Abstract
TRAIL er en død ligand som induserer celledød fortrinnsvis i tumorceller. Rekombinant oppløselig TRAIL, men gir dårlige resultater som et anti-cancer terapeutisk fordi oligomerisering er nødvendig for potent biologisk aktivitet. Vi har tidligere genererte en diabody format av tumorrettet TRAIL betegnes Db
αEGFR-scTRAIL, bestående av enkelt-strandet TRAIL molekyler (scTRAIL) og de variable domener av en humanisert variant av EGFR blokkere antistoffet cetuximab. Her definerer vi bioaktivitet av Db
αEGFR-scTRAIL med hensyn til både EGFR hemming og TRAIL reseptor aktivering i 3D kulturer av Caco-2 kolorektal kreftceller som uttrykker villtype K-Ras. Sammenlignet med konvensjonelle 2D kulturer, Caco-2 celler vises sterkt forbedret følsomhet mot Db
αEGFR-scTRAIL i disse 3D kulturer. Vi viser at antistoff-delen av Db
αEGFR-scTRAIL ikke bare effektivt konkurrerte med ligand-induserte EGFR-funksjon, men også bestemt apoptotisk respons ved spesifikt å dirigere Db
αEGFR-scTRAIL til EGFR-positive celler. Å ta opp hvordan abnormt aktivert K-Ras, noe som fører til Cetuximab motstand, påvirker Db
αEGFR-scTRAIL følsomhet, vi genererte stabile Caco-2tet celler indusere uttrykking onkogene K-Ras
G12V. I nærvær av doksycyklin, viste disse cellene økt motstand mot Db
αEGFR-scTRAIL, assosiert med forhøyet uttrykk for anti-apoptotiske proteiner cIAP2, BCL-XL og Flip
S. Samtidig behandling av celler med Smac mimetiske SM83 restaurert Db
αEGFR-scTRAIL-indusert apoptotisk respons. Viktigere, denne synergien mellom Db
αEGFR-scTRAIL og SM83 også oversatt til 3D kulturer av onkogene K-Ras uttrykker HCT-116 og LoVo tykktarmskreftceller. Våre funn støtter dermed den oppfatningen at Db
αEGFR-scTRAIL behandling i kombinasjon med apoptose-allergifremkallende stoffer kan være lovende for behandling av EGFR-positive kolorektal kreft, uavhengig av deres
KRAS
status.
Citation: Möller Y, Siegemund M, Beyes S, Herr R, Lecis D, Delia D, et al. (2014) EGFR-målrettet TRAIL og et Smac Mimetic synergize å overvinne apoptoseresistens i
KRAS
Mutant tykktarmskreftceller. PLoS ONE ni (9): e107165. doi: 10,1371 /journal.pone.0107165
Redaktør: John Souglakos, Universitetet General Hospital i Heraklion og Laboratorium for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Hellas
mottatt: Juni 2, 2014; Godkjent: 04.08.2014; Publisert: 08.09.2014
Copyright: © 2014 Möller et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Dette arbeidet ble finansiert av Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; https://www.bmbf.de/) e. Bio tilskudd «forutsi» til MAO, RK og KP. RH og TB er støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, https://www.dfg.de/) via Collaborative Research Centre 850 og Excellence Initiative av BMBF via EXC 294 BIOSs. TB og MAO støttes av Heisenberg program av DFG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. DL og DD er oppfinnere på patent WO /2013/124701 (PCT /IB2012 /000297: «Homo- og heterodimere Smac lignende forbindelser som apoptose indusere «). KP og RK og MS er oppfinnere på patent CA2831820 A1 (PCT /EP2012 /001426: «rekombinante TNF ligand familiemedlem polypeptider med antistoff bindende domene og bruker disse»). KP er en konsulent og har fått kommersiell forskningsmidler fra SME. RK er konsulent og har fått kommersiell forskningsmidler fra BioNTech. Forfatterne bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de mest utbredte kreftformer over hele verden og spesielt i pasienter med avansert CRC overlevelse er lav [1]. I tillegg til kjemoterapi, har målrettet terapi kommet inn i klinikken. Foreløpig EGFR (epidermal vekstfaktor reseptor) blokkerer antistoffer cetuximab og panitumumabs er godkjent for behandling av metastatisk CRC i kombinasjon med kjemoterapi eller som vedlikeholdsbehandling i chemo-ildfast svulster [2], [3].
