Abstract
Bakgrunn og Objective
Ja-assosiert protein (YAP) og transkripsjonen co-aktivator med PDZ bindende motiv (TAZ) er atom effektorer av Hippo veien. Selv om de er rikelig uttrykt i cytoplasma og kjerner av menneskelige tykktarmskreft (CRC), og knyttet til status tumor spredning, har det vært få studier på prediktiv rolle YAP og TAZ uttrykk på total overlevelse av pasienter med CRC. Denne studien undersøkte YAP og TAZ uttrykk i både CRC pasienter og tykktarmskreft cellelinjer, og vurdert deres prognostisk verdi.
Metoder
parafininnstøpte prøver fra 168 kvalifiserte pasienter ble brukt for å undersøke YAP og TAZ uttrykk ved immunhistokjemi, og sammenlignet med eksperimentelle resultater i tykktarmskreft HCT116 cellelinje å utforske sin kliniske betydning i CRC.
resultater
statistisk signifikante positive korrelasjoner ble funnet mellom protein uttrykk for YAP og TAZ i CRC vev. Pasienter med høyere YAP eller TAZ uttrykk viste en trend med kortere overlevelse ganger; enda viktigere, vår kohort studie viste at pasienter med både YAP og TAZ overekspresjon presenteres de verste utfall. Dette ble støttet av multivariat analyse. I HCT116 tykktarm kreft celler, ble kapasiteten for spredning, metastaser, og invasjon dramatisk redusert med knockdown av YAP og TAZ uttrykk av siRNA.
Konklusjoner
Co-overekspresjon av YAP og TAZ er en uavhengig prediktor for prognosen for pasienter med CRC, og kan forklare den høyere spredning, metastase, og dårlig overlevelse utfallet av disse pasientene
Citation. Wang L, Shi S, Guo Z, Zhang X, Han S, Yang A, et al. (2013) Overuttrykte YAP og TAZ er en uavhengig prediktor for Prognose i tykktarmskreft og knyttet til spredning og metastasering av tykktarmskreft celler. PLoS ONE 8 (6): e65539. doi: 10,1371 /journal.pone.0065539
Redaktør: Wanjin Hong, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore
mottatt: 04.02.2013; Akseptert: 25. april 2013, Publisert: 10 juni 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (nr 81072117). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
The Hippo veien er en viktig regulator av cellevekst, spredning og apoptose. Den ble først oppdaget av genetisk mosaikk-skjermer i
Drosophila melanogaster product: [1], [2]; Det er imidlertid en økende mengde bevis som viser at flodhesten sti begrenser også organ størrelse i pattedyrsystemer [3], [4] ved inhibering av celleproliferasjon og fremme apoptose. Komponenter i denne reaksjonsvei er sterkt konservert hos pattedyr, og omfatter MST1 /2; WW45; Lats1 /2; Mob1; YAP; TAZ; NF; FRMD6; og Fat4 [2]. MST1 /2 og Last1 /2 er kinaser, og WW45 og Mob1 fungere som adaptere /aktivatorer i pattedyr, sammen disse utgjør kjernen kinase kassett av Hippo veien. De Yki homologer: Ja-assosiert protein (YAP) og dens paralog, transkripsjonen co-aktivator med PDZ bindende motiv (TAZ), er de viktigste målene for kjerne Hippo kinase kaskade, og anses å være den kjernefysiske effektorer av Hippo pathway [5].
Tidligere studier har rapportert at avvikende endring av de viktigste komponentene i Hippo vei fører til ukontrollert cellevekst, og er assosiert med kreftutvikling [6], [7]. Dette innebærer at Hippo pathway spiller en avgjørende rolle i å undertrykke tumorvekst [8]. Avvikende aktivering av YAP har vært assosiert med dårlig prognose i multiplum av humane cancere [5], [9] – [11], inkludert hepatocellulær, eggstokk, og ondartet mesothelioma, og kan virke som et onkogen i brystkreft [15]. Som sådan har YAP blitt foreslått som kandidat onkogen. Videre er overekspresjon av YAP ble funnet å forbedre leverstørrelse og til slutt føre til svulstutvikling i betingede transgene mus modeller [5], [12], [13]. Ytterligere studier har vist at TAZ, og TAZ-avhengig sekresjon av amfiregulin (AREG), spiller også en betydelig rolle i bryst tumorigenese og metastase: når den overuttrykkes TAZ er slått ned i ikke-små-celle lungekreft (NSCLC), dets spredning og onkogene egenskaper er undertrykt [16].
