Abstract
STAT6 transkripsjonsfaktor har blitt en potensiell molekyl for terapeutisk intervensjon fordi det regulerer rekke cellulære prosesser i et stort utvalg av celletyper. Selv om noen målgener og samspill partnere av STAT6 har blitt identifisert, den eksakte virkningsmekanismen må belyses. I denne studien, søkte vi ytterligere å karakterisere molekylære interaksjoner, nettverk og funksjoner av STAT6 av profilering mRNA uttrykk for STAT6 forstummet humane lungeceller (NCI-H460) ved hjelp av mikromatriser. Vår analyse avdekket 273 differensielt uttrykte gener etter STAT6 lyddemping. Analyse av genuttrykk data med Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare avslørt
Gene uttrykk, Celledød, Lipidmetabolisme
som funksjoner knyttet til høyest rangerte nettverk.
Kolesterol biosyntesen ble
blant de mest beriket trasé i IPA, samt i PANTHER analyse. Disse resultatene har blitt validert av real-time PCR og kolesterol analysen bruker egge siRNA som en negativ kontroll. Lignende funn ble også observert med human type II lunge alveolære epitelceller, A549. I den foreliggende undersøkelse har vi for første gang, vises det inverse forhold av STAT6 med kolesterolbiosyntese i lungekreftceller. Dagens funn er potensielt betydelig for å fremme forståelse og utforming av legemiddelselskap for de patologiske tilstander der både STAT6 og kolesterol biosyntese er implisert nemlig. astma, aterosklerose etc.
Citation: Dubey R, Chhabra R, Saini N (2011) Liten interfering RNA mot transkripsjonsfaktor STAT6 fører til økt kolesterol syntese i Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10,1371 /journal.pone.0028509
Redaktør: Sunil K. Ahuja, South Texas Veterans Health Care System, USA
mottatt: 9 juni 2011; Godkjent: 09.11.2011; Publisert: 05.12.2011
Copyright: © 2011 Dubey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne Institutt for bioteknologi (DBT) for å finansiere prosjektet med tittelen «Utredning av STAT6 transkripsjonsfaktor i apoptose regulering ved hjelp av RNAi teknologi «(GAP0047). RD ble finansielt støttet av DBT-prosjektet GAP0047. RC ble støttet med csir seniorstipend (Council of Scientific and Industrial Research). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
STAT6 er en av de syv medlemmene av familien av transkripsjonsfaktorer som deltar i reguleringen av genuttrykk når cellene møter ulike ekstracellulære polypeptider som cytokiner, hormoner og vekstfaktorer og regulere et bredt spekter av cellulære prosesser som proliferasjon , differensiering og apoptose [1], [2], [3], [4]. Generelt ufosforylerte STAT proteiner eksistere som latente former i cytoplasma. Den cytokine eksponering fører til STAT fosforylering av Janus-kinaser og en gang fosforylert dimerisering av individuelle STAT proteinene skje via sine SH2-domener, fulgt av migrering av funksjonell STAT dimer til kjernen hvor den kan binde DNA og direkte aktivere transkripsjon av cytokin-responsive gener [5] , [6]. Akkurat som de andre medlemmene i STAT-familien, spiller STAT6 en dobbel rolle signal svinger og aktivator av transkripsjon av enten direkte regulerer genekspresjon eller ved å samhandle med en rekke andre transkripsjonsfaktorer [7].