EGFR, også kjent som ErbB1 eller HER1, er assosiert med patogenesen til forskjellige humane epiteliale kreftformer. Denne reseptor-tyrosinkinase består av et ekstracellulært ligand-bindende domene, en enkelt membrandekkende region, og et cytoplasmatisk tyrosinkinase-domene [4], [5]. Ved binding av ligander så som EGF og TGF-α, reseptor-homo- og heterodimerizes fortrinnsvis med familiemedlem ErbB2 /HER2 fører til reseptoraktivering og transphosphorylation av spesifikke tyrosiner innenfor cytoplasmatiske haler. Disse phosphotyrosines tilveiebringe tilkoblingssteder for intracellulære signalmolekyler som utløser aktiveringen av MAPK og PI3K veier, som medierer biologiske responser som proliferasjon, migrering og overlevelse [5], [6]. Cetuximab konkurrerer med EGFR-ligander for reseptorbinding, for derved å fortrenge reseptor fosforylering og aktivering av nedstrøms signalisering [1].
De forskjellige genetiske endringer som finnes i CRC begrenser effektiviteten av anti-EGFR-terapi. Nesten 40% av alle CRC tilfeller havnen aktiverende mutasjoner i
KRAS
genet. Reseptor-tyrosin-kinase signale konvergerer i nivå med den lille GTPase Ras, en hovedregulator av begge, MAPK og PI3K veier. De mest vanlige mutasjoner forekommer i kodon 12 eller 13, som fører til konstitutiv Ras-aktivering og følgelig redusert eller ingen respons på behandling Cetuximab [7], [8].
TRAIL (tumor nekrose faktor-relatert apoptose- induserende ligand) er en død ligand som induserer apoptose i tumorceller fortrinnsvis via døds reseptorene TRAILR1 og TRAILR2, også kjent som DR4 og DR5, henholdsvis [9]. Binding av TRAIL utløser reseptor oligomeriseringsprosessen, etterfulgt av rekruttering av adapter proteiner og dannelse av dødsinduserende signale kompleks. Dette fører til slutt til aktivering av initiator caspaser og påfølgende aktivering av effektorcellene kaspaser, som resulterer i celledød ved apoptose [10]. Kliniske studier med rekombinant TRAIL bekreftet lav toksisitet til vanlig vev, men terapeutiske effektene var utilstrekkelig [11], [12]. For å overvinne disse begrensningene protein engineering tilnærminger har som mål å forbedre bioaktivitet og samtidig opprettholde svulst selektivitet. Riktig trimerisering og sink koordinering av rekombinant TRAIL synes å være avgjørende for biologisk aktivitet [13]. I henhold til utformingen av en enkelt polypeptidkjede som består av de ekstracellulære domener av tre TRAIL monomerer (scTRAIL) forbedret bioaktivitet av det rekombinante molekylet [14]. Slike molekyler kan videre være kondensert til antistoffer rettet mot tumormarkører. Vi har tidligere vist at sammensmeltingen av scTRAIL til et enkelt-kjede antistoff-fragment (scFv) er funksjonelt etterlignet naturlig membranbundet TRAIL og var mer effektiv enn scTRAIL alene [14]. Innføringen av et diabody konfigurasjon basert på de humaniserte variable områder av cetuximab (Db
αEGFR-scTRAIL) resulterte i en enda høyere bioaktivitet av rekombinant TRAIL både in vitro og in vivo, som vist ved den sterke reduksjon av tumorstørrelse og langvarig overlevelse av nakne mus som bærer Colo205 xenografter [15].
