning. Fem tilfeldige felt ble fotografert (200 × forstørrelse) og cellene ble kvantifisert med ImageJ fri programvare som gjennomsnitt ± SD kolonier telles per felt.
Myke agar-kolonidannelse analyser
Six-brønner plater ble forberedt med 2 ml /brønn av en varm løsning på 0,6% lavt smelte agarose (agarose Sea Plakk FMS produkt lavt smelte, 50101, Lonza, Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Frankrike) i RPMI 1640, 10% FBS. Etter størkning, ble 5 x 10
3 av shScr eller shNPM1 LNCaP-celler sådd ut pr brønn i en oppløsning av 500 mL av 0,3% agarose i RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS. Platene ble deretter inkubert i RPMI 1640, 10% FBS medium som ble skiftet hver 3-4 dag. Etter 2 uker, ble kolonidannelse kvantifisert ved hjelp av ImageJ fri programvare: kolonier ble fotografert (100 × forstørrelse) på 5 ulike felt, og den relative kolonien nummer ble beregnet som gjennomsnitt ± SD av koloniene telles per felt
klonogene analysen
1 × 10
4 shScr og shNPM1 LNCaP celler ble sådd i 6-brønner plater i RMPI 1640, 10% FBS medium. Medium ble endret etter 3 dager. Etter 2 uker, ble mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS 1 x så fiksert med metanol og farget med en 5% Giemsa-løsning. Foci formasjonen ble evaluert og kolonidannelse ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ fri programvare: kolonier ble fotografert (100 × forstørrelse) på 5 ulike felt, og den relative kolonien nummer ble beregnet som gjennomsnitt ± SD av koloniene telles per felt
Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble fastsatt ved hjelp Celleproliferering ELISA BrdU (bromdeoksyuridin) kolo kit (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet 5 × 10
3 shScr eller shNPM1 LNCaP celler per brønn ble sådd i en 96-brønner plate. De ble dyrket i 24 timer i RPMI 1640 medium, 10% FBS i nærvær eller fravær av EGF (E9644, Sigma). Deretter ble BrdU-merking-løsning tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 uM i 2,5 timer. Etter fiksering ble cellene inkubert med anti BrdU-POD-løsning i 1 time, og absorbansen ble målt ved 655 nm.
Western blotting
Proteiner ble ekstrahert ved bruk av HEPES 20 mM, NaCl 0,42 M , MgCl
2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, og Nonidet P-40 1% supplert med fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) 1 mm (Sigma), proteasehemmere (Komplett 1X, Roche), NaF 0,1 mm, og Na
3VO
4 0,1 mm (Sigma). Førti mikrogram av totale proteiner ble deretter utsatt for denaturering SDS-PAGE og overført til nitrocellulose Hybond-ECL membran (GE Healthcare og biovitenskap, Velizy-Villacoublay, Frankrike). Påvisninger ble utført ved hjelp av antistoffer dannet mot β-actin (A2066, Sigma), NPM1 (sc-6013-R, Santa Cruz, Heidelberg, Frankrike), EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, NB100596, Novus), fosfor-EGFR Tyr 1068 ( 2236S, Cell Signaling, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike), fosfor-ERK1 /2 p42 /44 (9101S, Cell Signaling, Ozyme) AKT (9272, Cell signalering, Ozyme), fosfor-AKT Ser 473 (2118-1 Epitomics) og avslørte med peroksidase-konjugert anti-kanin IgG (immunoglobulin G, PARIS, Compiègne, Frankrike) med en vestlig Lightning System kit (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, Frankrike). Signal kvantifisering ble utført ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad).
Arrangøren konstruere, transfeksjon og luciferase analysene
Den menneskelige EGF promoter fragment (-392 /+ 123) ble generert med følgende primere: 5′-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 «(fremover) og 5′-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3» (revers), så klonet inn i Hindlll /Xhol-restriksjonssetene i et pGL3-basisvektor (Promega, Charbonnieres, Frankrike). Konstitutivt aktiv MAP kinase kinase kinase1 (caMEKK1) uttrykk plasmid var en slags gave fra Dr. Dirck Bohmann (University of Rochester Medical Center, Rochester, USA). shScr og shNPM1 LNCaP celler ble transfektert 24 timer etter såing med pGL3-hEGF og /eller caMEKK1 plasmider i OPTI-MEM hjelp Metafectene transfektant i henhold til produsentens instruksjoner (Biontex, Martinsried-Planegg, Tyskland). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene lysert i lyseringsbuffer reporter 1 x (Promega) og luciferase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av luciferase Genofax Et analysesett (Yelen, må passes la Redonne, Frankrike).