Selv om både YAP og TAZ har vist seg å være involvert i utviklingen av kreft som stammer fra forskjellige vev, er det nødvendig å undersøke den vev-spesifikke rollen til YAP og TAZ uttrykk for å undersøke hvilken rolle YAP og TAZ i menneskelig tykktarmskreft (CRC) og videre forstå funksjonen av Hippo veien. Nylig publiserte data tyder på at overuttrykt YAP kan samspill med β-catenin å drive spredning av tykktarmskreftceller, noe som tyder på at YAP kan spille en rolle i kreftbehandling [17]; Men til vår kunnskap, forskning i den kliniske betydningen av YAP og TAZ, og den prognostiske verdien av YAP og TAZ, har vært begrenset, og betydningen av YAP og TAZ co-overekspresjon i CRC, forblir unnvikende.
i denne studien undersøkte vi den prognostiske verdien av både YAP og TAZ i en retrospektiv kohortstudie med en fem års oppfølging, for å bestemme uavhengig prediktiv rolle YAP og TAZ hos pasienter med CRC. Vi identifiserte en synergi mellom disse to proteiner og en potensiell mekanisme som Hippo pathway modulerer menneskelig CRC progresjon.
Materialer og metoder
Pasienter og Oppfølgings
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen i den fjerde Military Medical University (FMMU, Xi’an, Kina), og alle deltakende pasienter ga sin skriftlig informert samtykke. Den retrospektive kohorten inkluderte 168 pasienter diagnostisert med potensielt resectable CRC mellom februar 2006 og desember 2007 ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi Xijing Hospital, FMMU. Pasienter med følgende kriterier ble ekskludert fra deltakelse: hadde fått adjuvant kjemoterapi før operasjonen; hadde blitt diagnostisert med gastrointestinal stromal tumor eller lymfom; hadde flere kreftformer diagnoser; eller nektet samtykke. Alle kliniske prøver ble hentet fra vevet arkiv av Avdeling for patologi, Xijing Hospital, FMMU. Oppfølging informasjonen ble oppdatert hver tredje måned, fra alle deltakerne, via telefon. Total overlevelse ble definert som tiden har gått fra kirurgi til den tiden av pasientens død. Pasient døde ble etablert fra sin familie
Immunohistochemistry og poeng
Parafin-embedded deler av normale og tumorvev ble farget for YAP (H-125. Sc-15407, Santa Cruz Biotechnology, USA ) og TAZ (NP_056287: ab118373; Abcam, UK) uttrykk. Som antistoff mot YAP anvendt i denne studien er et polyklonalt antistoff, vi brukte Western blotting for å identifisere den antistoffspesifisitet av YAP (figur S1). Immunhistokjemi (IHC) for YAP og TAZ ble utført som tidligere beskrevet [7] med mindre modifikasjoner. Kort, lysbilder ble deparaffinized i xylen, og rehydrert gjennom en gradert alkohol serie, før endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2 i metanol. Etter blokkering mot ikke-spesifikk proteinbinding, ble prøvene inkubert over natten med YAP eller TAZ primære antistoffer, fortynnet til de anbefalte konsentrasjoner (1:500), i et fuktighetskammer ved 4 ° C. Prøvene ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), før biotinylert sekundært antistoff ble påført i 30 minutter ved romtemperatur. Visualisering ble utført ved anvendelse av 3,3 «Diaminobenzidin (DAB) kromogen i 2-3 min. Negative kontroller ble fremstilt ved å erstatte det primære antistoff med preimmun-kaninserum. YAP og TAZ farging ble scoret av to uavhengige patologer, blindet for de kliniske kjennetegn ved pasientene. Poengsystemet som brukes til å gradere uttrykk for YAP og TAZ er beskrevet i Tabell 1.