Bortsett fra sin svulst målretting effekt, EGFR-rettede antistoff-del som finnes i Db
αEGFR-scTRAIL molekyl kan aktivt påvirke EGFR funksjon samtidig stimulere apoptose. For å dissekere bidrag EGFR blokade til bioaktivitet av Db
αEGFR-scTRAIL vi brukte EGFR-positive Caco-2 CRC cellelinje, som havner mutasjoner i APC, p53, og SMAD4 men er villtype for MAPK og PI3K trasé [16]. Å etterligne nærmere in vivo situasjon, ble Caco-2 celler dyrket i 3D kollagen /Matrigel kulturer hvor de danner fullt differensierte polarisert cyster [17]. Vekstvilkår er kjent for å påvirke balansen mellom overlevelse og apoptose signaler, fremhever behovet for å studere behandlings og resistensmekanismer ikke bare i tradisjonelle 2D kulturer [18]. Ja, våre resultater viser at dyrking av Caco-2 celler i en 3D-matrix gjør cellene TRAIL-sensitive. Vi viser videre at EGFR-signalering bidrar til Caco-2-celleformering og kan bli blokkert av farmakologisk EGFR inhibering. Betydningen av EGFR-spesifikt antistoff-delen for effektiv målretting av Db
αEGFR-scTRAIL understrekes av det faktum at lave EGFR nivåer karakterisere celle subpopulasjon som overlever Db
αEGFR-scTRAIL behandling. Dessuten, selv ufølsom for EGFR blokade per se, er EGFR-positive Ras mutante CRC celler målrettet og sensibilisert for Db
αEGFR-scTRAIL-indusert apoptose ved samtidig behandling med Smac mimetisk SM83. Den potent cytotoksisk aktivitet av Db
αEGFR-scTRAIL avdekket i denne studien dermed gir støtte for sin videre utvikling som en anti-kreft terapeutisk for behandling av CRC.
Materialer og metoder
antistoffer og reagenser
antistoffer som ble brukt var monoklonalt kanin anti-pEGFR (Y1068) (1:1000), monoklonalt kanin anti-kaspase-3 (1:1000), polyklonalt kanin-anti-TRAILR2 (1:500), polyklonale kanin anti-Perk (T202 /Y204) (1:1000), monoklonalt kanin anti-Pakt (T308) (1:1000), polyklonale kanin anti-cIAP1 (1:1000), monoklonalt kanin anti-cIAP2 (1:1000 ), monoklonalt mus anti-ERK (1:1000), monoklonalt mus anti-AKT (pan) (1:1000), monoklonalt mus anti E-cadherin (1:250), monoklonalt mus anti-Smac (1:1000), polyklonalt kanin-anti-Bcl-2 (1:1000), monoklonalt anti-kanin-Bcl-xL (1:400) og monoklonale anti-kanin survivin (1:1000) (alle fra Cell Signaling, Danvers, MA, USA), monoklonalt mus anti-xIAP (1:400), monoklonalt mus anti-Ras (1:200) (BD, CA, SanJose, USA), monoklonalt mus anti-flips /L (1:400) og polyklonale kanin anti-TRAILR1 (1 :1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), monoklonalt mus anti-EGFR (1:500) (Thermo Scientific, Fremont, MA, USA), monoklonalt mus anti-alpha-tubulin (1:5000) (Sigma -Aldrich, St Louis, MO, USA), og monoklonalt mus anti-GFP (1:1000) (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). HRP-merket sekundært anti-mus og anti-kanin IgG antistoffer (1:10000) var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alexa Fluor 488 og 546-merket sekundært anti-mus og anti-kanin IgG antistoffer (1:500) og Alexa Fluor 633-merket phalloidin (1:100) var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DAPI var fra Sigma-Aldrich, Z-VAD-FMK var fra Bachem AG (Bubendorf, Sveits), og Cetuximab fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Db
αEGFR-scTRAIL ble produsert i HEK293-celler og renset fra cellekultursupernatanter [15]. Syntese og rensing av SM83 ble beskrevet tidligere [19], [20].