Fremstilling av RNA og sanntids kvantitativ PCR
Total cellulær RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Life Technologies) og cDNA ble syntetisert med 200 U Moloney murine leukemi virus-revers transkriptase (Promega), 5 pmol av tilfeldige primere ( C1181, Promega), 40 U RNasin (Promega), og 2,5 mM deoksynukleotidtrifosfat. mRNA nivåer ble kvantifisert på en Mastercycler ep Realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, Frankrike) med Mesagreen QPCR Mastermix Plus for SYBR (Promega). Sekvensen av prim er følgende: NPM1, 5′-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 «(fremover) og 5′-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3′ (revers); PCNA, 5»-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 «(Forward) og 5’ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3′ (revers), Actin, 5»-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 «(Forward) og 5’TCACCGGAGTCCATCACGA-3» (revers) (Eurogentec, Angers , Frankrike). For human EGF, ble primere kjøpt fra Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike).
In vivo
Nude mus tumor xenograft modell
ShScr og shNPM1 LNCaP cellene ble dyrket til konfluens og deretter resuspendert i matrigel (BD matrigel basalmembran matrise fenol rød fri, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike) til en konsentrasjon på 9 x 10
6 celler /ml. Tre hundre ul av cellesuspensjonen (ca. 3 x 10
6 celler) ble injisert subkutant i 6 uker gamle nakne mus (Swiss nu /nu, Charles River, L’Arbresle, Frankrike). Sykdomsprogresjon ble overvåket daglig, basert på et sett av generelle velvære kriterier satt av dyr omsorg komiteen, og kroppsmasse ble spilt tre ganger i uken til en forhåndsbestemt endepunkt ble nådd. Endepunkter inkluderte: dehydrering og /eller vekttap på over 10%, noe bevis av åndenød, kroppsvekt økning på over 5 g fra gjennomsnittet. Svulster ble målt tre ganger i uken ved hjelp av et elektronisk skyvelære siden håndgripelig svulster var synlig. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon etter gassanestesi. Xenotransplantater ble deretter fjernet, veiet og hurtigfrosset i flytende nitrogen for RNA og proteinanalyser.
Statistical Analysis
Alle analyser ble utført i minst 3 uavhengige eksperimenter. Standardfeil ble beregnet for hver gjennomsnittet, og statistiske forskjeller mellom gruppene ble bestemt av Student
t
test eller ikke-parametrisk Mann Whitney U test med Prism programvare. For langsgående analyser, ble et tilfeldig effekt modellen (blandet modell) anses for å studere den faste effekter gruppen (NPM1 uttrykk), tidspunkter og samhandling gruppe × tid å ta hensyn til både mellom og innenfor individuell variasjon (tilfeldige effekter helling og skjæringspunkt).
Resultater
NPM1 regulerer klonogene og proliferativ kapasitet på prostata kreftceller
for å analysere effekten av NPM1 på prostata svulst celle spredning, valgte vi en knockdown strategi og genererte LNCaP celleunderlinjer som stabilt uttrykker kontroll (shScr) eller NPM1 spesifikk shRNA (shNPM1). Som vist i figur 1a, minsker NPM1 mRNA nivå med mer enn 50% og NPM1 protein ekspresjon av mer enn 30% i shNPM1 celler, men dette er ikke assosiert med endringer i cellemorfologi. Imidlertid endrer NPM1 knockdown evne LNCaP-celler til å danne kolonier etter utsåing ved lav konfluens (figur 1b). Denne reduksjonen av klonogene kapasiteter sammenfaller med en nedgang i celle proliferative potensial (figur 1c). Faktisk er nedregulering av NPM1 fører til en reduksjon i BrdU-inkorporering 30%, og dette er forbundet med en reduksjon i mRNA-nivået av PCNA (Former cell nuclear antigen), en nøkkel markør av celleproliferasjon (figur 1d) 60%. Interessant, NPM1 knockdown ikke forandre celleoverlevelse som vurderes av PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) spalting analyser ved western blotting (fig S1), og således indikerer at denne reduksjon i formeringshastigheten ikke er assosiert med en økning av apoptose. Disse resultatene viser derfor at NPM1 er involvert i økningen av spredning og klonogene kapasiteter på prostata tumorceller.
