Abstract
Metastatisk celler migrerer fra stedet av primærtumor, gjennom stroma, inn i blod og lymfekar, endelig kolonisere diverse andre vev til danne sekundære svulster. Tallrike studier har blitt gjort for å identifisere de stimuli som driver metastatisk kaskade. Dette har ført til identifisering av flere biokjemiske signaler som fremmer metastasering. Men informasjon om rollen av mekaniske faktorer i kreft metastase har vært begrenset til påvirke av etterlevelse. Interessant, er svulsten mikromiljøet rik på mange celletyper, inkludert svært kontraktile celler som er ansvarlig for omfattende ombygging og produksjon av den tette ekstracellulære matrise rundt kreftvev. Vi hypotese at de mekaniske krefter som produseres ved ombygging aktivitet av celler i svulsten mikromiljøet bidra til invasjonen effektiviteten av metastatiske celler. Vi har oppdaget en signifikant forskjell i graden av invasjon i mekanisk stimulerte versene ikke-stimulert cellekulturmiljøer. Videre er dette mekanisk forbedret invasjon avhengig av substratet proteinsammensetningen, og påvirket av topografi. Til slutt er det funnet at proteinet cofilin er nødvendig for å avføle de mekaniske stimuli som forbedrer invasjon. Vi konkluderer med at andre typer av mekaniske signaler i svulsten mikromiljøet, i tillegg til den stivhet, kan forbedre invasive evnene til kreftceller
in vitro
. Vi har videre foreslår at
in vivo,
ikke-kreftceller som befinner seg i tumor-mikromiljøet kan være i stand til å gi den nødvendige mekaniske stimulus under ombygging av ekstracellulær matriks som omgir tumoren.
Citation: Menon S, Beningo KA (2011) Cancer Cell Invasion forsterkes av Applied mekanisk stimulering. PLoS ONE 6 (2): e17277. doi: 10,1371 /journal.pone.0017277
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 15 august 2010; Godkjent: 27 januar 2011; Publisert: 17 februar 2011
Copyright: © 2011 Menon, Beningo. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av en Wayne State University Faculty stipend til KAB og Wayne State University Graduate Research Award og Enhancement Midler til SM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den avgjørende øyeblikk i klassifiseringen av en svulst som godartet eller ondartet løgner i kreftceller evne til å bryte basalmembran. Utvidelsen av invasive strukturer, slik som invadopodia, gjør det mulig for tumorcelle for å trenge gjennom basalmembran og mellomliggende stroma gjennom enzymatisk og fysiske midler [1] – [3]. Imidlertid vil tumorcellen ikke gå langt uten ytterligere mulighet til å migrere. Den kreftceller oppkjøpet av invasive og trekkende egenskaper gir mulighet til å gå inn og ut av lymfesystemet eller vaskulære systemet og etablere sekundære svulster i fremmed vev, og dermed fullføre kompleks sekvens av hendelser innen invasjonen-metastase kaskade [4], [5] . Det er disse sekundære svulster som utgjør mer enn 90% av kreftdødsfall, men vår forståelse av invasjon og metastasering er ufullstendig. Mye av forskningen har fokusert på iboende genetiske og biokjemiske faktorer som utløser primærtumordannelse og påfølgende metastasering. Imidlertid har nyere studier identifisert både fysiske og biokjemiske faktorer i svulsten mikromiljøet som også bidrar til kreft progresjon [6], [7].
stroma rundt en svulst er i kontinuerlig endring i sammensetning og struktur som primære tumorceller videre til invasjon og metastase, en prosess kalt stromagenesis [8], [9]. Svulsten stroma blir anriket i ekstracellulær matriks (ECM) proteiner og ikke-tumorceller, inkludert fibroblaster, makrofager, adipocytter, og pericytes [8] – [12]. Biokjemiske signalisering fra stroma til tumorcellene kan fremme spredning og invasivitet. For eksempel er tumorassosierte makrofager etablere en EGF-CSF-en parakrin signale sløyfe med tumorceller som fremmer tumorcellebevegelse [10]. De mekaniske egenskaper av stroma kan også øke tumorprogresjon. For eksempel er det stroma som omgir en svulst anriket i både type I kollagen og fibronektin, og skaper en tettere og mekanisk stiv vev sammenlignet med normalt vev [7]. Denne økede stivhet øker tumorcellevekst og spredning [13] – [15]. Nyere studier indikerer også at fysisk strekking fibronektin kan utløse en mekanisk respons bane i normale fibroblaster [16] – [18]. Med den økte mengde av fibronektin i stroma, kan disse observasjonene tyder på en potensiell mekanisme for den mekaniske responsen av tumorceller.