Cell kultur
Caco-2, HCT-116, og LoVo cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen ), og Caco-2tet celler i DMEM (Invitrogen) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland). Cellelinjer ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. For vekstfaktor-avhengige analyser ble cellene dyrket i medium inneholdende 2% FCS pluss 10 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich) og TGF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA). For vekst i 3D, ble cellene sådd på en seng av vekstfaktor redusert matrigel (BD) og PureCol-S kollagen (Advanced Biomatrix, San Diego, CA, USA) (1:01) og overlappet med vekstmedium som inneholder 2% matrigel. Lumen utvidelse ble indusert ved tilsetning av 100 ng /ml choleratoxin. (CTX; Sigma Aldrich) på dag 3 etter såing
Generering av Caco-2tet Ras
G12V celler
pTET /
KRAS
G12V-IRES-GFP-BSR uttrykk vektor, som gjør at doksycyklin-induserbare uttrykk for K-Ras
G12V, ble generert ved å utvinne K-Ras
G12V åpen lese rammen fra pBABE-K-Ras
G12V (Addgene) av
BamH
jeg fordøyelsen, etterfulgt av innsetting i
Bgl
II-linearisert pMIG vektor [21]. Den resulterende K-Ras
G12V-IRES-GFP kassett ble forsterket av PCR hjelp oligonukleotider som inneholder flankerer
Ikke
jeg sider, som ble brukt for subkloning inn PSC-A-amp /kan (Stratagene, La Jolla , CA, USA). Deretter K-Ras
G12V-IRES-GFP kassett ble klonet via
ikke anbefale jeg fordøyelsen inn i pTET-BSR vektor [22], som gir pTET /K-Ras
G12V-IRES- GFP-BSR. For å oppnå doksycyklin-induserbar uttrykk for onkogene K-Ras, Caco-2tet celler som stabilt uttrykker doxycycline-induserbar system komponenter rtTA- og RTT [21], ble transfektert med
Ahd
-linearisert pTET /K- Ras
G12V-IRES-GFP-BSR vektor ved elektroporering. Etter utvalg med blasticidine S (5 ug /ml) og puromycin (5 ug /ml), var resistente celleforråd screenet for effektiv induksjon av K-Ras
G12V uttrykk. Transgene uttrykk ble indusert ved tilsetting av 2 mikrogram /ml doksycyklin (Merck).
FACS analyse
Analyse av transgene uttrykk av Caco-2tet celler ble utført etter 72 DOX behandling. Cellene ble vasket, resuspendert i PBS inneholdende 2% FCS og 0,01% natriumazid, og analysert ved hjelp av et EPICS FC500 (Beckman Coulter, Krefeld, Tyskland). Post-oppkjøp dataanalyse ble utført ved hjelp FlowJo programvare (Tre stjerners, Ashland, OR, USA).
Western blotting
Celler ble lysert i RIPA buffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 0,5 natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 1 mM natriumortovanadat, 10 mM natriumfluorid og 20 mM p-glycerofosfat plus Complete proteasehemmere (Roche)). For 3D-lysater ble cellene dyrket på ren Matrigel uten kollagen. Spheroids ble isolert etter 4 dager ved hjelp av Cell Recovery Solution (BD) og lysert i RIPA buffer. Lysater ble klaret ved sentrifugering, ble like mengder av protein separert ved SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Gel; Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembran (iBlot Gel Overfør stabler; Invitrogen). Membranene ble blokkert med 0,5% blokkerende reagens (Roche) i PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og inkubert med primære antistoffer, etterfulgt av HRP-konjugerte sekundære antistoffer. Visualisering ble gjort med ECL Detection System (Pierce, Rockford, IL, USA).
MTT, cytotoksisitet, og caspase 3/7 aktivitetsanalyser
For 2D kulturer, 2,5 × 10
3 celler /brønn i 100 ul medium ble sådd ut i ikke-belagte 96-brønners plater. For 3D-kulturer, 5 x 10
3-celler /brønn ble sådd ut på Matrigel /kollagen-belagte 96-brønners plater i 100 ul medium inneholdende 2% matrigel. Levedyktigheten ble bestemt ved tilsetning av 10 pl 3- (4,5-dimetyltiazol-2yl-) 2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT; Roth, Karlsruhe, Tyskland) løsning (5 mg /ml), etterfulgt av inkubering i 3 timer. Celler ble lysert ved tilsetning av 100 ul 50% dimetylformamid inneholdende 10% SDS, og absorbansen ble målt ved 570 nm ved hjelp av multimodus leseren Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Sveits). Cytotoksisitet ble målt ved hjelp av CytoTox-Glo Cvtotoksisitetsmålinq fra Promega (Madison, WI, USA). Aktiviteten av døde celler protease i kulturen ble bestemt ved tilsetning av 50 ul luminogenic substrat. Etter 15 min inkubasjon ved romtemperatur ble luminescens målt ved å bruke multimodus leseren Infinite 200 PRO (Tecan), etterfulgt av cellelysering og måling av total luminescens for normalisering.
Caspase 3/7 aktivitet ble bestemt ved hjelp av Caspase- Glo3 /7 Assay fra Promega (Madison, WI, USA) ved tilsetning av 70 ul luminogenic substrat inneholdende det DEVD-sekvensen. Etter 30 min inkubasjon ved romtemperatur ble luminescens målt ved hjelp av multimode leseren Infinite 200 PRO (Tecan).