(a) NPM1 knockdown endrer ikke LNCaP-celler morfologi. LNCaP celler ble stabilt transfektert med kontroll shRNA (shScr) eller spesifikke NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 mRNA og proteinnivåer ble analysert ved henholdsvis RT-qPCR og western blotting. Morfologi av celler ble observert ved mikroskopi invertert og fotografert. (B) NPM1 knockdown hemmer LNCaP celler clonogenicity. Celler ble utsådd ved lav konfluens i løpet av en uke, deretter fiksert med metanol og farget med 5% Giemsa blå før mikroskopisk observasjon. Bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter med konsistente resultater. Grafen representerer antallet cellekloner (mer enn 50 celler) i shNPM1 tilstand, beregnet som gjennomsnitt ± SD av antall kloner telles per felt, på 5 tilfeldige felt, ved hjelp av ImageJ fri programvare og uttrykt relativt til antall av kloner telles i kontroll tilstand. (C, d) NPM1 kontroller spredning av prostata kreft celler. Fem tusen celler ble sådd per brønn i en 96-brønner plate og dyrket i 48 timer. (C) Cellene ble deretter inkubert med BrdU en merking løsning i 2,5 timer og BrdU-inkorporering ble målt ved densitometrisk analyse ved 655 nm. (D) Proliferasjon ble også analysert ved RT-qPCR-analyse ved å evaluere PCNA relative mRNA-nivå opphopning normalisert ved hjelp av β-aktin mRNA-nivå. Alle data er representative for minst tre uavhengige eksperimenter og triplikate BrdU-inkorporering som gjennomsnittet av triplikate eksperimenter av 96 poeng hver. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
NPM1 innvirkning på proliferasjonen er assosiert med kontroll av migrasjon, invasjon, tredimensjonal vekst kapasiteter på prostata kreftceller og tumorvekst
de ovenfor angitte resultater viser at NPM1 utøver en kontroll på klonogene kapasiteter for prostatakreft-celler og viser at, i tillegg til dets virkning på celle proliferative hastighet, kan det også bidra til både tumorvekst og aggressivitet. For ytterligere å vurdere rollen til NPM1, undersøkte vi invasjonen og migrasjon kapasitet på shNPM1 LNCaP celler. Knockdown av NPM1 betydelig redusert invasjonen av LNCaP cellene gjennom Matrigel-belagte filtre med 40% (figur 2a). Vi vurderte videre LNCaP celler migrasjon evne ved fysisk såret celler belagt på cellekulturplater. Som vist i figur 2b, i 72 timer etter å ha blitt skrubbet, shNPM1 celler var ikke i stand til å recolonize utarmede sone som raskere som gjorde kontrollcellene. For å teste om nedgangen migrasjon og invasjon kapasitet er ledsaget av en reduksjon av de tredimensjonale vekst evner shNPM1 LNCaP celler,
in vitro
tester i myk agar ble utført (figur 2c). Nedgang i NPM1 i LNCaP celler opphever nesten deres evne til å danne 3-D kolonier. Resultatene fra
in vitro
analyser tyder sterkt på at NPM1 regulerer trekk og invasive egenskapene til prostata kreft celler.