IL -4 og IL-13 induserte STAT6 signalering har vist seg å spille en viktig rolle i differensieringen av Th2-celler, B-celle-indusert ekspresjon av IgG og IgE og celleoverflaten visning av MHC klasse II og CD23 [8], [9] , [10], [11]. Selv om STAT6 er først og fremst kjent for å være assosiert med allergisk inflammasjon og astma, har STAT6 deregulering også vært implisert i en rekke andre sykdommer. STAT6 spiller en nøkkelrolle i T-celle hepatitt via fremmende uttrykk for eotaxins i hepatocytter og endotelceller, og induserer IL-5 uttrykk, infiltrasjon av eosinofile og nøytrofile i leveren og fører til hepatitt [12]. Det finnes bevis på at også IL-4-indusert aktivering av STAT6 er assosiert med redusert hepatisk ekspresjon av TNFa i tillegg til dempningen av leveren neutrofil rekruttering og kan beskytte mot hepatisk iskemi /reperfusjonsskade [13]. STAT6 er også blitt vist å være involvert i ciliær mechanosensation i nyre epitelcelle [14]. Nylig, IL-4 og STAT6 gene polymorfismene er også blitt funnet å være assosiert med systemisk lupus erythematosus utvikling hos kinesiske pasienter [15]. Shum
et al
i 2006 ga en kobling mellom allergisk inflammasjon og fettsyremetabolisme, hvor de har vist at et IL-4 /STAT6 regulert gen aP2, som spiller en viktig rolle i lipidmetabolisme, kreves i Th2-medierte allergisk luftveisinflammasjon [16] og nylig STAT6 har blitt funnet å spille en rolle i regulering av lipid homeostase i leveren øket lipidavsetning ble observert i STAT6 knockout-mus [17]. I tillegg til ovennevnte funn, Zhang
et al
i 2006 rapporterte at STAT6 lyddemping hemmer spredning og induserer apoptose i tykktarmskreft HT-29 celler [4]. I en annen studie, Das
et al
i 2007 fant at STAT6 er en konstitutivt uttrykt overlevelse faktor i menneskelig prostata kreft [18]. Denne effekten av STAT6 ble ytterligere styrket i en studie av Cui
et al
i 2007, hvor de har vist at ufosforylerte STAT6 transcriptionally opp regulerer COX-2 uttrykk og beskytter mot apoptose i NSCLC (ikke-småcellet lungekreft ) celler [19].
Selv om noen få mål gener og noen samspill partnere av STAT6 har vært kjent til dato, de nøyaktige mekanismene for STAT6 mediert signalering er i stor grad ukjent. I lys av dette, søkte vi å studere effekten av STAT6 lyddemping på genom brede genuttrykksmønster i NCI-H460-celler (kreft epitelial lunge). De oppnådde etter siRNA mediert stanse av STAT6 i NCI-H460-celler resultater ble også validert i A549 celler.
Materialer og metoder
Cell kultur og siRNA Transfeksjon
Lung karsinom ( NCI-H460 og A549-celler) ble oppnådd fra National Center for Cell Science, Pune, India og opprettholdt i RPMI-1640 /DMEM media, inneholdende 10% føtalt kalveserum og antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft.
for transfeksjon i 12 brønners plater, 1,2 x 10
5-celler ble sådd ut per brønn og tillatt å holde seg over natten. Dagen etter cellene ble transfektert med 60 nm validert siRNA (Ambion, USA) med 4 pl lipofektamin 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll. Der det er angitt ble celler stimulert med 50 ng /ml rekombinant, humant IL-4 (BD Pharmingen, USA) i 4 timer. Cellene ble høstet etter 24 h /48 h /72 h etter transfeksjon og anvendt for eksperimentene. Den utransfekterte og egge siRNA transfekterte cellene ble høstet etter 48 timer for alle forsøkene med mindre annet er angitt.
RNA Utvinning og Real Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA) og 2 mikrogram av RNA ble revers transkribert ved hjelp RevertAid ™ H Minus reverstranskriptase kit (Fermentas, USA) i henhold til produsentens protokoll. Real time PCR ble gjort ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Resultatene ble normalisert med 18s rRNA. Data ble analysert ved anvendelse av Pfaffl metode [20]. Primersekvensene som brukes for RT-PCR er gitt i tabell S1.