Tunel farging
DNA trådbrudd ble analysert med in situ celledød deteksjon kit (TMR ) fra Roche. Celler ble fiksert med 4% PFA i 1 time ved RT og permeabilisert med 0,1% Triton-X-100 i 0,1% natriumsitrat i 2 minutter ved RT. Merkingen ble utført i henhold til produsentens protokoll i 1 time ved 37 ° C. Kjerner ble kontra med DAPI. Glass ble montert i Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) og analysert på en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Bilder ble behandlet med ZEN-programvare (Zeiss). Tunel-positive celler ble telt ved hjelp ImageJ (W. Rasband, National Institute of Health, USA, versjon 1.48).
immunfluorescens mikros
Celler dyrket i 3D på matrigel /kollagen belagt 8-brønn glass kammers objektglass (BD) ble fiksert med 4% PFA i 15 minutter, permeabilisert med PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 i 10 minutter og blokkert med 5% geiteserum (Invitrogen) i PBS inneholdende 0,1% Tween-20. Cellene ble deretter inkubert med primære antistoffer i blokkeringsbuffer (2 timer ved romtemperatur), vasket med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og inkubert med sekundært antistoff i blokkeringsbuffer (2 timer ved RT). F-Actin og kjerner ble kontra med Alexa Fluor 633-merket phalloidin og DAPI. Lysbilder ble montert i Fluoromount G og analysert på en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) ved hjelp av 488, 561 og 633 nm eksitasjon med olje objektiv Plan-Apochromat 63x /1,40 DIC M27. Bilder ble behandlet med ZEN-programvare (Zeiss).
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt (± SEM), og «n» refererer til antall uavhengige forsøk. Statistisk signifikans ble evaluert av t-test, og enveis ANOVA etterfulgt av Tukey post-test (GraphPad Prism versjon 4.03, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). p-verdier under 0,05 ble betraktet som signifikant (* p 0,05, ** p 0,01; *** p 0,001; ns, p 0,05).
Resultater
I 3D matrigel kulturer, Caco-2-celler differensierer til polariserte cyster som består av et enkelt cellelag som omgir et sentralt lumen [17], [21], noe som reflekterer den organotypiske organiseringen av tykktarmen. Fordi disse cellene er EGFR-positive og uttrykker villtype-Ras, de representerer en ideell modellsystem for å studere den kombinerte effekten av EGFR inhibitor og en apoptose-induserende middel slik som TRAIL. Til første teste effekten av Db
αEGFR-scTRAIL, Caco-2-celler ble dyrket i tre dager i 3D i medium inneholdende 10% FCS før tilsetning av Db
αEGFR-scTRAIL fulgt av MTT-måling tre dager senere. I disse kulturene, forholdsvis lave doser av Db
αEGFR-scTRAIL forårsaket en signifikant reduksjon i cellelevedyktighet som var forbundet med avbrudd av cyster og dannelse av apoptotiske legemer (Fig. 1a, b), scTRAIL alene eller i kombinasjon med cetuximab ikke klarte å lokke fram en cytotoksisk respons i Caco-2 3D kulturer (fig. S1), som støtter vår tidligere data som diabody-mediert dimer struktur av Db
αEGFR-scTRAIL overfører overlegen bioaktivitet løpet scTRAIL [15]. Interessant, i konvensjonelle 2D cellekulturer på plast, Caco-2-cellene var meget motstandsdyktig mot Db
αEGFR-scTRAIL behandling (Fig. 1a, b), på linje med en tidligere rapport ved anvendelse av rekombinant human TRAIL [23]. Forbehandling av Caco-2 3D-kulturer med Z-VAD, et pan-kaspaseinhibitor, betydelig redusert cytotoksisk effekt av Db
αEGFR-scTRAIL (Fig. 1c), og induksjon av apoptose ved Db
αEGFR- scTRAIL ble bekreftet ved analyse av DNA-fragmentering etter Tunel farging (fig. 1 d, e). I tillegg, sammenlignet med 2D-kulturer, er dose-avhengig aktivering av kaspaser 3/7 i respons til Db
αEGFR-scTRAIL var signifikant økt i 3D-kulturer (fig. 1F). Denne forskjellen i følsomhet overfor Db
αEGFR-scTRAIL i 3D-versus 2D kulturer kunne ikke tilskrives endringer i EGFR eller TRAILR1 /2-ekspresjon (Fig. 1 g, h). Dessverre, fordi lokkefugl reseptorer DcR1, DcR2 kunne ikke bli oppdaget av immunblotting med antistoffer som er tilgjengelige, kan uttrykk endringer i disse reseptorene ikke utelukkes. Analyse av nøkkelsignalveier viste at, i 3D-kulturer, ble aktiviteten av PI3K pathway undertrykkes sammenlignet med celler dyrket i 2D, målt ved fosfo-Akt nivåer, mens den ERK /MAPK-reaksjonsveien ble oppregulert som vist ved øket ERK1 /2 fosforylering ( fig. 1 g, h). Imidlertid hemming av PI3K av LY294002 i 2D kulturer var ikke tilstrekkelig til å sensibilisere celler for å Db
αEGFR-scTRAIL (data ikke vist), noe som indikerer en mer komplisert situasjon i 3D-kulturer. Sammen utgjør disse resultatene understreker virkningen av dyrkningsforhold på cellulær respons mot apoptose-induserende midler.