(a) NPM1 styrer vandringskapasitet på LNCaP celler. Celler ble sådd ut ved konfluens for å skape et sår 24 timer senere. Sår kolonisering ble observert etter 72 timer med kultur av invertert mikroskopi og fotograferte. Histogrammene viser sår området kvantifisering bruker ImageJ og bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter med konsistente resultater. (B) NPM1 knockdown hemmer invasiv potensialet i prostatakreftceller. shScr og shNPM1 LNCaP-celler ble sådd ut ved konfluens i RPMI 1640 serumfritt medium på matrigel belagte mikroporøs membran. 48 timer senere, migrerte celler tilstede på den motsatte side av membranen ble fiksert og farget med 5% Giemsa blå og observert ved mikroskop (200 x forstørrelse). Grafen representerer antallet celler i shNPM1 tilstand, beregnet som gjennomsnitt ± SD av antall celler tellet per felt, på 5 tilfeldige felt, ved hjelp av ImageJ fri programvare og uttrykt relativt til antall celler tellet i styretilstand . (C) NPM1 virkninger tredimensjonale vekst av prostata kreft celler. Kontroll eller NPM1 slås ned celler ble sådd ved lav konfluens på agarose /RPMI 1640 10% FBS i 2 uker. Antall og størrelse på de nye kloner ble deretter observert etter invertert mikroskop (x100) og fotograferte. Grafen representerer antallet cellekloner (mer enn 50 celler) i shNPM1 tilstand, beregnet som gjennomsnitt ± SD av antall kloner telles per felt, på 5 tilfeldige felt, ved hjelp av ImageJ fri programvare og uttrykt relativt til antall av kloner telles i kontroll tilstand. (D, e, f, g) NPM1 knock-down opphever tumourigenicity av LNCaP-celler når de injiseres i nakne mus. shScr (n = 14) og shNPM1 (n = 14) LNCaP-celler ble subkutant transplantert i nakne mus og tumorvolum ble målt etter 2 dager etter innpoding (d). Graf i (e) er kvantifisering av shScr og shNPM1-avledet svulster volum på dag 24 etter injeksjonen. NPM1 relative ekspresjonsnivået ble undersøkt ved western-blotting i tumorer når mus ble avlivet (f) og tumorvekten ble målt (g). Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
For å finne ut hvilken rolle NPM1 i prostatakreft videre, vi analyserte tumorgenesen av shNPM1 LNCaP og shScr LNCaP prostata kreft cellelinjer
in vivo
etter subkutan injeksjon i flanken av mannlige nakne mus. ShNPM1 cellene produserer mindre tumorer (figur 2d, e) og, i motsetning til shScr LNCaP-celler, er det mer sannsynlig å produsere ingen svulst i det hele tatt når podet (figur 2e). I detalj, tumorer initiert fra LNCaP kontrollceller vises ved 22 dager etter injeksjon, mens tumorer med opprinnelse fra LNCaP shNPM1 celler er merkbar bare ved 24 dager etter injeksjon. Videre vekstkurver aldri få paralleller selv etter 29 dager (figur 2d). Dermed svulster initiert fra NPM1 slått ned cellene forble mindre enn kontroll svulster med 85% reduksjon av gjennomsnittlig tumorvolum (figur 2e). Denne viktige reduksjon av tumorvolumet resulterer i en reduksjon av tumorvekt 95% fra LNCaP shNPM1-celler (figur 2G). Denne reduksjonen er usannsynlig på grunn av tap av uttrykk for anti-NPM1 shRNA siden alle shNPM1 svulster bevare en 90% reduksjon i NPM1 akkumulering (figur 2f). Samlet utgjør disse data viser tydelig at NPM1 er involvert i prostata tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
.
NPM1 er involvert i kontrollen av EGF uttrykk
for å bedre forstå hvordan NPM1 kan fremme prostata kreft celle atferd, vi utførte en qPCR Array analyse (RT2 ProfilerTM array, PAHS-121A-2, Qiagen) og bestemt art av gener som transkripsjon nivåer er modulert av knockdown av NPM1 (data ikke vist). Blant de 84 gener flekket på matrisen, epidermal vekstfaktor (EGF) mRNA-akkumulering var den mest signifikant redusert i LNCaP-celler shNPM1. Denne modulering av EGF uttrykk ikke resulterer fra en global hemmende effekt på genekspresjon som de fleste av genene som er upåvirket eller oppregulert når NPM1 minskes (data ikke vist). Dette resultatet ble bekreftet av RT-qPCR analyser som EGF mRNA akkumulering er redusert med 40% i LNCaP shNPM1 celler (figur 3a). Dessuten, for å teste den relative aktivitet av EGF-promoteren er genaktivitet i LNCaP shSCR og shNPM1 celler, transfektert vi disse cellene med en phEGF-luciferase reporter plasmid. Knockdown av NPM1 induserer en reduksjon i EGF promoteraktivitet, som viser at effekten av NPM1 er sannsynlig å bli utøvet på transkripsjonsnivå (figur 3b). Disse resultatene tyder på at NPM1 direkte eller indirekte kontrollerer EGF uttrykk. Som EGF er kjent for spesifikt å aktivere EGF-reseptor (EGFR), undersøkte vi hvorvidt aktivering av EGFR komplekset så vel som aktivering av nedstrøms effektorer, ERK1 /2 og AKT, moduleres av NPM1 ekspresjonsnivå. Basert på analyse av deres fosforylering status, viser vi at aktiveringen av EGFR (pEGFR) og av ERK1 /2 (pErk1 /2) blir dramatisk redusert eller nesten opphevet når ekspresjonen av NPM1 inhiberes (figur 3c). Interessant er AKT-fosforylering mindre følsom overfor en slik inhibering, noe som tyder på at NPM1 spesifikt påvirker MAPK-reaksjonsveien (figur 3c). Disse effektene av NPM1 på EGF uttrykk og ERK1 /2 pathway sterkt at NPM1 kunne være involvert i innstillingen av EGF selvregulering loop.