Det er en rekke av mekaniske krefter, bortsett fra endringen i samsvar, som kan påvirke progresjon av kreft. En slik kraft kan bli avledet fra stromale cellebevegelser eller matrisen ombygging aktiviteten av de svært kontraktile celler av stroma, inkludert fibroblaster og myofibroblasts. Myofibroblasts har vist seg å skille fra normalt vev fibroblaster, og deres produksjon og ombygging av ECM øker proliferasjon og spredning av tumorceller [19], [20]. Oppbyggingen av stromale myofibroblasts er et definerende trekk ved desmoplasia oftest assosiert med invasiv kreft i bryst, mage traktater, lunger, bukspyttkjertel og plateepitelkarsinom for å nevne noen [9]. I tillegg til den høye I kollagen type, blir myofibroblasts identifisert ved deres ekspresjon av alfa-glattmuskel aktin [7], [9], [21], [22]. Alfa-glattmuskel-aktin forbinder med ikke-muskel myosin for å danne sterkt sammentrekkende microfilamentous enheter som ender ved overflaten av en myofibroblast i en fibronexus [23]. Dette er karakteristiske trekk ved myofibroblasts og danner et mekanisk-transduksjon system som fungerer i innsiden ut og utsiden-i kraftoverføring [23] – [25]. I ombygging ECM i stroma, de myofibroblasts produsere en mekanisk stimulus som de slepebåt og dra på fibrene [26]. Dette fører oss til spørsmålet vi ta opp i denne studien. Kan de anvendte mekaniske krefter generert av ombygging av ECM og trekke på ECM med stromale celler bidrar til de invasive egenskapene til en svulst celle? Kan de gi en «komme hit» stimulus som oppfordrer kreftceller til å forlate svulsten?
Her kan vi rapportere at en mekanisk stimulus for å trekke og frigi påført en kollagen matrise
in vitro
gjør faktisk forbedre invasjonen av kreftceller i et fibronektin-avhengig måte. Denne evne synes å være unik for kreftceller som er kjent for å være meget invasiv, invasiv som dårlig og normale celler ikke reagerer på samme måte til denne stimulus. Til slutt, ved hjelp av genet Slå vi fastslått at cofilin, en normal del av invadopodia, er nødvendig for å oppfatte dette mekanisk signal for økt invasjon. Denne studien viser at fysiske faktorer, utover compliance, er involvert i å fremme eksisterende invasiv oppførsel i kreftceller og at mekaniske signaler overført fra den fysiske aktiviteten av celler i stroma kan potensere progresjon av kreft.
Materialer og Metoder
Cell Culture
HT1080 menneskelige fibrosarkom celler, B16F10 mus melanom celler og mus embryonale fibroblaster (MEF) celler brukt i denne studien, ble kjøpt fra ATCC og dyrkes og vedlikeholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium – høy glukose (Sigma) og 10% FBS (Hyclone). Celler ble passert ved trypsinering å bruke 0,25% Trypsin-EDTA, blir reaksjonen terminert med komplett medium. Passasjen nummeret til celletype stiger aldri åtte passasjer.