Cell Culture
Følgende menneskelige tykktarmskreftcellelinjer: HCT116, LS174T, Løvø, SW480 og SW480 ble anvendt i denne studien. Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). HCT116 og LoVo-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone); SW480 og LS174T celler ble dyrket i RPMI1640 (Invitrogen, CA, USA) medium supplementert med 10% FBS; SW620-celler ble dyrket i Leibovitz L-15 (Invitrogen, CA, USA) medium med 10% FBS. Alle cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Transfeksjon og Gene lyddemping
For små interfererende RNA (siRNA) transfeksjon, følgende siRNA tomannsboliger ble syntetisert (Genepharma, Shanghai, Kina) (5′-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3 «), rettet mot YAP genet; (5»-GGAUACAGGAGAAAACGCATT-3 «), rettet mot TAZ genet; og den negative kontrollen duplex, (5»-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 «). Disse siRNA tomannsboliger (100 nmol /L) ble transfektert inn i HCT116 cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. HCT116 cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon for gen eller protein analyse.
Kvantitativ Real-time omvendt transkriptase Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) , og påfølgende syntese av syklisk DNA (cDNA; Takara, Japan), ble utført i henhold til forhandlerens protokoller. Real-time kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) ble utført ved hjelp av CFX96TM Real-Time PCR system (BioRad, CA, USA) med SYBR Grønn II kit (# DRR041A, Takara, Japan) i henhold til produsentene « bruksanvisning. QRT-PCR-analyse ble utført i et totalvolum på 20 pl med følgende forsterkertrinn: en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 min; etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 s; og deretter forlengelse ved 55 ° C i 30 sek. Uttrykkene ble normalisert til den humane β-aktin-genet. De følgende primer-sekvenser ble anvendt: 5»-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3 «(sense) og 5′-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3′ (antisense) for YAP; 5»-GTCACCAACAGTAGCTCAGATC-3 «(sense) og 5′-AGTGATTACAGCCAGGTTAGAAAG-3′ (antisense) for TAZ; 5»-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 «(sense) og 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3» (antisense) for β-aktin.
Western Blot analyse
Cellene ble høstet i radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (for Santa Cruz Biotechnology). Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE, og overført på nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA). Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk i PBS buffer i 2 timer ved romtemperatur, før de blir målrettet ed følgende antistoffer ifølge produsentens instruksjoner: anti-Yap (1:500); anti-TAZ (1:500); og anti-aktin (1:5,000, AC40: A4700, Sigma-Aldrich, USA). Membraner ble inkubert med de tilhørende pepperrotperoksydase-konjugert (HPC) sekundære antistoffer, og de antistoff-bundne proteiner ble visualisert ved hjelp av kjemiluminescens (New England Nuclear, MA, USA).
cellevekstanalyse (MTT)
Celleproliferasjon
in vitro
ble analysert ved hjelp av tetrazoliumsalt 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT); fordi gul MTT-fargestoff er redusert til et blått formazanprodukt av respiratoriske enzymer som er aktive bare i levedyktige celler, graden av fargeendring er en indikasjon på celleproliferasjon. HCT116-celler ble transfektert i 48 timer uten noen siRNA (foreldre); spesifikke sirnas (si-Con, si-YAP, eller si-TAZ); eller ko-transfektert med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ), og suspendert i DMEM med 10% FBS. I korthet ble 2000 celler av hver klon (foreldre, Si-Con, si-YAP, si-TAZ, og si-YAP-TAZ) ble platet ut i fem 96-brønners plater i 200 ul DMEM medium. For analyse: 20 ul MTT substrat (fra en 2,5 mg /ml stamløsning i PBS) ble tilsatt til hver brønn; platene ble returnert til inkubatoren i ytterligere 4 timer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2; ble mediet fjernet; cellene ble oppløst i 150 ul dimetylsulfoksid; og kolorimetrisk analyse ble utført (bølgelengde 490 nm). Én plate ble analysert umiddelbart etter at cellene som festet seg (ca. 4 h etter plating), og de resterende platene ble analysert i løpet av de neste fire påfølgende dager.