(a) NPM1 styrer EGF uttrykk. Relative EGF mRNA-nivåer sammenlignet med p-aktin ble analysert ved RT-qPCR i LNCaP-celler som uttrykker kontroll (shScr) eller NPM1 spesifikk shRNA (shNPM1). (B) NPM1 kontroll EGF promoter aktivitet. shScr og shNPM1 LNCaP-celler ble transfektert med den phEGF-luciferase reporter plasmid. EGF-promoter-aktivitet ble evaluert ved å måle luciferase-aktiviteten 24 timer senere. Resultatene av analysen ble standardisert ved bruk av CMV-promoteren som kontroll og uttrykt som fold-induksjon enn kontrollcellene (shScr). (C) NPM1 styrer aktivering av EGF /EGFR pathway nedstrøms effektorer. Proteiner, utvunnet fra shScr og shNPM1 LNCaP-celler dyrket i RPMI 1640-10% FBS, ble underkastet elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE. Overførte membraner ble immunoblottet med angitte antistoffer. Histogrammene viser bandet kvantifiseringen rapportert til β-aktin-nivå. Blot er representative for tre uavhengige eksperimenter med konsistente resultater. Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
NPM1 forsterker spesielt MAPK pathway aktivitet for å fremme spredning og migrasjon kapasitet på prostatakreftceller
de ovenfor angitte data viser at NPM1 er involvert i kontrollen av EGF uttrykk, en vekstfaktor som styrer MAPK reaksjonsveien og fremmer tumorigen oppførsel av prostatakreftceller. Så vi lurte på om det var grunnen til at shNPM1 LNCaP celler ble vist redusert tumorigent atferd. Vi har derfor undersøkt hvorvidt et eksogent inntak av EGF kunne redde aktivering av EGF /EGFR pathway effektorer og stiger deretter LNCaP-celler proliferasjon og migrasjon. Control (shScr) eller NPM1 slått ned (shNPM1) LNCaP celler ble sultet for å slå av signalveier og deretter behandlet med EGF.
Western blot analyser viser at en eksogen EGF tilskudd fører til fosforylering,
dvs.
, aktivering av både EGF-reseptoren og en av dens nedstrøms mål, AKT, i begge shScr og shNPM1 celler. Tvert imot, og mest interessant, fosforylering av ERK1 /2 er spesielt svekket i shNPM1-celler (figur 4a). I overensstemmelse med dette resultatet, er tilsetningen av eksogen EGF ute av stand til å gjenopprette migrasjon og invasjons kapasiteter shNPM1 LNCaP-celler i de tilsvarende analyser (figur 4b, c). Disse resultatene viser tydelig at NPM1 er spesielt nødvendig for aktivering av MAPK signalveien, og at forsterkning av denne transduksjon reaksjonsveien er involvert i kontrollen av proliferasjon og migrering kapasiteter for prostatakreft-celler.