Invasion matriser
For å skape en kultur godt for tykke (1 mm) matriser, en aktivert dekk [27] ble festet med vakuum fett til bunnen av en dyrkningsskål (Nunclon) inn i hvilken et 20 mm hull hadde blitt boret.
matriksen er sammensatt av 2,5 mg /ml (eller 4,5 mg /ml, fig S2) type i-kollagen (PureColl og Nutragen, Advanced Biomatrix), 20 pg /ml fibronektin (Sigma) og 4 pl av 1-2 um karboksylerte paramagnetiske kuler (Polysciences Inc.). PH-verdien i blandingen ble justert til 7,4 ± 0,2 med 0,1 N NaOH og 10X PBS. For «Kollagen only» substrater, alt unntatt fibronektin tilsettes til matriksen blandingen. Alle komponentene ble kjølt og blandet ved 4 ° C. 500 ul av matriseoppløsningen ble tilsatt til en avkjølt kultur brønn, og et 25 mm dekkglass ble dryppet på gelen blandingen for å oppnå en flat overflate. For polymeriseringen ble den matrise oppløsningen plassert ved 37 ° C i 30 minutter. Etter polymeriseringen, ble 3 ml av media tilsatt til substratene og den øvre dekkglass ble fjernet. Substratene ble deretter sterilisert i en kultur hette under ultrafiolett lys i 15 minutter i en avstand av 25 inches fra lyskilden.
Invasion Assay
Cellene ble sådd ut på 1,5 x 10
4 celler /ml sterilisert ut mot matrisen og tillates å følge i 1 time ved 37 ° C /5% CO
2. For hvert forsøk ble en seeded matrise inkubert ved 37 ° C /5% CO
2 1,5 cm over en magnet av sjeldne jordarter av 12100 Gauss (25 mm i diameter og 5,5 mm i tykkelse). En andre seeded matrise ble inkubert utenfor det magnetiske felt. Magneten ble rotert under kulturen ved 160 rpm (2,6 Hz) i en orbital innen 2 cm på en orbital shaker (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-Type 50 800). Denne dreining frekvens ble opprettholdt den samme for alle analyser er beskrevet. Invasjonen Analysen ble også utført med magneten roteres ved lavere frekvenser (8 og 90 rpm (0,13 og 1,5 Hz)) som angitt. Den cellulære responsen ble registrert i 25 tilfeldig utvalgte mikroskop felt på 24 timer med en 10X fase objektiv på en Olympus IX81 mikroskop. Celletall ble nedtegnet ved åtte trinn på 100 um /trinn innenfor den z-planet av matrisen. Prosentvis invasjon ble beregnet som prosent av invaderte celler i forhold til det totale celletall. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av to-tailed studenter T-test
peptid hemmer eksperimenter ble utført som ovenfor.; 1,5 x 10
4 celler /ml ble sådd ut på substratene, etterfulgt av 100 ug /ml av peptidet GRGDS eller GRGES (kontroll) peptid (Bachem Americas Inc.) suspendert i vann. Prosent invasjon ble beregnet ut 24 timer etter starten av stimuleringen.
oppadgående bølgen Assay
kultur brønner substratene ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Imidlertid celler ble først sådd direkte på dekkglass belagt med et tynt lag av type I kollagen (200 ug /ml) og fibronectin (62,5 ug /ml) før overlapping av matrisen. Cellene fikk lov til å følge over natten i media ved 37 ° C og 5% CO
2. Mediet ble fjernet og cellene ble deretter overlagt med upolymerisert kollagen /fibronektin matrise, som beskrevet ovenfor. Media ble erstattet følgende polymerisasjon. For hvert forsøk ble en seeded kledde matrise var dyrkede 1,5 cm under en magnet av sjeldne jordarter av 12100 Gauss (25 mm i diameter og 5,5 mm i tykkelse) og en andre ble holdt utenfor magnetfeltet. Magneten ble rotert over kulturen holdt i et stativ plassert på orbitalrister (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-type 50800) og rotert ved 160 rpm (2,6 Hz) på en orbital felt på 2 cm. Prosent invasjon og statistisk analyse ble beskrevet ovenfor.
Actin depolymerization
HT1080 celler ble sådd på collagen /fibronektin underlag. Etter at cellene hadde klebet og spredt på substratene, 2 uM av Cytochalasin B (Sigma) resuspendert i DMSO eller et tilsvarende volum av DMSO ble tilsatt til separate plater. Disse ble deretter brukt direkte for invasjonen analysen.