Celler ble dyrket i 3D eller 2D i medium som inneholder 10% FCS. (A) Tre dager etter såing, kulturer ble behandlet med Db
αEGFR-scTRAIL. Levedyktigheten ble målt 72 timer senere med MTT-analyse og normalisert til den ubehandlede kontroll (n = 3). (B) fasekontrastbilder av 3D- og 2D-kulturer som er beskrevet i (a) ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av Db
αEGFR-scTRAIL i 72 h (Skala: 50 um). (C) Tre dager etter såing, ble 3D kulturer forbehandlet med 20 mikrometer Z-VAD som indikert før tilsetting av 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL. Levedyktigheten ble målt 72 timer senere med MTT-analyse og normalisert til den ubehandlede kontroll (UT) (n = 3). (D) 24 timer etter behandling, ble cellene fiksert og farget for DNA kjedebrudd. Tunel-positive celler ble tellet (n = 2). (E) Representative bilder av Tunel stainings beskrevet i (d), Tunel-positive celler (røde), DAPI (kjerner, blå). Vist er confocal seksjoner (skala bar: 100 mikrometer). (F) Tre dager etter såing, ble kulturene behandlet med 0,1 nM eller 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL i 24 timer. Kaspase 3/7 aktivitet ble målt og normalisert til den respektive ubehandlede kontroll (UT) (n = 3). (G) Fire dager etter såing, ble lysater generert og analysert ved immunblotting. Vist er en representativ blot av tre uavhengige eksperimenter. Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. Spesifikke band er preget av pilspisser. (H) Kvantifisering av Western-blots fra (g). Proteinnivåer ble normalisert til den tilsvarende tubulin kontroll; nivåer i 2D kulturer ble satt som en (n = 3).
Vi neste undersøkt hvordan tilstedeværelsen av EGFR-ligander påvirket vekst og differensiering av Caco-2 celler i 3D kulturer. Celler ble sådd ut i matrigel kulturer inneholdende lavt serum (2%) i nærvær av EGF eller TGF-α, slik at proliferasjonen ble i hovedsak drevet via EGFR-signalisering. MTT-aktivitetsmålinger etter seks dager med dyrking indikerte at EGF og TGF-α forbedret spredning av Caco-2-celler sammenlignet med kontrollceller dyrket i lav serum bare (fig. 2a). Mikroskopisk analyse viste at i nærvær av EGF og TGF-a Caco-2 cyster var større og inneholdt flere celler (Fig. 2b). Spesielt har tilsetningen av EGFR-ligander ikke forstyrre differensiering, bedømt ved hjelp av den typiske apikale fordelingen av F-aktin og dannelsen av et cellefritt lumen (fig. 2b). For å løse hvor EGFR-blokade påvirkes basal og EGFR-ligand-induserte proliferasjon av etablerte Caco-2 cyster, vi behandlede cellene tre dager etter poding med Cetuximab (0,5 uM) og analysert kulturene ble tre dager senere. Sammenlignet med kontrollgruppen, i disse kulturene MTT-aktivitet ble betydelig redusert med 35-50%, men celler var fremdeles levedyktig, viste ingen tegn på apoptose og bare ubetydelig økt cytotoksisitet (figur 2c-e;. S1d). Dette indikerer at EGFR aktivering bidrar til basal spredning, men er ikke nødvendig for å overleve. Cetuximab også potent inhiberer proliferasjon i nærvær av EGF og TGF-α som vist ved reduksjonen av MTT aktivitet og den reduserte størrelse av cyster (Fig. 2c, d). Sammen disse eksperimentene viser at spredning av Caco-2 celler i 3D kulturer kan være drevet av EGFR signalering og er følsom for farmakologisk EGFR hemming, og kan dermed potensielt undertrykkes av Db
αEGFR-scTRAIL.