flowcytometrisk analyse av apoptotiske celler
HCT116-celler ble transfektert i 48 timer uten noen siRNA (foreldre); spesifikke siRNA (si-Con, si-YAP, eller si-TAZ); eller ko-transfektert med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ), før den blir suspendert i PBS ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. Apoptotiske celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en Cytomics FC 500 flowcytometer (Beckman Coulter), etter inkubering av cellene med et reagens inneholdende Annexin V-FITC og propidium jodid (BD Bioscience, CA, USA) i 15 minutter i mørke ved romtemperatur .
Analyse av Invasivitet og Mobility (Migrasjon og Invasion analyser)
Cell invasjon og migrasjons potensialer ble målt
in vitro
av Transwell analyser (Millipore, Billerica, MA) som på følgende måte: HCT116-celler ble transfektert i 48 timer uten noen siRNA (foreldre); spesifikke siRNA (si-Con, si-YAP, eller si-TAZ); eller ko-transfektert med si-YAP og si-TAZ (si-YAP-TAZ); cellene ble suspendert i DMEM med 10 g /l BSA ved en tetthet på 50 celler /mL; 200 ul cellesuspensjoner ble inokulert inn i de øvre kamrene i Transwells, hvori den porøse membranen enten var belagt med Matrigel (BD Bioscience) for invasjonen analyser, eller til venstre ubelagt for migrering analyser. DMEM med 10% serum (500 ul) ble tilsatt til bunnkammeret som et kjemotiltrekkende. Etter migrering i 24 timer, eller invasjon i 48 timer ble cellene som hadde trengt igjennom filtrene fiksert i metanol og farget i 4g /l krystallfiolett. Antallet migrerte og invasive celler ble bestemt fra fem tilfeldige felt under et Olympus mikroskop (Olympus) med 10x forstørrelse.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble foretatt ved hjelp av IBM SPSS Statistisk programvare (versjon 20,0). Spearmans rank test ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom YAP og TAZ uttrykk; overlevelseskurver ble estimert ved hjelp av Kalplan-Meier metoden; og fordelinger ble evaluert av lang-rank test. Cox proporsjonale farer modellering av faktorer potensielt relatert til overlevelse ble utført for å beregne hazard ratio (HR), og identifisere hvilke faktorer som kan ha en betydelig innvirkning på overlevelse. Forskjeller i egenskaper mellom de to gruppene ble undersøkt ved Pearsons kji-kvadrat (χ
2) test og Fishers eksakte test. Alle
P
verdier ble bestemt fra 2-tailed tester og forskjeller med en
P
-verdi. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
klinisk betydningen av YAP og TAZ Overuttrykte i tykktarmskreft Tissue
for å fastslå utbredelsen og kliniske betydningen av YAP og TAZ i CRC, vurdert vi uttrykket av YAP og TAZ protein ved IHC i tumor vevsprøver fra vår retrospektiv kohort av 168 fra CRC pasienter etter tumorreseksjon. Blant de 168 pasientene var 122 (72,6%) positive for YAP uttrykk, enten kjernekraft eller cytoplasma (figur 1A); mens 46 (27,4%) var negative for YAP uttrykk (figur 1B); 97 (57,8%) prøvene var positive for TAZ uttrykk; og 71 (42,2%) var negative for TAZ uttrykk (Tall 1E og F, henholdsvis). I motsetning til dette, ble bare tre (18,75%) og 2 (12,5%) av de 16 tilgrensende normale vevsprøver funnet positive for YAP og TAZ uttrykk, henholdsvis (fig 1 C, D, G og H). I tillegg var det en signifikant positiv korrelasjon mellom YAP og TAZ (r = 0,630,
P
0,001; Tabell S1)., Noe som indikerer en mulig sammenheng mellom disse proteinene i CRC
( A) YAP-positiv tumor; (B) YAP-negative svulst; (C) YAP-positiv normalt vev; (D) YAP-negative normalt vev; (E) TAZ-positiv tumor; (F) TAZ-negativ tumor; (G) TAZ-positiv normalt vev; (H) TAZ-negative normalt vev. Representative bildene ble tatt under et mikroskop (x10). Disse resultatene indikerer den kliniske betydningen av YAP og TAZ overekspresjon i CRC vev.