Cofilin knockdown
CFL1 siGENOME SMARTpool og Off-target siRNA (Dharmacon RNAi Technology, Thermo Scientific) ble brukt for å dempe uttrykk for Cofilin og som kontroller hhv. RNA ble innført i celler ved nucleofection hjelp av en Amaxa Nucleofector II og løsninger fra Kit T. Proteiner ble hentet for western analyse fra forstummet og kontroll HT1080 celler ved hjelp av en trippel vaskemiddel lysis buffer (100 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0,5% natrium deoksycholat, 0,2% SDS, 2% Nonidet P-40) inneholdende protease inhibitor cocktail (Sigma) ved 24, 48 timer og 72 timer post nucleofection for å bekrefte knockdown. Anti-cofilin monoklonalt antistoff, ab54532 (Abcam) og anti-mus HRP-merket antistoff (Amersham) ble brukt for å undersøke de vestlige blotter og oppdaget med ECL Plus Western blotting Detection reagenser (Amersham).
Invasion Assay Bruke Cofilin siRNA og Cytochalasin B behandlet HT1080 Cells
invasjon analysen ble utført ved hjelp av kontroll siRNA og Cofilin siRNA behandlet HT1080 celler. Siden cofilin knockdown er effektiv 48 timer post nucleofection, ble de behandlede celler sådd ut på substratene ved 48-timers tidspunktet. Etter at cellene hadde overholdt, ble en seeded matrise for hver av de betingelser som er plassert over magneten roterte ved 160 opm (2,6 Hz), mens den andre ble plassert utenfor magnetfeltet. Analysen ble også utført ved anvendelse av Cytochalasin B eller DMSO-behandlede celler. I hvert tilfelle ble en seeded matrise tilgjengelig magnetisk stimulering ved 160 rpm (2.6 Hz), mens den andre grunnmasse ble anbragt utenfor magnetfeltet. Den cellulære respons for hver av de fire betingelser ble målt 24 og 48 timer etter start av stimuleringen. Prosentvis invasjonen ble beregnet og statistiske analyser ble utført ved hjelp av en to-tailed student t-test.
Western Blot av fibronektin Utskillelse av HT1080 celler
1,5 × 10
4 celler /ml HT1080 cellene ble dyrket i serumfritt DMEM-medium og sådd ut på kollagenbelagte bare matriser, fremstilt som beskrevet ovenfor, og standard invasjonen analysen ble utført. Etter 24 timers stimulering, ble kulturene skrapet inn i et mikro-sentrifugerør inneholdende 2 mg /ml Collagenase type 4 (Worthington Biochemical Corporation) i Hanks «balanserte saltoppløsning (Gibco, Invitrogen). Kollagenmatriksen ble oppløseliggjort i 10 minutter ved forsiktig risting i røret ved 37 ° C og cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter, ble supernatanten anvendt for analyse. Celleekstrakter av HT1080 celler og MEF celler dyrket på 100 mm polystyrenblokken kultur retter til 80% konfluens over 48 timer ble også fremstilt. Den cellelysering og protein ekstraksjon ble utført som beskrevet ovenfor. Standard SDS-PAGE ble utført ved anvendelse av 30 ug av total protein fra MEF og HT1080 celleekstrakter og 35 ul av kollagenase suspensjon. Western blots ble fremstilt og probet med muse-monoklonalt [IST-9] til fibronektin (1:300), ab6328 (Abcam) i 5% melk i TBS, fulgt av et HRP geite-anti-mus-Ig (BD Pharmingen) sekundært antistoff (1: 1000) og oppdaget som ovenfor.