Western blotting
Cellene ble trypsinert og cellepelletene ble lysert med modifisert RIPA-buffer {50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0,25% Na deoksycholat, 1 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM natrium orthovandate, og 1 mM natriumfluorid} og holdt på is i 30 min. Lysatet ble sentrifugert ved 12000 rpm i 30 minutter og supernatanten ble samlet og protein estimering ble utført ved anvendelse av BCA-metoden. Like mengder av protein (50 pg) ble separert på 12% natrium-dodecyl-sulfat – polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membran. Membranen ble blokkert med 3% skummet melk i Tris-bufret saltvann (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) med 0,1% Tween-20 i 1 time og deretter inkubert med primært antistoff i 1% skummet melk i 2 timer fulgt av inkubasjon med passende sekundært antistoff (anti-muse-ALP bundet og /eller anti-kanin-ALP bundet) i 1 time. Blottene ble utviklet ved hjelp av NBT- BCIP som substrat. Lik lasting av protein ble bekreftet ved hjelp av GAPDH antistoff. Måling av signalintensitet på PVDF membraner etter western blotting ble utført ved hjelp AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California). De IDV Verdiene beregnes som tetthetsverdier for bestemte verdier protein band /GAPDH tetthet. Den ganger endring med hensyn til ikke-transfekterte celler, ble så beregnet på grunnlag av IDV verdier. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger; representative resultater presenteres.
Illumina Microarray
Genome bredt effekten av STAT6 lyddemping ble undersøkt ved hjelp av Illumina microarray. To biologiske replikater av utransfekterte NCI-H460-celler og NCI-H460-celler transfektert med 60 nm av STAT6 siRNA (i 48 timer) ble anvendt i matrisen eksperimentet. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, CA, USA), renset og konsentrert ved hjelp RNeasy MinElute Opprydding Kit (Qiagen, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Alle RNA-prøvene ble testet for integritet ved gelelektroforese. Den Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, TX, USA) ble brukt til å generere biotinylert, forsterket RNA. I korte trekk, ble 500 ng total-RNA reverstranskribert med en oligo (dT) primer ved bruk av ArrayScript enzym og forsterkes over natten med T7 RNA-polymerase og merket med biotin i henhold til produsentens protokoll. Dette merket forsterket RNA (Arna) ble hybridisert til Illumina Genome-Wide Expression BeadChips (Menneske Ref-6 v.3.0, Illumina, CA, USA) som representerer ~43,000 menneskelige karakterutskrifter ved 58 ° C over natten. Arrays ble inkubert med Cy3 streptavidin og vasket i henhold til produsentens protokoll. Brikken ble skannet ved hjelp av Illumina skanner (iscan) og analyse av microarray data ble gjort ved hjelp Illumina Beadstudio 2.0-programvaren. Dataene ble normalisert gjennomsnittlig og genene som krysset grensen for deteksjon p-verdi ≤ 0,05 blant alle prøver og differensial stillingen p-verdi ≤ 0.05 blant prøvene ble ansett for å være differensielt uttrykte gener. Arbeidet-flytdiagram av dette forsøk er gitt i Figur S1. Data innhentet har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus [21] og er tilgjengelig gjennom Gene Expression Omnibus (GEO) Series tiltredelse antall GSE25942 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE25942)
oppfinnsomhet pathway analyse (IPA)
datasett som representerer gener med endret uttrykk profil avledet fra mikromatriseanalyser ble importert til oppfinnsomhet pathway Analysis Tool (IPA verktøyet;. Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, USA; https://www.ingenuity.com). I IPA, er differensielt uttrykte gener kartlagt til genetiske nettverkene i oppfinnsomhet database og deretter rangert etter poengsum.