Som et resultat av disse observasjonene, evaluert vi forholdet mellom YAP og TAZ uttrykk og kliniske kjennetegn CRC pasienter ved Pearsons chi kvadratet test eller Fishers eksakte test. Våre resultater viser at uttrykket av YAP og TAZ var signifikant assosiert med lymfeknute status i kolorektal tumorer (
P
= 0,001 og
P
= 0,013, henholdsvis), men ble ikke signifikant korrelert til kjønn, tumor plassering, tumorstørrelse, celledifferensiering, eller TNM trinn (tabell 2). Den høye prognostisk Virkningen av lymfeknutemetastaser, og det totale antall lymfeknuter som skal reseksjon, er veletablert. En fersk studie viste at cut-off verdier av lymfeknute ratio (forholdet mellom tumor-infiltrert noder til resected lymfeknuter) er sterke uavhengige prognostiske faktorer for CRC pasienter, basert på analyser av kliniske og histopatologiske data fra 3026 pasienter på en enkelt kirurgisk senter i løpet av en 25-års periode [18]. Disse funnene førte oss til å undersøke hvilken rolle YAP og TAZ i prognosen for CRC-pasienter.
YAP og TAZ Co-overekspresjon ble assosiert med dårlig Total overlevelse
For å finne den prognostiske betydningen av YAP og TAZ uttrykk i CRC pasienter, forsøkte vi å forholde YAP og TAZ uttrykk til de kliniske resultater. Den samlede median overlevelsestid blant pasientene i vår retrospektiv kohort var 43 måneder (spredning: 1-56 måneder), og på slutten av oppfølgingsperioden (60 måneder), 70 av de 168 pasientene var i live, og 98 pasienter var døde. Sammenhengen mellom YAP og TAZ protein uttrykk og total overlevelse av CRC pasienter ble undersøkt ved hjelp av Kaplan-Meier analyse og log-rank test for betydning estimater. Pasientene ble delt inn i to grupper: de med positivt uttrykk for YAP eller TAZ, og de med negative uttrykk for YAP eller TAZ. En statistisk signifikant forskjell ble funnet mellom total overlevelse av de to gruppene (long-rank test:
P
0,02 og
P
0,001, henholdsvis). Pasienter med høyere uttrykk av YAP eller TAZ tendens til å ha en høyere risiko for død sammenlignet med pasienter med lavere uttrykk for YAP eller TAZ, med den ujusterte HR være 1,617 og 1,643, henholdsvis. I tillegg ble celledifferensiering, lymfeknutemetastase, og TNM scene funnet å være assosiert med prognosen for CRC pasienter (Tabell 3). Multivariat analyse viste at høyere uttrykk av YAP eller TAZ var assosiert med en reduksjon av total overlevelse, med den justerte HR blir 2,168 (95% KI: 1,125 til 4,179;
P
0,001) og 1,544 (95% CI:. 0,999 til 2,451;
P
= 0,05), henholdsvis, noe som indikerer at uttrykket av YAP eller TAZ kan være en prognostisk faktor uavhengig av disse justert clinicopathologic egenskaper (Tabell 3)
Vi neste undersøkt om co-overekspresjon av YAP og TAZ kunne ha en prognostisk rolle i CRC. Våre cohort pasienter ble delt inn i fire grupper etter deres kombinerte uttrykk nivåer av YAP og TAZ. En statistisk signifikant forskjell ble observert i total overlevelse utfallet mellom disse fire undergrupper av pasienter; de med positiv ko-overekspresjon av YAP og TAZ hadde den verste total overlevelse (figur 2). Cox proporsjonal farer modell, justert for kjønn, alder, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, differensiering status, og TNM stadium, sammenlignet med YAP eller TAZ uttrykk, viste at negative uttrykk for både YAP og TAZ var forbundet med betydelig forbedret total overlevelse; mens, uttrykk for både YAP og TAZ var assosiert med signifikant dårlig total overlevelse (tabell 3), med den justerte HR blir 3,118 (95% KI: 1,017 til 9,559;
P
0,001). Disse dataene viste at YAP og TAZ co-overekspresjon kan ha en konkret og selvstendig prognostisk effekt blant CRC pasienter
(A) Korrelasjonen av YAP uttrykk med total overlevelse.; (B) korrelasjon av TAZ uttrykk med total overlevelse; (C) korrelasjon av kombinert YAP og TAZ uttrykk med total overlevelse. En statistisk signifikant forskjell er vist i total overlevelse utfallet mellom de ulike grupper av pasienter, med de som har positive co-overekspresjon av YAP og TAZ ha verste total overlevelse.