Resultater
Structural design av Mechanical Invasion analysen
målet med denne studien var å finne ut om påføres mekanisk stimulering, slik som de simulere re-modellering av den ekstracellulære matriks, kan forbedre prosessen for invasjonen. For å løse vår hypotese, som er utformet vi et nytt analysesystem hvor mekanisk stimulering kunne anvendes i fravær av utskilte biokjemiske faktorer. Vår hensikt var å skape en metode som brukes kommersielt tilgjengelige komponenter, nødvendig standard utstyr, forutsatt kontroll av biokjemiske og mekaniske parametre, alt i en ramme som var optisk kompatibel med en vanlig fluorescerende mikroskop. Vi valgte å bruke en type I kollagen matriks som vanligvis anvendes for invasjon analyser, resonnement at stroma er sterkt anriket i denne ekstracellulært matriksprotein. Karboksylerte fluorescerende paramagnetiske mikrokuler ble innleiret i matrisen for å tilveiebringe mekanisk stimulering. For å fremstille en forbigående magnetisk trekk, uten behov for en mikron størrelse elektro-magnet, roteres vi en magnet av sjeldne jordarter på en roterende mikser under kulturen mens kulturen ble suspendert over magneten (figur 1A). Hele kultursystemet kan bli opprettholdt i løpet av en standard vevskulturinkubator (figur 1 B, C).
A) En brønn blir opprettet i en 60 mm kulturskål og fylt med en type I kollagen /fibronektin matriks inneholdende 2 mikrometer paramagnetiske perler. Cellene blir sådd ut på overflaten av matriksen og enten dyrket utsiden av et magnetisk felt eller kultur 1,5 cm over et roterende magnet av sjeldne jordarter. Etter stimulering ble celler invadere matrisen. B) 60 mm plate med et 20 mm hull boret inn i den, med et aktivert dekk limt til bunnen, danner en brønn for matrisen. C) Kulturen ble suspendert 1,5 cm over et sjeldent jord magnet plassert på en orbital-rystemaskin i løpet av en typisk cellekulturinkubator. Se metoder for detaljer.
Hvis du vil kontrollere at magneten var i stand til å produsere nok magnetisk kraft og at den innebygde perler svart på kraften i en forbigående måte, vi brukte en magnometer å måle den magnetiske kraft ved definerte eksperimentelle avstander. Vi har oppdaget en på magnetiske kuler ved et fast punkt i sentrum av kulturen kan bli utsatt for en rekke 500-80 Gauss som de sjeldne jordarter magneten roterer 1,5 cm under dyrkningsskålen mens fullføre en bane av 2 cm ved 160 rpm (2,6 Hz) (figur 2A). Simulering på disse avstandene under mikroskop resulterte i perle forskyvninger av ca 0,5-5 mikrometer (figur 2B, Movie S1, Movie S2). Kulene ble observert å fjære tilbake til sin opprinnelige stilling i x-y-planet etter at magneten er fjernet, en indikasjon på deres feste til kollagen matriksen og opprettholdelse av integriteten til gelnettverket. For å bestemme den fysiologiske betydningen av denne forskyvning, anerkjent vi at man kan beregne hvor mye kraft som ble påført på den perle av magneten, men en mer konkret test ville være å observere MEF-celler strekke ut og trekke utvidelser i vårt kontrollert kultursystemet. Vi registrert perle forskyvninger i x-y-planet fra cellulære utvidelser av MEF-celler som spenner 0,08 til 5,1 um (figur 2C, Film S3). Dette er en konservativ sammenligning med de typer av forskyvninger som kan oppstå i stroma gitt at de kontraktile celletype funnet der, myofibroblasts, produserer betydelig mer kraft enn en MEF [28], [29].