Grunnlaget for IPA-programmet består av oppfinnsomhet Pathway Knowledge Base (IPKB) som er avledet fra kjente funksjoner og interaksjoner av gener publisert i litteraturen. Dermed kan IPA verktøyet identifisering av biologiske nettverk, globale funksjoner og funksjonelle veiene for en bestemt datasett. Programmet gir også betydningen verdien av gener, de andre gener med hvilke den kommuniserer, og hvordan produktene av genene direkte eller indirekte virker på hverandre, inkludert de som ikke er involvert i mikromatriseanalyse. Nettverkene opprettet rangeres avhengig av antall betydelig uttrykte gener de inneholder og også liste sykdommer som var mest betydningsfulle. Et nettverk er en grafisk fremstilling av de molekylære forhold mellom molekyler. Molekyler er representert som noder, og den biologiske forholdet mellom to noder blir representert som en kant (line). Alle kantene er støttet av minst en referanse fra litteraturen, fra en lærebok, eller fra kanonisk informasjon som er lagret i oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base. Intensiteten av noden farge angir graden av opp- (rød) eller ned- (grønn) regulering. Noder vises ved hjelp av ulike former som representerer funksjonsklasse av genproduktet.
PANTHER analyse
PANTHER (Protein analyse gjennom evolusjonære relasjoner) Classification System er en unik ressurs som klassifiserer gener ved deres funksjoner, ved hjelp av publiserte vitenskapelige eksperimentelle bevis og evolusjonære relasjonene til å forutsi funksjon selv i fravær av direkte eksperimentelle bevis [22]. De differensielt uttrykte gener som oppnås etter STAT6 stanse i NCI-H460-celler ble importert til PANTHER (https://www.pantherdb.org/), der antall gener i hver vei ble sammenlignet mot antall gener fra NCBI s
Homo sapiens
genomet i den veien. Den binomisk test ble brukt til statistisk bestemme overrepresentasjon av PANTHER klasser. Bonferroni-korrigert p-verdiene 0,05 ble betraktet som signifikant.
Kolesterol analysen
kolesterolinnholdet ble bestemt i cellene ved hjelp av kolesterol kvantifisering kit (Biovision, CA, USA) i henhold til produsentens anvisninger. I korte trekk, 10
6-celler ble lysert og lipidene ble ekstrahert ved homogenisering med 200 ul kloroform: isopropanol: Triton X-100 (7: 11: 0,1). Disse lipid ekstrakter ble vakuumtørket i 30 min, og residuet ble oppløst i 200 ul kolesterol reaksjonsbuffer levert med kittet. Kolesterol ble beregnet ved hjelp av spektrofotometri ved λ = 570 nm i en 96-brønners plate i henhold til produsentens instruksjoner. Kolesterolnivået ble normalisert til mengder av totalt cellulært protein.
Arrangøren Analyse
For å finne frem til felles myndighetskontroller blant de endrede gener, gener av kolesterol biosyntesebanen (HMGCR- 3-hydroksy 3-metylglutaryl-koenzym A reduktase, HMGCS1- 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A-syntase 1 og IDI1- isopentenyl-difosfat delta isomerase 1) ble tatt for analyse promoter. Ensembl [23] ble brukt til å hente 5,0 kb oppstrøms regioner fra transkripsjon start nettstedene til disse genene og transkripsjonsfaktoren (e) bindende innenfor dette området ble fastsatt ved hjelp overrepresentert transkripsjonsfaktor bindingssetet Prediction (OTFBS) verktøy [24] som oppdager overrepresentert motiver av kjente transkripsjonsfaktorer for et sett av gener.
elektro~~POS=TRUNC Mobility skift assay (EMSA)
Den elektromobilitet shift-analysen ble utført som beskrevet av Shiraga
et al
. [37]. Nukleære ekstrakter ble fremstilt fra utransfekterte, siRNA-transfekterte (60 nM, 48 h /72 h) og egge siRNA transfektert NCI-H460-celler ved hjelp av NE-PER Nuclear og Cytoplasmatisk Ekstraksjonsreagens Kit (Pierce) i henhold til produsentens protokoll.