Overuttrykte YAP og TAZ i HCT116 Colon Cancer Cell linje
for ytterligere å undersøke effekten av YAP og TAZ på utviklingen av CRC, testet vi våre foreløpige kohort studie konklusjoner i cellelinje eksperimenter. Vi først undersøkte gen og protein uttrykk nivåer av YAP og TAZ i HCT116, LS174T, Løvø, SW620, og SW480 tykktarmskreft cellelinjer. HCT116-celler viste de høyeste uttrykk nivåer av både YAP og TAZ (figur 3A og B); derfor ble HCT116 cellelinje valgt for senere eksperimenter for å undersøke YAP og TAZ i CRC progresjon
(A) QRT-PCR analyse av YAP og TAZ uttrykk.; (B) Western blot-analyse av YAP og TAZ uttrykk. β-aktin er brukt som en intern kontroll lasting. HCT116 cellene viser de høyeste uttrykk nivåer av både YAP og TAZ.
Effekt av YAP eller TAZ siRNA på YAP eller TAZ nivåer i menneske HCT116 Colon Cancer Cell Lines
Vi neste undersøkte effekten av YAP og TAZ i HCT116 cellelinje gjennom knockdown av YAP eller TAZ uttrykk ved hjelp av målrettede sirnas. Spesifisiteten av siRNA målretting for YAP og TAZ ble bekreftet ved Western blot analyse. Sammenlignet med celler som hadde blitt transfektert med kontroll siRNA, ekspresjonen av YAP og TAZ var sterkt undertrykket i HCT116-celler transfektert med 10 ug av målrettede sirnas (figur 4A og figur S2).
(A) Western blot-analyse av cellelinjer med reduserte YAP og TAZ nivåer etter transfeksjon med sirnas: foreldre HCT116 cellene bærer ingen siRNA (foreldre); kontroll siRNA (SI-Con); siRNA til YAP (si-YAP); siRNA til TAZ (si-TAZ); og co-transfektert med siRNA til YAP og siRNA til TAZ (SI-YAP-TAZ). (B) MTT cellevekst analyser av kontrollceller (foreldre, si-con); celler med redusert YAP eller TAZ uttrykk (si-YAP, si-TAZ); eller celler med redusert YAP og TAZ uttrykk (si-YAP-TAZ). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, N = 3, *
P
0,05. (C) strømningscytometrisk analyse av celler farget med Annexin V-FITC-og PI: celler som bærer ingen siRNA (foreldre); kontroll siRNA (SI-Con); siRNA til YAP (si-YAP); siRNA til TAZ (si-TAZ); og celler med redusert YAP og TAZ uttrykk (si-YAP-TAZ). Disse resultatene indikerer at YAP uttrykk har en større effekt på celleproliferasjon og undertrykkelse av apoptose i forhold til TAZ ekspresjon; imidlertid en synergistisk rolle mellom YAP og TAZ øker deres samlede individuelle effekter.