Caco -2-celler ble dyrket i 3D-kulturer inneholdende 2% FCS i nærvær av vekstfaktorer (10 ng /ml) eller i 2% FCS bare (con). (A) Kulturer ble analysert ved MTT-analyse ved dag 6 og normalisert til kontroll (n = 5). (B) Tre dager etter såing 100 ng /ml CTX ble lagt for å indusere lumen ekspansjon. Spheroids ble fiksert på dag 6 og farget med phalloidin (F-aktin) og DAPI (kjerner). Vist er confocal deler av en representant cyste (skala bar: 10 mikrometer). (C) Tre dager etter såing, ble 3D kulturer ubehandlet eller behandlet med 0,5 mikrometer Cetuximab (CET) i 72 timer. Levedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse og normalisert til den ubehandlede kontroll (UT). (N = 4) (d) Caco-2 3D-kulturer ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med 0,5 uM Cetuximab i 72 timer og analysert ved fase-mikroskopi (Skala: 50 um). (E) Tre dager etter såing, 3D kulturer ble ubehandlet (ut) eller behandlet med 0,5 mikrometer Cetuximab (CET) i 72 timer. Cytotoksisitet ble bestemt ved bruk av CytoTox-Glo Cvtotoksisitetsmålinq (n = 3).
EGFR aktivisering ikke bare stimulerer cellevekst, men kan også beskytte mot TRAIL-indusert apoptose [24]. Derfor vi neste undersøkt effekten av Db
αEGFR-scTRAIL i nærvær av EGFR-ligander. Immunoblotting av lysatene av EGF- og TGF-α-stimulerte celler viste en tilsvarende grad av undertrykkelse av ligand-indusert EGFR fosforylering ved enten Cetuximab eller Db
αEGFR-scTRAIL forbehandling (Fig. 3a, b), noe som indikerer effektiv konkurranse den diabody-delen med EGFR-ligander. Dette kan også bekreftes i 3D dyrkede Caco-2 celler stimulert med EGF (fig. S2). Følgelig, EGF og TGF-α ikke hadde noen beskyttende effekt på levedyktigheten i 3D (fig. 3c) ble heller ikke disse ligandene i stand til å interferere med caspaseaktivering (fig. 3d), som viser at Db
αEGFR-scTRAIL aktivitet er ikke begrenset av tilstedeværelsen av EGFR-ligander. For å forstå mer detaljert resistensmekanismer mot Db
αEGFR-scTRAIL, vi re-isolert cyster fra ubehandlet og Db
αEGFR-scTRAIL-behandlede 3D Matrigel kulturer fulgt av immunoblotting av cellelysatene (Fig. 3f, g). Interessant, lysates avledet fra overlevende cyster (Fig. 3e, piler) viste at disse Db
αEGFR-scTRAIL-ufølsomme celler inneholdt spesielt lave EGFR nivåer. Av notatet, TRAIL reseptor nivåer i disse cellene var lik de i ubehandlede celler, noe som tyder på at fordelingen av EGFR uttrykk i cellen befolkningen sterkt påvirker Db
αEGFR-scTRAIL følsomhet (Fig. 3f, g). Således, selv om diabody-del ikke bidrar aktivt til apoptose og i hovedsak har en veksthemmende funksjon i Caco-2 3D-kulturer, er det EGFR-rettede målretting viktig for å øke den lokale konsentrasjonen TRAIL og utløse en effektiv apoptotisk respons.