De oligonukleotidsekvenser brukes i EMSA ble tatt fra en tidligere publisert studie [25]. Dobbelt-trådet DNA ble generert ved å blande ekvimolare mengder av de komplementære oligonukleotider i sammensmeltningsbuffer (Ambion, CA, USA). Muterte sekvens av transkripsjonsfaktoren ble også benyttet for å undersøke spesifisiteten av binding av transkripsjonsfaktoren. Disse glødet dobbelttrådet DNA ble merket med [C32-P] -ATP (BRIT, Hyderabad, India) i nærvær av T4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Nukleære ekstrakter (18 ug) fra utransfekterte og siRNA-transfekterte celler ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i nærvær av reaksjonsbuffer inneholdende 8 mM Tris-KCl (pH 8,0), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 12% glycerol , 1 mg BSA og 1 mg av poly (di-dC). Enten villtype eller muterte merket dobbelttrådet oligonukleotid (40 000 cpm) ble deretter tilsatt til reaksjonsblandingen og inkubert i 45 minutter ved romtemperatur. Ved avslutning av inkuberingen, ble prøvene applisert på en ikke-reduserende 6% polyakrylamid-gel og underkastet elektroforese i 0,5 x TBE. Geler ble deretter tørket og utsatt for phosphorimager analyser (FLA 2000, Fujifilm, Japan). De densitometriske analyser ble gjort ved hjelp av AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California). Det samme størrelse rektangelet boksen ble trukket rundt hvert bånd og intensiteten av hver ble analysert ved hjelp av programmet etter subtraksjon av bakgrunnsintensiteten.
Annexin V-assay
Apoptose ble bestemt ved den Guava nexin kit og Guava PCA-systemet (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Eksponering av fosfatidylserin (PS) på celleoverflaten (forbundet med utbrudd av apoptose) danner grunnlaget for den Guava nexin analysen. Den Guava nexin-analysen benytter to flekker (annexin V og 7-amino-actinomycin D [7-AAD]). Annexin V-PE binder seg til PS på celleoverflaten av apoptotiske celler og 7-AAD, er cellen impermeant fargestoff en indikator på membran strukturell integritet. 7-AAD er ekskludert fra levende, sunn og tidlig apoptotiske celler, men gjennomsyrer sent stadium apoptotiske og døde celler. Analysen ble utført i henhold til produsentens protokoll og Annexin-PE fluorescens ble analysert ved hjelp av cytosoft programvare (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Et minimum på 2.000 hendelser ble tellet.
Cell syklus assay
For analyse av cellesyklusfordeling, ble cellene fiksert med iskald 70% etanol og ble behandlet med 1 mg /ml RNase i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter behandlet med fluorescens fargestoff propidiumjodid (50 ug /ml, Sigma, USA) som binder seg til DNA ved interkalering mellom basene ved 4 ° C i 30 minutter og analysert ved hjelp av flow cytometer (Guava Technologies, Hayward, California, USA ). Et minimum av 5000 hendelser ble talt opp.
Resultater
STAT6 downregulation hjelp STAT6 bestemt siRNA
Effekten av STAT6 spesifikke siRNA å nedregulere STAT6 uttrykk i NCI-H460-celler var evaluert av real Time PCR for RNA uttrykk og western blotting for protein nivåer. Som vist på fig. 1b, de RNA-nivåer ble redusert med 1,20 ganger på 24 timer, 2,12 ganger (p-verdi = 0,046) på 48 timer og ved 1,66 ganger (p-verdi = 0,05) på 72 timer i siRNA transfekterte NCI-H460-celler i forhold til utransfekterte NCI-H460 celler. Det var ingen signifikant endring i utransfekterte celler og egge siRNA transfekterte cellene ved ulike tidspunkt. Imidlertid ble proteinnivåer STAT6 redusert på en tidsavhengig måte. Som vist på fig. 1a og 1b, var det 1,12 ganger reduksjon på 24 timer, 1,79 ganger (p-verdi = 0,02) reduksjon på 48 t og 2,40 ganger (p-verdi = 0,028) reduksjon på 72 timer etter transfeksjon av STAT6 spesifikke siRNA i NCI-H460-celler i sammenlignet med ikke-transfekterte NCI-H460-celler ved respektive tidspunkter. Vi neste sjekket uttrykk for fosforylert STAT6 (pSTAT6) protein som er aktivert signalform STAT6. I samsvar med STAT6 proteinnivå, ble ekspresjonen av pSTAT6 proteinnivåene også redusert i en tidsavhengig måte. Det var 1,13 ganger reduksjon på 24 timer, 1,85 ganger (p-verdi = 0,0008) reduksjon på 48 t og 2,67 ganger (p-verdi = 0,001) reduksjon på 72 timer etter transfeksjon av STAT6 spesifikke siRNA i NCI-H460-celler sammenlignet med utransfekterte NCI -H460 cellene ved respektive tidspunkter (fig. 1a og b). ble observert uten vesentlige endringer i celler transfektert med egge siRNA (negativ kontroll) ved ulike tidspunkt.