Effekt av YAP og TAZ Expression på Cell Proliferation
MTT-analyser ble brukt for å fastslå effekten av redusert YAP og TAZ uttrykk på HCT116 kolon kreftcelle vekst. Gruppen transfektert med YAP siRNA viste en signifikant reduksjon i proliferasjonsrate forhold til gruppen tilført med foreldre eller kontroll sirnas. En lignende trend ble observert med TAZ siRNA; Men var effekten ikke så sterk. Gruppen som ble ko-transfektert med YAP og TAZ sirnas viste den mest dramatiske og svært signifikant (
P
0,05), redusert spredning hastighet i forhold til foreldre eller styrer siRNA grupper (figur 4B); derfor disse resultatene viste at YAP og TAZ besatt en synergistisk rolle i spredning av tykktarmskreftceller.
Effekt av YAP og TAZ Expression på HCT116-celler Apoptose Ratio
Vi deretter undersøkt forskjellen i apoptose forholdet mellom YAP og /eller TAZ knockdown grupper og kontrollgruppen for å bekrefte våre retrospektive kohort studie resultater. Strømningscytometri-analyse viste at apoptose forholdet ble redusert i HCT116-celler transfektert med YAP siRNA sammenlignet med HCT116-celler transfektert med foreldre eller Si-Con siRNA (17,48% vs. 1,62%,
P
0,05; 17,48% vs. 2,28%,
P
0,05 henholdsvis Figur 4C); effekten var noe svakere i HCT116-celler transfektert med TAZ siRNA i forhold til de som er tilført med foreldre eller si-Con siRNA (6,48% vs.1.62%,
P
0,05; 6,48% vs 2,28%,
P
0,05, henholdsvis figur 4C); imidlertid apoptose forholdet var mest dramatisk redusert i HCT116 cellene kotransfektert med YAP og TAZ sirnas forhold til de transfektert med foreldre og si-Con (33.60% vs 1,62%,
P
0,01; 33,60 % vs. 2,28%,
P
0,05, henholdsvis figur 4C). Sammen er disse resultatene indikerte at YAP uttrykk hatt en viktig rolle i å fremme celledeling og undertrykke celle apoptose; TAZ spilt en viktig, men mindre viktig rolle i denne utviklingen; og en synergistisk effekt mellom YAP og TAZ økt sin innflytelse på celleproliferasjon og apoptose videre.
Effekt av YAP og TAZ for migrasjon og invasjon
YAP og TAZ aktivitet har tidligere vist seg å mekle svulst celle migrasjon og invasjon. Vår observasjon at en reduksjon av YAP og TAZ uttrykk spilte en synergistisk rolle i hemming av celleproliferasjon og økning i apoptose av HCT116 cellene ledet oss til å vurdere effekten av YAP og TAZ siRNA kotransfeksjonen på migrasjons- og invasjons egenskapene til tykktarmskreft celler. Standard, og Matrigel-belagte Transwell-analyser ble brukt for å vurdere migrering og invasjon, respektivt. Både YAP og TAZ siRNA transfekterte celler vises statistisk signifikant redusert migrasjon sammenlignet med kontrollceller; reduksjonen var mer signifikant i gruppen tilført med TAZ siRNA; Men gruppen tilført med både YAP og TAZ viste størst effekt på reduksjon av migrasjon (Tall 5A og B). Trendene var lik i de Matrigel invasjonen analysene: kloner med redusert YAP eller TAZ nivåer viste en statistisk signifikant reduksjon av invasivitet sammenlignet med kontrollceller; effekten var mer signifikant i Taz knockdown-gruppe; ble imidlertid observert de mest betydelige reduksjonen av invasivitet når både YAP og TAZ ble slått ned (figur 5C og D).