A) en sjelden jordmagnet plassert 1,5 cm under en matrise frembringer en gradient felt som strekker seg fra 500 G til 80G i matriksen når den roterer i en 2 cm bane. En paramagnetisk vulst ved stilling X vil motta en magnetisk kraft av 500G, ~300G og ~200G når magneten bane i posisjon P1, P2 og P3 hhv. B) serie av fire bilder som viser forskyvningen av perler av magneten når den holdes i stasjonære stillinger i bane. Klynger av perler reagerer på mekanisk stimulus og viser et posisjonsskifte er avgrenset ved hjelp av en sirkel, en firkant og en pil. Fra venstre til høyre, en bilde er utenfor det magnetiske felt, mens den andre og tredje bilder ble tatt med magneten holdes i posisjon P1 og P2 hhv. Det endelige bildet viser kulene tilbake til sin opprinnelige stilling etter at magneten er fjernet. C) MEF cellulære extensions forårsake fluorescerende perle forskyvning. Fire bilder (0, 15, 30 og 60 minutter) fra en enkelt fokalplan ble valgt ut fra en serie på 30 fasebilder tatt hver 2 minutter av en MEF celle i et kollagen /fibronektin matrise. Celle skisserer og tilsvarende fluorescerende perle Bildene vises. En perle gjennomgår forskyvning er skissert ved hjelp av en hvit rektangulær boks. Området innenfor boksen fra alle de fire bildene har blitt utvidet og vises med en innsats linjal for å vise perle forskyvning mer tydelig. Kontrasten i det forstørrede bildene har blitt endret for å bedre reflektere posisjonen til perle i hvert enkelt tilfelle. Mag. Bar = 10 mikrometer.
mekanisk stimulering Forbedrer invasjonen av kreftceller
Invasive strukturer har tidligere blitt beskrevet i både iboende normale invasive celler og i de som har kjøpt deres invasive kapasitet under kreft progresjon [30]. Vi antok at det var usannsynlig at mekanisk stimulering ville indusere en tidligere ikke-invasiv celletype for å invadere og dermed vi testet i celler kjent for å være meget inngripende i vårt analysesystemet. Vi valgte å teste human fibrosarcom-cellelinjen HT1080 og musemelanomcellelinje B16F10, mens den ikke-invasiv MEF-cellelinjen tjente som kontroll.
Disse celletyper ble testet for deres evne til å reagere på den mekaniske stimulering forutsatt i analysen. I korte trekk ble celler sådd ut på matriser fremstilt, som beskrevet i metodene, og tillates å følge i 30 minutter før start av stimuleringen. Celler dyrket på matrikser med identisk sammensetning, men ikke utsatt for magnetisk stimulering, tjente som kontroller. Celler dyrket på matriser mangler magnetiske kuler, men er utsatt for magnetisk stimulering fungerte som flere kontroller. Invasjon ble observert under mikroskop som begynner ved 5 mikrometer fra overflaten til en dybde på 800 um i matriksen (Figur 3A). Antallet invaderende og ikke-invaderende celler ble tellet etter 24 timers stimulering og beregnet som prosent invasjon.
A) HT1080 fibrosarkom celler ble sådd ut på type I kollagen /fibronektin-matriser inneholdende paramagnetiske kuler og dyrket i henhold til enten magnetisk stimulering eller uten stimulering. En kombinert fase og fluoriserende bilde av en mekanisk stimulert kultur ble overlagret. De solide pilen peker på en celle som har invadert. Den stiplede pilen indikerer en annen celle i en annen fokusplan. De tomme pilen peker på et fluorescerende paramagnetisk perle. Mag. Bar = 50 mikrometer. B) invasjon av HT1080 cellene under mekanisk stimulerte og ikke-stimulerte betingelser ble utført i matriser inneholdende enten type I kollagen (2,5 mg /ml) eller både type I kollagen og fibronektin, eller kollagen /fibronektin i nærvær eller fravær av RGD peptidet. 25 felt av celler ble tellet 24 timer etter utsåing ved flere dybder inne i hver matrise som begynner 5 mikrometer under overflaten av matriksen og utvikler seg mot den lengst dybde på 800 um. Den prosent av invaderende celler var to ganger høyere hos stimulerte kulturer sammenlignet med kontroller (
P
0,05) i matriser som inneholder både ECM-proteiner. Lignende resultater ble oppnådd når kontroll peptid GRGES ble lagt til media. Den prosentvise invasjon var omtrent den samme med eller uten stimulering når fibronektin var fraværende. Tilsetning av peptidet GRGDS også resulterte i inhibering av økt invasjon ved mekanisk stimulering. C) En 20-ganger forskjell i frekvens av stimuleringen påvirker ikke prosent av celle invasjon. Den prosent av invaderende celler 24 timer etter stimulering ved magnetiske rotasjonshastigheter på 8, 90 og 160 rpm (0,13, 1,5 og 2,6 Hz). En ubetydelig forskjell ble funnet mellom celler stimulert på 8 og 160 rpm (
P
0,05). Data representerer tre uavhengige eksperimenter, på 25 felt. D) Type I kollagen /fibronektin-matriser inneholdende paramagnetc Kulene ble pre-stimulert i 24 timer. Disse matrisene ble deretter sådd med HT1080-celler og tellet 24 timer etter såing, i løpet av hvilken periode både pre-stimulerte og kontrollplatene ble ikke stimulert (venstre panel). Disse kulturer ble deretter enten videre eller plassert over magneten (høyre panel), data oppnådd 24 timer etter stimulering. Dataene representerer to uavhengige analyser av 15 felt av celler ved et dybdeområde på 800 um. To-tailed analyse ved hjelp av student t-test.