a) western blot av STAT6 og fosforylert form av STAT6 (pSTAT6) protein på celleekstrakter fra utransfekterte, STAT6 spesifikk siRNA og egge siRNA transfekterte NCI-H460-celler på ulike tidspunkter som angitt. b) Diagram representerer ganger endring i STAT6 mRNA nivå, STAT6 protein og pSTAT6 protein nivå sammenlignet med ikke-transfekterte NCI-H460-celler ved respektive tidspunkter. Egge siRNA ved ulike tidspunkt ble brukt som en negativ kontroll. GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting densitometrisk analyse for western blot-analyse. De mRNA nivåer ble normalisert til 18s rRNA uttrykk i sanntid PCR-analyse. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler. ** Indikerer p-verdi 0,01 i forhold til ikke-transfekterte celler. c).
Genome brede effekter av STAT6 stanse i NCI-H460 cellelinje ved hjelp av Illumina microarray
genuttrykket profiler i utransfekterte NCI-H460-celler og NCI-H460-celler transfektert med STAT6 siRNA ble bestemt ved Illumina microarray med to biologiske replikater. Illumina rekke eksperiment identifisert 273 differensielt uttrykte gener (
187 downregulated og 86 oppregulert)
. Rådata ble analysert ved hjelp av Beadstudio 2.0-programvaren. Matrisen data var gjennomsnittlig normalisert og filtrert ved påvisning av en p-verdi ≤ 0,05 og differensial p-verdi ≤ 0,05. Listen over differensielt uttrykte gener sammen med sine fold endringer er gitt i tabell S2.
Opplysning av trasé og interaksjoner mellom forskjellig uttrykt gener
For å undersøke mulige biologiske interaksjoner av forskjellig regulerte gener, datasett representerer gener med endret uttrykk profil avledet fra microarray analyser ble importert til oppfinnsomhet Pathway Analysis Tool.
listen over differensielt uttrykte gener analysert av IPA avslørte 20 betydelige nettverk (Tabell S3). Fig. 2a representerer en liste over topp 5 nettverk identifisert av IPA. Av disse nettverkene,
Gene uttrykk, Celledød, Lipidmetabolisme
var høyest rangerte nettverk med 28 fokus molekyler og betydningen score på 54 (fig. 2b). At resultatet er sannsynligheten for at en samling av gener som er lik eller større enn antallet i et nettverk kan oppnås ved en tilfeldighet alene. En score på 3 indikerer en 1/1000 sjanse for at fokus genene er i et nettverk som ikke skyldes tilfeldigheter. Listen av gener i dette nettverket med sine respektive fold endringer i rekken data er gitt i tabell S4.