(A) Representative bilder (× 10) av migrasjon analyser av HCT116 celler med normale nivåer av YAP og TAZ uttrykk (foreldre og si-Con); celler med undertrykte nivåer av YAP eller TAZ uttrykk (SI-YAP eller si-TAZ); og celler med undertrykt YAP og TAZ uttrykk (si-YAP-TAZ). (B) Gjennomsnittlig antall celler fra de fem uavhengige migrerings testene beskrevet i tidligere. (C) invasjon analyse av sperre HCT116-celler; si-Con celler; si-YAP; si-TAZ; og si-YAP-TAZ celler i modifisert Boyden kamre med Matrigel-belagte membraner. Etter 24 timer ble invaderende celler som hadde flyttet gjennom Matrigel membranen farget og tellet under et mikroskop ved 10 x forstørrelse. (D) Grafisk fremstilling av invaderende celler beregnet som middelverdi ± SD fra fem felt. Disse viser statistisk signifikant redusert migrasjon i både YAP og TAZ siRNA transfekterte celler sammenlignet med kontrollceller; effekten er størst i gruppen tilført med både YAP og TAZ. [Stjernene viser statistisk signifikante forskjeller i YAP eller TAZ siRNA transfekterte celler versus si-Con eller foreldreceller (*,
P
0,05; **
P
0,01) .].
Diskusjoner
YAP og TAZ er store nedstrøms mål av Hippo signalveien. Hittil har det vært en betydelig mengde bevis som knytter YAP /TAZ onkogen å tumorigenicity i flere solide typer kreft, inkludert eggstokk, bryst, prostata, lever og lunge [7], [9], [12], [15]. Overekspresjon av YAP er blitt rapportert å abnormt aktivere en oppstilling av målgener som er ansvarlige for cellevekst, overlevelse, anti-apoptose, og migrasjon [19], [20]. Videre har tidligere studier identifisert YAP som en uavhengig prognostisk markør for total overlevelse og sykdomsfrie perioder med leverkreft (HCC) pasienter; og clinicopathologically assosiert med tumor differensiering [21]. Basert på de etablerte synspunkter som YAP kan øke organ størrelse, og fungere som et onkogen [5], [9]; og at TAZ kan fremme celleproliferasjon, indusere epitelial-mesenchymale overgang (EMT), og øke celle migrasjon og invasjon [22]; kombinert med potensial likheten av vevsspesifikke funksjoner av YAP og TAZ, vi undersøkt og karakterisert den kliniske betydningen av YAP og TAZ som en selvstendig prognostisk faktor for å bestemme utfallet av CRC pasienter. Våre resultater var i samsvar med en tidligere studie [7], ved at uttrykket nivåer av både YAP og TAZ var signifikant forhøyet hos flertallet av CRC vev i forhold til tilstøtende normale vev; Men i motsetning til rapporter om brystkreft og lungekreft plateepitelkarsinom, fant vi ingen avvik mellom cytoplasma og kjernekraft uttrykk for YAP eller TAZ i CRC vev [15]. Variasjoner i uttrykket av YAP mellom ulike kreftvev er trolig på grunn av sin kompliserte svulstens mikromiljø. Ved hjelp av multivariat Cox regresjonsanalyser, har vi funnet at høy co-uttrykk for YAP og TAZ var en prognostisk prediktor for total overlevelse av CRC pasienter, uavhengig av kjønn, alder, tumorstørrelse, differensiering status, vaskulær invasjon, og TNM stadium. Videre de laveste totale overlevelses ble identifisert hos pasienter som samtidig er uttrykt YAP og TAZ, og ble assosiert med svulster som har de største kapasiteter på migrasjon og invasjon.
YAP er anerkjent som en kandidat onkogen, og ble fokus for forskning, etter at det ble identifisert i humane kromosom 11q22 fragment som er tydelig i flere humane krefttyper [14]. TAZ er en YAP paralog, først identifisert som en 14-3-3 bindende protein [23]; TAZ har tilnærmet 50% sekvensidentitet med YAP, og en lignende topologi; TAZ virker som en transkripsjons ko-aktivator på lignende måte som YAP [23]; av note, var oppdagelsen av at YAP og TAZ dele nedstrøms transkripsjonsfaktor, TEAD, for å fremme celleproliferasjon, migrasjon, forankrings-uavhengig vekst, og EMT, som alle er involvert i kreft initiering og progresjon [24]. I tillegg er mekanismene for TAZ og YAP regulering av flodhesten er like. Disse funnene foreslår felles regulering og funksjon mellom TAZ og YAP;