(a) NPM1 nedregulering inhiberer EGF induserte ERK1 /2 pathway aktivitet. shScr og shNPM1 LNCaP-celler ble behandlet med 100 nM EGF og fosforyleringen av EGF /EGFR-spredningsveier effektorer ble analysert ved hjelp av Western blotting. Histogrammene viser bandet kvantifiseringen rapportert til β-aktin-nivå. Blottet er representative for tre uavhengige eksperimenter med konsistente resultater. (B) Til tross for EGF behandling, migrasjon kapasitet LNCaP redusert for NPM1 ikke ble gjenopprettet. Sårheling ble analysert 72 timer etter kontinuerlig behandling med 100 nM EGF. Celler ble observert i henhold til invertert mikroskop og fotografert. Histogrammene viser sår området kvantifisering ved hjelp ImageJ. (C) EGF behandlingen ikke redde spredning av NPM1 knockdown LNCaP celler. BrdU-inkorporering assay ble utført i shScr og shNPM1 LNCaP 24 timer etter at 100 nM EGF behandling. Tetthetsmåling ble målt ved 655 nm. Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
NPM1 opptrer oppstrøms av MEK1 og nedstrøms av EGFR å aktivere MAPK-reaksjonsveien, for kontroll av en EGF selv -regulation sløyfe i prostatakreftceller
som fosforylering av ERK1 /2 er spesielt svekket i shNPM1 celler selv i nærvær av EGF, tyder det på at det i MAPK-reaksjonsveien, NPM1 opptrer oppstrøms av ERK1 /2. For å identifisere den effektor (e) av EGFR-induserte signalveien på hvilken NPM1 kan opptre, og for å bestemme hvorvidt NPM1 handling er direkte eller ikke på det EGF-gen-promoteren, utførte vi transfeksjon analyser med en konstitutivt aktiv form av MEKK1 (caMEKK1) : caMEKK1 fosforylerer ERK1 /2 kinase MEK1 /2, og derved aktiverer konstitutivt ERK1 /2 i fravær av MEK1 /2-hemming. I shScr LNCAP celler, induserer caMEKK1 transfeksjon fosforyleringen av ERK1 /2. I shNPM1 LNCaP celler caMEKK1 transfeksjon induserer en lignende effekt, og dermed redde EGFR signalveien (figur 5a). Dette resultatet tyder på at NPM1 er rettet mot MAPK-reaksjonsveien nedstrøms for EGFR, men oppstrøms for MEK1 /2 for å regulere ERK1 /2. Videre kotransfeksjon av caMEKK1 konstruere med en phEGF-luciferase reporter plasmid redder også EGF promoter aktivitet (figur 5b) i LNCaP celler slått ned for NPM1. Disse resultater viser at 1- det er usannsynlig at NPM1 direkte transaktiverer den EGF-promoteren i prostatakreftceller. 2- NPM1 kan heller stimulere MAPK signalveien for å øke transkripsjonen av EGF-genet. 3- fosforylering data om AKT og ERK1 /2 sterkt at NPM1 fungerer på nivå med MEKK1 eller Ras /Raf i denne veien.
(a) ERK1 /2 aktivisering blir reddet av caMEKK1. shScr og shNPM1 LNCaP-celler blir transfektert med et konstitutivt aktivert konstruksjon av MEKK1 (caMEKK1) og ERK1 /2 fosforylering nivået ble analysert ved hjelp av western-blotting. (B) ERK1 /2 pathway aktivering gjenoppretter EGF promoter aktivitet i LNCaP celler downregulated for NPM1. LNCaP shSCR og shNPM1 celler ble transient ko-transfektert med phEGF-Luc og caMEKK1. EGF-promoter-aktivitet ble evaluert ved å måle luciferase-aktiviteten 24 timer etter. Resultatene av analysen ble standardisert mot kontroll rapportøraktivitet CMV-Luc og uttrykt som fold-induksjon enn kontrollcellene (shScr). Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Diskusjoner
NPM1 spiller en avgjørende rolle i cellevekst og spredning. Blant annet favoriserer det cellecyklusprogresjonen, ribosom biogenesis og sentrosomen duplisering [5] – [7]. Følgelig er en sammenheng mellom økt NPM1 ekspresjonsnivåer og tumorprogresjon blitt etablert i et bredt sett av faste tumorer i diverse histologiske opprinnelse slik som i gastric- [8], [9], tykktarm [9], nyre [10] eller eggstokk -kreft [11]. Likevel flere studier viser at, paradoksalt nok, er NPM1 i stand til å både fungere som en tumor suppressor og som et proto-onkogen under tumorgenesen [12]. På den ene siden, NPM1 deltar for opprettholdelse av kromosom stabilitet og regulerer ARF aktivitet [13] og, på den annen side fremmer NPM1 inhibering av flere tumor-suppressorer inkludert P53 eller Rb, og aktivering av proto-onkogen c-Myc å forbedre sin forvandlende aktivitet [14]. Våre tidligere funn viste at molekyl anstand NPM1 er over-uttrykt i prostata carcinoma vev, sammenlignet med kontroll tilstøtende vev hvor det stimulerer androgen-avhengig transkripsjon [1]. Vi ønsket nå å mer spesifikt undersøke om dette deregulering av NPM1 uttrykk kan handle på prostata kreftceller invasive og migrasjon kapasitet. I denne forbindelse ble NPM1 slått ned i LNCaP prostata kreft cellelinjer som tumor egenskaper som migrasjon, spredning og invasjonskapasitet er godt etablert.