For å undersøke mulige interaksjoner av forskjellig regulerte gener, datasett som representerer 273 gener med endret uttrykk profil hentet fra Illumina microarray ble importert til oppfinnsomhet Pathway Analysis Tool og følgende data er illustrert: a) liste over topp fem nettverk med sine respektive skårer oppnådd fra IPA b) de høyest rangerte nettverk i IPA analyse nettverket representasjon av de høyest rangerte nettverk ( Gene Expression celledød, Lipidmetabolisme). Genene som er skyggelagt var fast bestemt på å være betydelig fra den statistiske analysen. Genene skraverte rød er oppregulert og de som er grønne er nedregulert. Intensiteten av skyggelegging viser i hvilken grad hvert gen ble opp eller nedregulert. En heltrukket linje representerer en direkte interaksjon mellom de to genprodukter og en stiplet linje betyr at det er en indirekte interaksjon. Genene er merket med blå stjerne har blitt validert av real time PCR. Gener assosiert med Gene uttrykk, celledød og Lipidmetabolisme er sirklet med oransje, blå og lilla farger, henholdsvis. c) liste Toxicology sti i IPA analyse. X-aksen representerer de beste toksikologi fungerer som beregnes ved IPA basert på forskjellig uttrykt gener er uthevet og y-aksen representerer forholdet mellom antall gener fra datasettet som tilordnes til veien og antallet av alle kjente gener tilskrives sti. Den gule linjen representerer terskelen til p verdi 0,05 som beregnes ved Fischer test.
IPA analysen også grupper av forskjellig uttrykt gener i biologiske mekanismer som er relatert til toksisitet grupper. I toksikologi listen,
Kolesterol biosyntese og p53 signale
kom ut til å være de to øverste viktigste trasé med en p-verdi på 0,011 og 0,013, henholdsvis (fig. 2c). Genene i forbindelse med topp tox listen er også gitt i tabell S5.
Samtidig ble uttrykt forskjellig genet liste oppnådd etter STAT6 stanse i NCI-H460-celler matet inn i PANTHER web-ressurs for å avsløre beriket veier. Interessant i denne analysen for vi fant kolesterol biosyntese og apoptose signalering blant de betydelig beriket trasé. Trasé som passerte grensen for p-verdien 0,05 i PANTHER analyse er oppført i Tabell 1.
STAT6 stanse øker uttrykket av gener assosiert med kolesterol biosyntese /homeostase og forbedrer kolesterolnivået
Siden den øverste nettverket oppnådd i IPA analyse var
Gene uttrykk, Celledød, Lipidmetabolisme Hotell og kolesterol biosyntese kom ut beriket både IPA og PANTHER analyse vi sjekket endringer i kolesterolnivå etter STAT6 stanse av siRNA i NCI-H460-celler. Egge siRNA ble brukt som en negativ kontroll. Fig. 3a viser at STAT6 lyddemping økt kolesterolnivå i en tidsavhengig måte, med 1,23 ganger økning på 24 timer, 1,8 ganger (p-verdi = 0,005) øke med 48 t og 2,3 ganger (p-verdi = 0,004) øke med 72 timer etter transfeksjon av siRNA i NCI-H460-celler. Men ingen slik endring ble observert i kolesterolnivået i NCI-H460-celler transfektert med egge siRNA. Vi har også oppnådd tilsvarende resultater i A549-celler (fig. 3a). Det var 1,28 ganger økning etter 24 timer, 1,6 ganger økning (p-verdi = 0,03) ved 48 timer og 2,2 ganger økning (p-verdi = 0,04) ved 72 timer etter transfeksjon av siRNA i A549-celler, hvilket indikerer at økningen i kolesterolnivået kan være en generell effekt av STAT6 stanse på lungeceller.
De totale kolesterolnivået etter STAT6 knockdown ble kontrollert ved ulike tidspunkt i NCI-H460 og A549 celler. Egge siRNA ble brukt som negativ kontroll. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler. a) Western blot-analyse ble utført for å analysere endringer i ekspresjonen av pSTAT6 protein på IL-4-behandling i NCI-H460-celler. GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting densitometrisk analyse. Graf representerer ganger endring i protein uttrykk i forhold til utransfekterte NCI-H460-celler. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler. b) Real Time PCR ble utført for å bestemme endringer i ekspresjonsnivået av gener relatert til kolesterolbiosyntese og homeostase i NCI-H460-celler og A549-celler 48 timer etter transfeksjon av STAT6 spesifikk siRNA. Prøvene ble normalisert til 18S rRNA uttrykk. Den virkelige tidsdata er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler. c) Kolesterol analyse ble utført for å bestemme virkningen av IL-4-behandling på kolesterolnivået i utransfekterte og siRNA transfektert NCI-H460-celler og A549-celler. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre paralleller. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler. d) western blot av HMGCS1, HMGCR og IDI1 ble gjort på celle ekstrakter fra utransfekterte og siRNA transfekterte NCI-H460-celler ved ulike tidspunkt. GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting densitometrisk analyse. Graf representerer ganger endring i protein uttrykk i forhold til utransfekterte NCI-H460-celler. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter. * Indikerer p-verdi 0,05 i forhold til ikke-transfekterte celler.