Vi først sådd cellene våre mot matriser består bare av type I kollagen. Ved stimulering vi ikke observere forbedret invasjon (varierer mellom 5 og 10% invasjon i stimulert og ikke-stimulerte kulturer). Men det er ikke bare type I kollagen rikelig i stroma, men kollagen bindende ECM protein fibronektin er også beriket [7], [31]. Således, sammenlignet vi matriser bestående av kollagen alene til de av både kollagen og fibronectin, med og uten stimulering. Under disse betingelser observerte vi en betydelig forskjell i antallet invaderende celler i mekanisk stimulerte versene ikke-stimulerte kulturmiljøer for de invasive celletyper når kollagen /fibronektin-matriser ble anvendt (figur 3B). En to gangers økning i prosentandelen av invaderende celler i den stimulerte (23%) sammenlignet med den ikke-stimulerte matrise (10%) ble gjennomgående observert i disse kulturer (P 0,05). Disse resultatene indikerte at en påført stimulus var i stand til å øke invasjon av kreft celler, men er nødvendig i nærvær av fibronektin til den mekaniske respons. Videre har vi funnet at ikke-invasive MEF-celler mislyktes i å invadere både i nærvær eller fravær av mekanisk stimulering til collagen /fibronektin matriser, noe som tyder på behovet for en celle for å ha en forhåndsdefinert evne for invasjon.
for å bekrefte betydningen av fibronektin for den mekaniske responsen vi hemmet celle-fibronektin interaksjoner med RGD hemmende peptider. Celler ble behandlet med den GRGDS peptid eller et kontroll GRGES peptid etter utsåing bort på kollagen /fibronektin matriser. Den prosentvise invasjon var normalt i nærvær av kontroll GRGES peptid (28% med stimulering og 13% uten stimulering) mens mekanisk stimulert invasjon ble hemmet av RGD peptidet (9% med stimulering og 11,5% uten stimulering, P 0,05). Disse resultatene støtter ikke bare det faktum at fibronektin er nødvendig for mekanisk stimulert invasjon, men foreslår «basal» nivå av -10% invasjon observert i kollagen /fibronektin (ikke-stimulert) og kollagen (stimulerte og ikke-stimulerte) er kulturer fibronektin uavhengig. I tillegg er disse resultatene tyder på at hvilken som helst fibronektin som skilles ut fra HT1080-celler i matriksene (selv om ikke-detekterbar ved western blot, figur S1). Har liten innvirkning på den mekaniske responsen
På grunn av heterogeniteten av celletyper og celle tall innen stroma det var uklart på hvilken frekvens stimulans bør påføres. For å bestemme om frekvensen til vulsten stimulering var en faktor i økt invasjon, vi justert hastigheten av den roterende magnet, som roterer med en hastighet på 8, 90 og 160 rpm eller 0,13, 1,5, og 2,6 Hz, henholdsvis. Prosentandelen av invasjonen var ikke signifikant forskjellig mellom kulturer stimulert på 8 og 160rpm (
P
0,05; Figur 3C). Resultatene viste at en 20-fold spekter av frekvens, økt invasjonen i respons til mekanisk stimulering er upåvirket.