(a) Caco-2-celler dyrket i 2D var ubehandlet eller behandlet med 4 nM Db
αEGFR-scTRAIL eller 4 nM Cetuximab i 15 minutter før stimulering med EGF eller TGF-α (10 ng /ml) i 10 min. Fosforylerte og de totale proteiner ble påvist ved immunblotting. Vist er en representativ blot av tre uavhengige eksperimenter. Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. (B) Kvantifisering av Western-blots fra (a). Fosfo-EGFR-nivåer var normalisert til den tilsvarende totale proteinnivåer; nivåer i den ubehandlede kontrollgruppe, ble angitt som en (n = 3). (C, d). Tre dager etter såing, Caco-2 3D-kulturer dyrket i fravær eller nærvær av vekstfaktorer ble behandlet med 1 nM Db
αEGFR-scTRAIL. (C) Levedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse etter 72 timer og normalisert til den respektive ubehandlede kontroll (UT). (N = 3) (d) Caspase 3/7-aktiviteten ble målt etter 24 timer. Verdiene ble normalisert til den tilsvarende ubehandlede kontroll (n = 3). (E) Tre dager etter såing, Caco-2 3D kulturer var enten venstre ubehandlet eller behandlet med 5 nM Db
αEGFR-scTRAIL i 72 timer. Overlevende cyster i fase bildene som er indikert med piler (Skala: 50 um). (F) Lysater avledet fra 3D-kulturene som er vist i (e) ble analysert ved immunblotting. Vist er en representativ blot av tre uavhengige eksperimenter. Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. Spesifikke band er preget av pilspisser. (G) Kvantifisering av Western-blots fra (f). Proteinnivåer ble normalisert til den tilsvarende tubulin kontroll; nivåene i ubehandlede kulturer ble satt som en (n = 3).
Om lag 40% av alle CRC svulster havn en aktiv mutasjon i
KRAS
genet, som fører til konstituerende ERK /MAPK-aktivering og tap av respons til Cetuximab [7], mens TRAIL følsomhet kan økes [25]. For å undersøke påvirkning av onkogene Ras på Db
αEGFR-scTRAIL-indusert cytotoksisitet, genererte vi stabile Caco-2 celler indusere uttrykking K-Ras
G12V. I disse cellene, induserer doksycyklin bi-cistronisk uttrykk for onkogen og GFP, mens vektorkontrollceller uttrykker GFP bare. Tre dager etter doksycyklin tillegg er mer enn 85% av Caco-2tet celler ble GFP positive ved FACS-analyse (fig. 4a). Immunoblotting av Caco-2tet K-Ras
G12V cellelysater bekreftet Ras overekspresjon sammen med at av GFP, samtidig med sterk ERK-fosforylering, mens vektorkontrollceller uttrykte bare GFP (Fig. 4b). Når disse celler ble sådd inn i 3D-kulturer i fravær av doksycyklin, både Caco-2tet vektor og K-Ras
G12V celler dannet godt differensiert og polariserte kuler med basolaterale adherens kryss (E-cadherin flekker) og apikale F-aktin opphopning rundt et cellefritt lumen. Tilsetning av doksycyklin hadde ingen effekt på morfologien til kontrollcellene, mens K-Ras
G12V uttrykkende celler som dannes multi-luminal sfæroider som manglet forskjellig polarisasjon (fig. 4c). Disse differensiering defekter forårsaket av K-Ras
G12V er i samsvar med en fersk rapport fra Magudia et al. (2012) [16].
(a) Caco-2tet vektor kontroll og K-Ras
G12V celler ble behandlet med 2 mg /ml doksycyklin i 72 timer (+ DOX). Celler ble høstet og GFP fluorescens ble analysert ved flow-cytometri. Ikke-induserte celler ble anvendt som en kontroll (-dox). (B) Caco-2tet vektorkontroll og K-Ras
G12V-celler ble dyrket i 2D og behandlet med doksycyklin i de angitte tidsrom før lysis. GFP, Ras, perk (T202 /Y204) og ERK nivåer ble bestemt ved Western blotting. Tubulin ble oppdaget som en lasting kontroll. Alle paneler som vises er fra den samme blott. (C) Caco-2tet vektorkontroll og K-Ras
G12V celler ble sådd inn i 3D-kulturer i fravær eller nærvær av doksycyklin. Tre dager etter såing lumen utvidelse ble indusert ved tilsetting av 100 ng /ml CTX. Kulturer ble fikset tre dager senere og farget med E-cadherin-spesifikt antistoff (grønn), phalloidin (rød) og DAPI (kjerner, blå). Vist er confocal deler av representative cyster (skala bar: 10 mikrometer)
For å fastslå effekten av K-Ras
G12V uttrykk på Db
αEGFR-scTRAIL indusert cytotoksisitet, 3D kulturer. ble behandlet med doksycyklin i tre dager. Sammenlignet med kontrollcellene, levedyktighet målinger avdekket nedsatt følsomhet av onkogene Ras-uttrykkende celler for å Db
αEGFR-scTRAIL (fig. 5a).