Siden IL-4 er kjent for å fosforylere STAT6, ønsket vi å se for rollen som IL-4 i kolesterolsyntesen. I NCI-H460-celler, var 1,48 ganger (p-verdi = 0,01) endring i nivået av pSTAT6 (fosforylert form av STAT6) protein etter IL-4-behandling, 0,48 fold (p-verdi = 0,01) forandring etter transfeksjon av STAT6 siRNA og 0,69 fold (p-verdi = 0,05) forandring når cellene transfektert med STAT6 siRNA ble behandlet med IL-4 (fig. 3b). Tilsvarende til dette, var det 0,8 ganger (p-verdi = 0,05) endring i kolesterolnivåer etter IL-4 behandling, 1,5 ganger (p-verdi = 0,01) endring etter transfeksjon av STAT6 siRNA og 1,32 ganger (p-verdi = 0,03) endres når cellene transfektert med STAT6 siRNA ble behandlet med IL-4 (fig. 3d). Lignende resultater ble også observert i A549-cellelinjen (fig. 3d).
neste sett for differensielt uttrykte gener assosiert med kolesterol-biosyntesen /homeostase oppnådd fra mikroarray data. I samsvar med Illumina array-data, ble transkripsjonsnivåer av disse genene bekreftet å være oppregulert ved real time PCR. Vi observerte 1,27 gangers (p-verdi = 0,03) økning i HMGCR nivåer, som er den sentrale regulerings enzymet av kolesterolbiosyntesen svei. Vi har også observert 1,94 ganger (p-verdi = 0,03) økning i HMGCS1, 2,7 ganger økning i IDI1, 4,2 ganger (p-verdi = 0,04) økning i CYP27B1
(cytokrom P450, familie 27, underfamilien B, polypeptid 1)
, og 3,0 ganger økning i INSIG1
(Insulin-indusert gen 1)
nivåer ved 48 timer etter transfeksjon av NCI-H460-celler med STAT6 spesifikk siRNA i forhold til de ikke-transfekterte NCI-H460-celler (fig. 3c).
Lignende økning i transkripsjonsnivåer av disse genene ble også observert i en annen lungecancercellelinje, A549 (fig. 3c), hvor vi observerte 1,6 ganger (p-verdi = 0,03) økning i HMGCR nivåer, 1,4 gangers økning i HMGCS1, 1,56 gangers økning i IDI1, 2,4 gangers økning i CYP27B1, og 1,25 ganger økning i INSIG1 nivåer ved 48 timer etter transfeksjon av A549-celler med STAT6 spesifikk siRNA i forhold til de ikke-transfekterte A549 celler. Dette innebærer at effekten av STAT6 demping er generell og ikke er begrenset til noen spesiell kreftcellelungelinjen.
proteinnivåer HMGCR, HMGCS1 og IDI1 ble også undersøkt i utransfekterte og siRNA transfektert NCI-H460-celler ved 48h og 72h post transfeksjon. Det var 2,9, 3,5 (p-verdi = 0,048) og 4,3 ganger økning i HMGCS1 nivåer, 0,94, 1,8 og 2,4 (p-verdi = 0,03) ganger økning i HMGCR nivåer, 1,6, 2,4 og 2,5 (p-verdi = 0,024) ganger økning i Som vist på fig. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