Invasive celler møter fysiske barrierer i bindevevet eller tumor stroma og vil trolig følge stien av minst motstand [32]. I tillegg er de sannsynligvis til å invadere langs stier der matrise forbundet løselige faktorer har blitt gitt ut [19], [33] – [36]. Basert på denne kunnskapen, var det viktig å sikre at ingen av disse faktorene bidro til økt invasjon observert i vår analyse.
En måte som vår matrise kan generere stier minste motstands for celle invasjon ville være gjennom en permanent ombygging skapt av bevegelse av den innebygde kulene. For å teste denne muligheten, vi pre-stimulerte matrisene over roterende magnet i 24 timer før utsåing av cellene. Etter 24 timer med kultur på de pre-stimulert matriser, men utenfor magnetfeltet, vi ikke observere forbedret invasjon (figur 3D, venstre panel). I tillegg ble media av pre-stimulerte matrise ikke endres før utsåing av cellene. Dette eliminerte en mulighet for at løselige faktorer i matrisen ble utgitt av slite av kulene på matrisen, og bidrar til økt invasjon. Imidlertid, når disse samme cellekulturer dyrket på pre-stimulert matrise ble deretter gitt magnetisk stimulering, forsterket invasjon ble igjen observert (figur 3D, høyre panel). Tatt sammen tyder disse resultater på at en hvilken som helst ombygging eller frigivelse av løselige faktorer fra matriksen på grunn av bevegelsen av de magnetiske kuler ikke bidrar til den forbedrede invasjon observerer vi ved mekanisk stimulering.
invasjonen Response er utvidet hvorvidt stimulus er levert fra toppen eller bunnen
dimensjonalitet miljøet er kjent for å påvirke cellulære atferd. Spesielt har HT1080 celler vist seg å endre sin migrasjon fart og utholdenhet i tre dimensjoner [37]. I våre innledende eksperimenter, blir cellene sådd ut på toppen av matrisen, invaderende fra toppen nedover, og dermed begynner i to dimensjoner og beveger seg inn i tre. For å møte påvirkning av dimensionality på mekanisk invasjon vi endret retningen på stimulans så cellene ville invadere oppover. For å gjøre dette, må vi først sådd cellene på kollagen /fibronektin-belagt Dekk før overliggende og polymerisering kollagen /fibronektin /magnetiske kuler løsning over dem (Figur 4A). Det magnetiske feltet ble deretter applisert på toppen av kulturen ved å dreie magneten over den stasjonære kultur (figur 4B). Etter 24 timers stimulering, har vi funnet at cellene invaderte like godt som de hadde da de ble sådd på toppen av matriksene før stimulering (6% invasjon i ikke-stimulerte og 13% i stimulerte kulturer) (figur 4B). Imidlertid fant vi ved 48 timer var forskjellen mellom ikke-stimulert invasjon og stimulert invasjon var enda større, slik at 12% av cellene invaderte i ikke-stimulerte versus 41% invasjon i de stimulerte kulturer. Således, en enda større forbedring av invasjon oppstår i respons på påført mekanisk stimulering når cellene begynte i et tredimensjonalt miljø.
A) HT1080 fibrosarkom celler ble sådd ut på en kollagen /fibronektin belagte dekkglass på bunnen av brønnen. Etter at cellene hadde klebet, en type I kollagen /fibronektin oppløsning inneholdende paramagnetiske mikrokuler ble lagt over cellene og tillates å polymerisere. Kulturer ble enten utsatt for magnetisk stimulering eller dyrket utenfor magnetfeltet. B) Magneten dreies over kulturen som cellene begynner å invadere opp i matriksen. C) HT1080-celler sådd på en kollagen-fibronektin belagte dekkglass og overlagt med et kollagen /fibronektin matrise ble dyrket enten i nærvær eller fravær av et magnetisk felt. Prosent invasjonen ble beregnet 24 og 48 timer etter stimulering fra tre uavhengige forsøk (15 felt ble regnet per kultur).
